Nedregulering av bindevev vekstfaktor hemmer vekst og invasjonen av mage kreftceller og demper peritoneal formidling

Nedregulering av bindevev vekstfaktor hemmer veksten og invasjon av magekreftceller og demper peritoneal formidling
Abstract
Bakgrunn
Bindevev vekstfaktor (CTGF) er blitt vist å være involvert i tumor utvikling og progresjon. Men fortsatt i stor grad ukjent rolle CTGF i magekreft. Search Results
I denne studien, viste vi at CTGF ble sterkt uttrykt i mage kreft vev sammenlignet med matchede normale mage vev. Den CTGF uttrykk i svulstvev ble assosiert med histologisk grad, lymfeknutemetastase og peritoneal formidling (P < 0,05). Pasienter med positiv CTGF uttrykk hadde signifikant lavere kumulativ postoperativ fem års overlevelse enn de med negative CTGF uttrykk (22,9% versus 48,1%, P < 0,001). Vi demonstrerte at knockdown av CTGF ekspresjon signifikant hemmet cellevekst av gastrisk kreft celler og redusert cyklin D 1-ekspresjon. Videre knockdown av CTGF uttrykk også betydelig redusert migrering og invasjon av magekreftceller og reduserte ekspresjonen av matriks-metalloproteinase (MMP) -2 og MMP-9. Dyrestudier viste at nakne mus injisert med CTGF knockdown stabile cellelinjer inneholdt et mindre antall peritoneale pode knuter enn kontrollcellelinjer.
Konklusjoner
Disse dataene tyder på at CTGF spiller en viktig rolle i cellevekst og invasjon i human magekreft, og det ser ut til å være en potensiell prognostisk markør for pasienter med magekreft.
nøkkelord
Bindevev vekstfaktor mage~~POS=TRUNC svulster Celleproliferering Invasivitet Peritoneal formidling Innledning
tross for betydelige fremskritt innen kreftforskning, forblir en kreft verdensomspennende helseproblem og dødelighet på grunn av kreft er fortsatt høy [1]. Magekreft er den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i verden, mens det synes å være en nedadgående trend i forekomst, særlig i vestlige land; det fortsatt er vanlig rapportert i Kina og Japan [2, 3]. Selv om prognosen for pasienter med avansert magekreft synes å ha bedret seg som følge av standardisering av kirurgiske teknikker og de siste fremskritt innen kjemoterapi, forblir 5-årig postoperativ overlevelse lav [4, 5]. Peritoneal metastaser er den vanligste og viktigste årsaken til dødelighet etter kirurgi for magekreft [6, 7]. Imidlertid er mekanismene for peritoneal metastase er ikke klart definert.
Bindevev vekstfaktor (CTGF), også kjent som CCN2, er et medlem av familien CCN, inkludert cysteinrike proteiner 61 (Cyr61), også kjent som CCN1, og nefroblastom-over-uttrykte genet (nov), også kjent som CCN3, samt Wisp-1 /elm1 (CCN4), Wisp-2 /rcop1 (CCN5) og Wisp-3 (CCN6) [8, 9]. CTGF er antatt å være en multifunksjonell modulator signalering er involvert i en rekke biologiske eller patologiske prosesser, slik som angiogenese, osteogenesis, fibrose i nyrene og hud, og tumorutvikling [10-12]. Selv om rollen til CCN2 i normalt vev fibrose har vært godt studert [13], er funksjonen av CCN2 i kreft ikke så godt forstått. Interessant nok CCN2 har blitt identifisert som et onkogen i en rekke forskjellige krefttyper, men er ansett som en tumor-suppressor-gen i andre former for kreft [14]. Overekspresjon av CTGF er funnet i prostatakreft [15], hjernesvulst [16], brystkreft [17], og voksen akutt lymfatisk leukemi [18]. Økt CTGF uttrykk har vært forbundet med utviklingen av livmorhals svulster [19], og esophageal plateepitelkarsinom [20]. Omvendt, i lunge adenokarsinomer [21] og tykktarm kreft [22], overekspresjon av CTGF hemmer invasjon og metastasering av kreft celler både in vitro og in vivo.
Kliniske studier har vist at overekspresjon av CTGF var signifikant korrelert med lymfeknute metastase og dårlig prognose for pasienter med magekreft [23, 24]. Imidlertid er den nøyaktige rollen til CTGF i magekreft fortsatt ukjent. I denne studien, vi har oppdaget CTGF uttrykk i mage kreft vev. Vi fant at CTGF ble overuttrykt i magekreft, og dens uttrykk var assosiert med aggressiv atferd av magekreft. Vi deretter brukt siRNA-teknologi for å knockdown endogen CTGF uttrykk i magekreftceller. Vi viste at nedregulering av CTGF hemmet veksten og invasjonen av magekreft in vitro og svekket peritoneal formidling in vivo. Vår studie understreker sterkt betydningen av CTGF i vekst og invasjon av magekreft, og kan gi en terapeutisk mål i magekreft.
Materialer og metoder
reagenser
Dimetylsulfoksid (DMSO) og trypsin ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, Missouri, USA). DMEM, streptomycin og andre cellekulturer fra utstyret var fra GibcoBRL (Grand Island, NY, USA). Føtalt bovint serum var fra Hyclone (Logan, UT, USA). MTT [3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltrazolium bromid] ble oppnådd fra Fluka (Ronkonkoma, NY, USA). CTGF, cyklin D1, matriks-metalloproteinase (MMP) -2, MMP-3, MMP-9 og GAPDH primært antistoff, så vel som andre antistoff Rhodamin (TRITC) -konjugert affinipure geit-anti-mus IgG ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (i Santa Cruz, CA, USA). CTGF ELISA kit ble kjøpt fra R & D (Minneapolis, Minnesota, USA). Trizol og Lipofectamine 2000 ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). SYBR @ Primescript ™ RT-PCR kit var fra Takara bioteknologi, Japan.
Vevsprøver og immunhistokjemisk farging
vevsprøver ble innhentet fra 110 pasienter med magekreft som gjennomgikk kirurgi ved Institutt for kirurgisk onkologi, First tilknyttet Hospital of China Medical University i perioden 2003-2005. Alle pasientene gjennomgikk gastrctomy, og deres kliniske og patologiske data var tilgjengelige. Normale mage vev ble tatt fra matchet distal resected margin av magekreft prøver. Alle kirurgiske prøver ble undersøkt av erfarne patologer og distal resected margin var tumor-fri. De friske vev ble kuttet i små biter, hurtigfrosset i flytende nitrogen umiddelbart og lagret ved -80 ° C inntil proteinekstraksjon. Studien Protokollen ble gjennomgått og godkjent av etikkomiteen i Kina Medical University.
For immunhistokjemisk farging, 4 mikrometer histologiske snitt ble deparaffinized med xylen og rehydrert gjennom en gradert serie av alkohol. Seksjonene ble deretter kokt i 10 minutter i 0,01 M citratbuffer og endogen peroksidase ble blokkert ved inkubering i 0,3% H 2 O 2 i metanol i 30 min. Ikke-spesifikk binding ble blokkert ved å inkubere lysbilder med normalt geiteserum i 30 minutter ved romtemperatur. Seksjonene ble inkubert over natten ved 4 ° C med 1:50 fortynning av CTGF primært antistoff. Seksjonene ble utsatt for biotin-merket sekundært antistoff i 1 time, til en streptavidin-peroksidase reaksjonssystemet, og deretter fremkalt med DAB- H 2 O 2. Farging ble scoret på følgende skala: 0, ingen farging; 1+, minimal flekker; 2+, moderat til sterk farging i minst 20% av cellene; 3+ = sterk farging i minst 50% av cellene. Saker med 0 eller 1+ farging ble klassifisert som negative, og saker med 2+ eller 3+ farging ble klassifisert som positive.
Cellekultur
menneske mage kreft cellelinjer, MKN-45, MKN-en, AGS, SGC7901, BGC823 og MGC803 ble innhentet fra Institutt for cellebiologi, Kina Medical University, Kina. De ble dyrket i DMEM inneholdende 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO 2. Cellene ble løsnet ved hjelp av 0,25% trypsin og 0,02 mol /l EDTA i PBS for subkultur.
Bygging av CTGF knockdown stabile cellelinjer
To små interfererende RNA (siRNA) oligonukleotider ble syntetisert for å målrette to ulike regioner i CTGF cDNA: GTGCATCCGTACTCCCAAA (PSC1) og GCTAAATTCTGTGGAGTAT (PSC2). De ble klonet inn i siRNA uttrykk vektor pGCsilencer ™ U6.Neo.GFP. Den ikke-spesifikke siRNA ble anvendt som en negativ kontroll (PSNC). SiRNA ekspresjonsplasmidene ble transfektert inn i celler ved anvendelse av Lipofectamine SGC7901 2000. Cellene ble screenet ved hjelp av G418 (800 ug /ml), og koloniene ble plukket ut etter 3 uker, bestemt ved RT-QPCR og Western blot. Celler transfektert med PSC1, PSC2 eller PSNC ble betegnet PSC1 celler, PSC2 celler eller PSNC celler, respektivt.
Real-Time kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-QPCR)
Total RNA ble isolert fra cellepelletene ved hjelp av Trizol reagens. Total RNA (1 ug) ble omdannet til cDNA ved hjelp av en RT (revers transkriptase) reaksjon kit. Real-time PCR ble utført ved hjelp Mx3000P real-time PCR system i henhold til produsentens instruksjoner og SYBR ® Premiks ExTaq som en DNA bestemt fluorescerende fargestoff. PCR ble utført i 40 sykluser på 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 40 sek. Primersekvensene er vist i tabell 1. Terskelen syklus (Ct) ble oppnådd og relative mengder ble bestemt for hver prøve normalisert til GAPDH. Uttrykk for mRNA ble beregnet ved hjelp av ΔΔCt metoden [25] .table en PCR-primer Sekvenser
Gene
Primer Sekvenser (5'-3 ') fremover og bakover <.no> Produkt (bp)

CTGF
CTTGCGAAGCTGACCTGGAA
AAAGCTCAAACTTGATAGGCTTGGA
90
MMP-2
ATGACATCAAGGGCATTCAGGAG
TCTGAGCGATGCCATCAAATACA
135
MMP-3
GGGTGAGGACACCAGCATGA
CAGAGTGTCGGAGTCCAGCTTC
178
MMP-9
TCCCAGACCTGGGCAGATTC
GCAAAGGCGTCGTCAATCAC
124
Cyclin D1
GATGCCAACCTCCTCAACGAC
CTCCTCGCACTTCTGTTCCTC
171
GAPDH
GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
TGGTGAAGACGCCAGTGGA
138
Western blot-analyse
Vev eller celler ble lysert i RIPA-buffer supplert med protease inhibitor blanding i 30 min ved 4 ° C. Cellelysatene ble deretter ultralydbehandlet kort og sentrifugert (14000 g ved 4 ° C) i 15 minutter for å fjerne uoppløselige materialer. Like mengder protein ble separert ved SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran. Membranene ble blokkert med 5% fettfri tørrmelk og deretter inkubert med første antistoff, etterfulgt av pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff. Proteinbånd ble visualisert ved ECL-kjemiluminescens-metoden.
Immunfluorescens og Confocal avbildning
Cellene på Lab-Tek vevskultur kammers objektglass ble fiksert i kald 100% metanol i 10 minutter, og deretter blokkert med normalt geiteserum i 30 min . Cellene ble inkubert med det primære antistoff over natten ved 4 ° C, vasket 3 ganger i PBT (PBS med 1 ‰ Triton X-100), og deretter inkubert med andre antistoff konjugert med rhodamin. DNA fargestoff DAPI ble brukt til å farge DNA. Celler ble fotografert på en Leica SP2AOBS konfokal mikroskop.
Kondisjonert medium (CM) innsamling og Enzyme-linked immunoassay (ELISA)
3 × 10 5 celler ble sådd i 100 mm vev kultur tallerken med DMEM inneholder 10 % føtalt bovint serum i 2 dager. Deretter ble cellene vasket to ganger med PBS og inkubert med 5 ml serumfritt DMEM. 48 timer senere ble kondisjonert medium oppsamlet og sentrifugert ved 2000 g i 5 min, ført gjennom filtre (porestørrelse, 0,45 um) og lagret ved -80 ° C inntil bruk.
Nivåene av CTGF i det kondisjonerte medium fra mage kreft cellelinjer ble målt ved hjelp av menneskelig Quantikine ELISA kit å følge produsentens instruksjoner.
MTT spredning analysen
evnen til celleproliferasjon ble vurdert ved hjelp av MTT [3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2 , 5-diphenyltrazolium bromid] assay. Omtrent 5 x 10 3-celler ble sådd på 96-brønners kulturplater og dyrkes i serumfritt DMEM i 24, 48, 72 og 96 timer henholdsvis. Deretter ble cellene inkubert med 20 ul MTT (10 mg /ml) i 4 timer ved 37 ° Cand 200 ul DMSO ble pipettert for å oppløseliggjøre formazanprodukt i 20 minutter ved romtemperatur. Den optiske tetthet (OD) ble bestemt ved anvendelse av et spektrofotometer (Bio-Rad) ved en bølgelengde på 570 nm
. Kolonidannelse assay
5 x 10 2-celler suspendert i 2 ml av 0,3% agarose DMEM-medium inneholdende 10% føtalt bovint serum ble sådd ut i 6-brønns plater på toppen av eksisterende 0,6% agarose bunn med det samme medium. Platene ble inkubert ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator. Etter tre uker, cellekolonier > 0,1 mm i diameter ble talt under en mikroskopisk felt.
Cell invasjon analysen
invasjonen ble bestemt av en invasjon kammer analysen. Celler (2 x 10 4) ble sådd ut på den øverste kammer i en 24-brønners matrigel-belagte mikroporøst membranfilter med 8 um porer og den nederste kammeret ble fylt med 0,5 ml DMEM med 10% føtalt bovint serum som en kjemotiltrekkende. Etter inkubasjon i 24 timer, ble ikke-invaderende celler (øvre kammer) forsiktig fjernes med en bomullspinne og invadere celler (nedre kammer) ble løst ved hjelp av metanol og farget med trypanblått. Den invasive egenskaper ble bestemt ved antall penetrerende cellene under et mikroskop ved 200 x forstørrelse i 10 tilfeldig felt i hver brønn.
Kammeret migrering analyse
fremgangsmåte for in vitro-migrasjon analysen ble ved hjelp av en ikke-matrigel-belagte 24-brønners Boyden kammer (8 um, Millipore). Celler (2 x 10 4) ble sådd ut på innsatsene suspendert i 0,2 ml serumfritt DMEM-medium. Ikke-migrerende celler ble fjernet fra det øvre kammer av filteret etter inkubering i 24 timer. Migrerte celler ble farget og kvantifisert basert på prosedyren som beskrevet tidligere. Triplikate bestemmelser ble utført for hver gruppe av celler i migrerings invasjon og analyser, og resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD.
Gelatin zymografi
MMP-2 og MMP-9 aktivitet ble bestemt ved gelatin zymografi som beskrevet tidligere [ ,,,0],26]. I korte trekk, etter sentrifugering ble supernatanten separert og proteinkonsentrasjonen bestemmes; like mengder protein, er lagt til av prøvebuffer (Tris-HCl 1 M, pH 6,8, natriumdodecylsulfat (SDS) 2%, glycerol 10%) ble påført på 7,5% SDS-polyakrylamid-gel inneholdende 1 mg /ml gelatin. Etter elektroforese ble SDS fjernet fra gelen ved vasking to ganger med 2,5% TritonX-100 i 1 time. Etter en kort skylling, ble gelen inkubert ved 37 ° C i 18 timer i buffer, pH 7,6, inneholdende 100 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl 2, 20 mM NaCl. Gelen ble farget with1% Coomassie Brilliant Blue R250 i 2 timer og deretter behandlet med avfarging oppløsning (40% metanol, 10% eddiksyre, 50% destillert vann). Proteolytisk aktivitet ble registrert som klare bånd på bakgrunn flekken av ufordøyd substrat i gel.
Animal studie av peritoneal implantasjon
Dette eksperimentet ble gjennomført i samsvar med retningslinjene gitt av Statens Food and Drug Administration (Drug Administration of China ). Dyrene ble huset og tatt vare på i samsvar med de retningslinjer som er fastsatt av National Science Council of Republic Kina Kvinne BALB /c nakne mus.
, 35-40 dager gammel og veier 20-22 g, ble levert av Shanghai SLAC Laboratory Animal Limited Company. Musene ble holdt under sterile betingelser og matet en sterilisert mus diett og vann. Dyrene ble bedøvet via innånding av isoflurance. PSC1, PSC2, PSNC og SGC7901-celler (1 x 10 7 celler) ble suspendert i 0,5 ml DMEM og inokulert inn i bukhulen av testmusene. Musene ble avlivet seks uker senere, og noen spredte knuter stede på mesenteriet og membranen ble evaluert.
Statistisk analyse
Alle verdier i teksten og tallene er presentert som gjennomsnitt ± SD. Totalt overlevelse ble bestemt med Kaplan-Meier estimatoren, en hendelse som blir definert som død for kreft korrelert sak. Log-rank-test ble anvendt for å identifisere forskjeller mellom overlevelseskurver for ulike pasientgruppene. I univariat analyse, 2-tailed χ 2 tester for kategoriske variabler og to-tailed t-test for kontinuerlige variabler ble brukt for statistiske sammenligninger. Verdier av p
< 0,05 ble tatt for å vise en signifikant forskjell mellom midler.
Resultater
CTGF er overuttrykt i mage kreft og korrelert med clinicopathological funksjoner i magekreft pasienter
Vi bestemt CTGF uttrykk i mage kreft vev og matchet distal normalt vev . Figur 1A illustrert CTGF uttrykk i fem tilfeldig plukket pasienter. Forhøyede nivåer av CTGF protein ble funnet i humane magecancer vev sammenlignet med de sammenkoblede normale vev fra pasienten. Dette ble også bekreftet ved immunhistokjemisk farging (figur 1B). Videre, for ytterligere å undersøke korrelasjonen mellom ekspresjonen av CTGF og clinicopathological egenskaper, ble 110 prøvene anvendt for undersøkelse med immunhistokjemisk farging. Statistisk analyse viste positiv CTGF ekspresjon var signifikant assosiert med histologisk karakter, lymfeknutemetastase og peritoneal spredning sammenlignet med pasienter med negativ CTGF ekspresjon (tabell 2). Positiv CTGF uttrykk ble oftere påvist i tilfeller av lymfeknuter metastaser (P = 0,012). Nivåer av CTGF uttrykk ble økt betydelig i udifferensierte mage kreft sammenlignet med differensierte mage kreft (P = 0,039). Og uttrykk for CTGF protein var signifikant korrelert med utviklingen av peritoneal formidling av magekreft (P = 0,011). Beregning av overlevelses varigheten av de 110 involverte pasientene ved Kaplan-Meier-metoden viste at pasientene som kjennetegnet CTGF-positive svulster viste en kortere overlevelse sammenlignet med de pasientene som led av CTGF-negative tumorer (figur 1C, P < 0,001 ). Figur 1 Overuttrykte CTGF i magekreft med dårligere prognose. A. Western blot analyse viste at CTGF ekspresjon i magekreft vev og passet distale normale vev fra fem tilfeldig utvalgte mage kreftpasienter. B. immunhistokjemi resultatene av CTGF uttrykk i sammenkoblede mage kreft vevsprøver. C. Kaplen-Meir overlevelseskurver for 110 pasienter med magekreft, gruppert etter CTGF uttrykk.
Tabell 2 Sammenhengen mellom CTGF uttrykk og clinicopathologic karakteristikker av pasienter med magekreft (n = 110)

CTGF uttrykk


Negativ
Positiv
P-verdi <.no> Kjønn
Mann fra 33
34
0,779
Kvinne
20
23
Alder (år)
≤ 65
35
40
0,642
> 65
18
17
Tumor størrelse (cm)
< 5
26
25
0,585
≥ 5
27
32
Tumor plassering
Nedre
42
37
0,413
midt
5
8
Øvre
3
6
Hele
3
6
Histologisk klasse
Differensiert
26
17
0,039 *
Undifferentiated
27
40
Lauren klasse
Tarm
28
21
0,108
Diffuse
25
36
lymfeknutemetastase
Negativ
23
12
0,012 *
Positive
30
45
TNM stadium
jeg
11
8
0.080
II
15
9
III
20
22
IV
7
18
levermetastaser
negativ
50
55
0,588
Positive
3
2
Peritoneal formidling
negativ
50
44
0,011 *
positive
3
13 product: * P < 0,05; CTGF, bindevev vekstfaktor.
Uttrykk av CTGF i humane mage kreft cellelinjer og siRNA-mediert stillhet
Først undersøkte vi CTGF uttrykk i seks magekreft cellelinjer (MKN-45, MKN-en, AGS, SGC7901, BGC823 og MGC803) av Western blot. CTGF ble påvist i alle cellelinjer evaluert, og med SGC7901 celler som uttrykker det høyeste nivået (figur 2A). Derfor ble SGC7901 celler valgt som modell for de påfølgende funksjonsstudier. Fordi biologisk aktiv CTGF er både utskilt og uttrykt i cytoplasma [8, 27], vi også målt nivå av utskilt CTGF i det kondisjonerte medium av følgende magecancercellelinjer ved hjelp av ELISA, som ble sammenfalt med nivået av CTGF i cytoplasma av hver cellelinje (figur 2B). Figur 2 Uttrykk for CTGF i magekreft cellelinjer og knockdown av CTGF av siRNA. A. Western blot viser uttrykk for CTGF i 6 mage kreft cellelinjer. GAPDH tjente som protein lasting kontroll. B. CTGF i kondisjonert medium av 6 gastrisk kreft-cellelinjer og stabilt transfekterte celler ble analysert ved hjelp av ELISA. Resultatene er uttrykt som pg /ml /1 x 106cells (gjennomsnitt ± SD, n = 4). C. Western blot analyse av CTGF protein uttrykk i SGC7901, PSNC og CTGF knockdown stabile cellelinjer (PSC1 og PSC2). D. Immunofluorescensanalyse av CTGF uttrykk. E. RT-QPCR viser CTGF mRNA nivåer i SGC7901, PSNC og CTGF knockdown stabile cellelinjer (PSC1 og PSC2). Data er uttrykt som et gangers forandring i forhold til kontroll (kontroll er SGC7901). Verdiene er gitt som middelverdi ± SD fra tre eksperimenter. * P < 0,05 sammenlignet med kontroll.
For å studere funksjonen til CTGF i SGC7901 celler, CTGF knockdown stabile cellelinjer ble brukt for å analysere stanse virkning. Som vist i figur 2B, ble nivået av utskilt CTGF i det kondisjonerte medium signifikant redusert i de siRNA-stabilt transfekterte celler sammenlignet med kontrollen. Western blot og immunofluorescens farging viste at ekspresjon av CTGF proteinet i cytoplasma avtatt betydelig i CTGF knockdown stabile cellelinjer (figur 2C, D). Videre er ekspresjon av CTGF mRNA ble også signifikant redusert i CTGF knockdown stabile cellelinjer (figur 2E).
Knockdown av CTGF uttrykk hemmer veksten av magekreftceller
kolonidannelse analyse ble anvendt for å vurdere veksten av cellene hvor CTGF ble stille. Som vist i figur 3A, CTGF knockdown stabile celler (PSC1 og PSC2) dannet signifikant færre kolonier på bløt agar i forhold til SGC7901 og PSNC celler (83 ± 10, 90 ± 15 mot 30 ± 7 og 20 ± 5, henholdsvis). For ytterligere å teste den negative effekten av CTGF knockdown på magekreft cellevekst, ble MTT-analyse utført og vekstkurver ble generert (figur 3B). Som det fremgår av kurvene, både PSC1 og PSC2 celler proliferert langsommere enn PSNC celler og SGC7901 celler i løpet av første 96 timer etter at cellene ble sådd ut. Den dramatiske reduksjon av kolonidannelse og vekst av CTGF dempede celler antydet CTGF undertrykkelse kan ha negativ regulere magekreft cellevekst. RT-QPCR viste at mRNA nivåer av cellesyklus relatert protein cyclin D1 ble nedregulert i de to CTGF knockdown stabile cellelinjer sammenlignet med PSNC og SGC7901 (figur 3C). I samsvar med dette resultatet, observerte vi en markert reduksjon av cyclin D1 protein uttrykk i CTGF knockdown celler PSC1 og PSC2 (figur 3D). Interessant, behandling med kondisjonert medium av SGC7901 som utskilles en stor mengde CTGF var i stand til å redde cyklin D1 nedregulering og gjenopprette celleformering i CTGF knockdown stabile celler. Disse data indikerte at CTGF undertrykkelse kanskje negativt regulere magekreft cellevekst og redusere cyclin D1 uttrykk. Figur 3 knockdown av CTGF uttrykk hemmer veksten av magekreftceller. A. Colony formasjon analysen. B. MTT spredning analysen. C. knockdown av CTGF nedregulert mRNA-nivået av cyclin D1. D. knockdown av CTGF nedregulert proteinnivået av cyclin D1. PSC1 /PSC2 + CM av SGC7901: PSC1 eller PSC2 celler ble inkubert med kondisjonert medium (CM) av SGC7901. Alle resultatene var reproduserbare i tre uavhengige forsøk. * P < 0,05 sammenlignet med kontroll (kontroll er SGC7901).
Knockdown av CTGF uttrykk hemmer migrasjon og invasjon av magekreftceller
Cell migrasjon og invasjon er kritiske prosesser i tumormetastaser. Vi undersøkte cellemigrasjon av ikke-matrigel belagt Boyden kammer og celle invasjon av Matrigel-belagte invasjon kammer analyser, henholdsvis. I migrasjonsanalyser (figur 4A), ble migrasjon priser av PSC1 og PSC2 celler betydelig redusert sammenlignet med kontroll (P < 0,05). Som vist i figur 4B, CTGF knockdown også betydelig redusert celleinvasjons egenskaper sammenlignet med kontroll. Cell invasjon priser av PSC1 og PSC2 celler ble redusert med 61,4% og 55,8%, henholdsvis. RT-QPCR og Western blot viste at MMP-2 og MMP-9 ble nedregulert i de to stabile kloner, sammenlignet med kontrollceller (figur 4C, D). I motsetning til dette ble MMP-3 ikke i betydelig grad endre både på mRNA og proteinnivå. Videre zymografi analyse viste aktivitetene til både MMP-2 og MMP-9 i siRNA-stabilt transfekterte celler var signifikant lavere enn de i kontrollcellene (figur 4E). Interessant, behandling med kondisjonert medium av SGC7901 som utskilles en stor mengde av CTGF indusert re-ekspresjon av MMP-2 og MMP-9 og gjenopprettet migrering og invasjon av CTGF knockdown stabile celler. Disse resultatene antydet at knockdown av CTGF uttrykk redusert migrering og invasjon av gastrisk kreft celler og redusert ekspresjon av MMP-2 og MMP-9. Figur 4 knockdown av CTGF uttrykk hemmer migrasjon og invasjon av mage kreftceller. A. Cell migrasjon analysen. B. Cell invasjon analysen. Migrasjon og invasjons cellene fiksert og farget, og representative feltene ble fotografert. For kvantifisering ble cellene tellet i 10 tilfeldig felt under et lysmikroskop (x 200). Triplikate bestemmelser ble utført for hver gruppe av celler i migrerings invasjon og analyser, og resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. C. RT-QPCR ble gjort for analyse av mRNA-ekspresjon av MMP-2, MMP-3 og MMP-9 i CTGF knockdown stabile cellelinjer og kontrollceller. Stolper representerer middelverdien ± SD for tre eksperimenter. D. Protein nivåene av MMP-2, MMP-3 og MMP-9 ble påvist ved Western blot. GAPDH tjente som protein lasting kontroll. E. Gelatin zymografi analyse for aktivitetene til MMP-2 og MMP-9. PSC1 /PSC2 + CM av SGC7901: PSC1 eller PSC2 celler ble inkubert med kondisjonert medium (CM) av SGC7901 * P <. 0,05 sammenlignet med kontroll (kontroll er SGC7901).
Nedregulering av CTGF hemmer peritoneal formidling av magekreft in vivo
å utforske effekten av CTGF på peritoneal formidling av magekreftceller in vivo, vaksinert vi ulike celler inn nakne mus. SGC7901 celler, kontroll stabil cellelinje (PSNC), og CTGF knockdown stabile celler (PSC1 og PSC2) ble injisert inn i fire separate grupper av nakne mus. Som konsekvens av en slik behandling, den målbare undertrykkelse av peritoneal spredning i mus injisert med CTGF knockdown stabile celler sammenlignet med de som er injisert med SGC7901 celler eller PSNC-celler ble observert (figur 5A). Kvantitativt, ble 117 ± 20 spres knuter kjent for test mus inokulert med SGC7901 celler og 137 ± 26 spres knuter ble kjent for mus inokulert med PSNC celler. I motsetning til dette vesentlige færre disseminerte knuter var i stand til å bli observert for mus injisert med CTGF knockdown stabile celler (Figur 5B). Figur 5 knockdown av CTGF hemmer magekreft SGC7901 xenograft peritoneal formidling. SGC7901, PSNC og CTGF knockdown stabile cellelinjer (PSC1 og PSC2) ble injisert intraperitonealt som beskrevet under "Materiale og metode". 6 uker senere ble musene avlivet, fotografert, dissekert og eventuelle disseminert knuter er tilstede på mesenteriet og membranen ble tellet. A. Bildet av hårløse mus med peritoneal formidling fra hver gruppe. B. spres knuter ble evaluert. Hver søyle representerer middelverdi ± SD (n = 5 i hver gruppe). * P < 0,05 sammenlignet med kontroll (kontroll er SGC7901).
Diskusjon
mest omfattende litteraturen oppdatert om CTGF definerer sin rolle i sårhelende og fibrotisk sykdom. Nylig har flere studier implisere CTGF i tumorutvikling og tumor celle overlevelse [28-30]. Likevel er den eksakte rolle CTGF i tumorprogresjon ikke klart, og funksjonen til CTGF i tumor cellebiologi av magekreft har ikke blitt grundig undersøkt. For å løse disse problemene, evaluert vi CTGF uttrykk med hensyn til mulige direkte sammenhenger med cellevekst og invasjonen av mage kreftceller. Videre har vi videre undersøkte effekten av CTGF på peritoneal formidling av magekreftceller in vivo.
I denne studien våre resultater viste at CTGF er sterkt uttrykt i magekreft vev sammenlignet med matchede normale gastrisk vev. Ekspresjonen av CTGF i udifferensiert magekreft var signifikant høyere enn de i differensiert magekreft. Den CTGF uttrykk i svulstvev ble assosiert med lymfeknutemetastase og peritoneal formidling. Videre pasienter med positiv CTGF uttrykk hadde signifikant lavere kumulativ postoperativ fem års overlevelse (22,9%) enn de med negative CTGF uttrykk (48,1%, figur 1C). Disse resultatene antydet at CTGF kan være involvert i progresjon og metastasering av magekreft. Videre CTGF kan være en nyttig prognostisk markør.
Flere nyere studier har avdekket at CTGF regulere cellevekst i esophageal kreftceller og kreft i bukspyttkjertelen celler [20, 30]. Men lite er kjent om effekten av CTGF uttrykk på cellevekst av mage kreftceller. Våre resultater viste at CTGF undertrykkelse resulterte i inhibering av celleproliferasjon og klonogene vekst. Endringer i cellevekst kan være viktige faktorer i å regulere kreft progresjon [31].

• Høyere antall Helicobacter pylori CagA Epiya C fosforyleringsseter øker risikoen for magekreft, men ikke duodenal ulcer
• DNA kopi nummer profiler av magekreft forløper lesions