Regulación a la baja del factor de crecimiento de tejido conjuntivo inhibe el crecimiento y la invasión de células de cáncer gástrico y atenúa peritoneal regulación a la baja dissemination

de factor de crecimiento de tejido conectivo inhibe el crecimiento y la invasión de células de cáncer gástrico y atenúa diseminación peritoneal
Abstract
Antecedentes
conectivo factor de crecimiento de tejido (CTGF) ha demostrado estar implicado en el desarrollo y progresión del tumor. Sin embargo, el papel de CTGF en el cáncer gástrico sigue siendo desconocida.
Resultados
En este estudio, hemos demostrado que CTGF fue altamente expresado en tejidos de cáncer gástrico en comparación con los tejidos normales emparejados gástricos. La expresión de CTGF en el tejido tumoral se asoció con el grado histológico, la metástasis de los ganglios linfáticos y la difusión peritoneal (P < 0,05). Los pacientes con expresión CTGF positivos tenían significativamente menor postoperatorio acumulativo tasa de supervivencia 5 años que aquellos con expresión negativa CTGF (22,9% frente a 48,1%, P < 0,001). Hemos demostrado que desmontables de expresión de CTGF crecimiento celular significativamente inhibido de células de cáncer gástrico y la disminución de ciclina D 1 de expresión. Por otra parte, desmontables de expresión CTGF también redujo notablemente la migración y la invasión de células de cáncer gástrico y la disminución de la expresión de metaloproteinasas de matriz (MMP) -2 y MMP-9. Los estudios en animales revelaron que los ratones nude inyectado con el CTGF knockdown líneas celulares estables contó con un menor número de nódulos siembra peritoneal que las líneas celulares de control.
Conclusiones
Estos datos sugieren que CTGF desempeña un papel importante en el crecimiento celular y la invasión en cáncer gástrico humano y que parece ser un marcador pronóstico potencial para los pacientes con cáncer gástrico.
Palabras clave
crecimiento de tejido conjuntivo proliferación neoplasmas de estómago factor de invasividad celular peritoneal difusión Introducción
pesar de los avances significativos en la investigación del cáncer, el cáncer sigue siendo una problema de salud mundial y la mortalidad por cáncer sigue siendo alta [1]. El cáncer gástrico es la segunda causa principal de muerte por cáncer en el mundo, mientras que parece que hay una tendencia a la disminución en la ocurrencia, en particular en los países occidentales; todavía se ha divulgado en China y Japón [2, 3]. A pesar de que el pronóstico de pacientes con cáncer gástrico avanzado parece haber mejorado como resultado de la estandarización de las técnicas quirúrgicas y los recientes avances en la quimioterapia, la tasa de supervivencia postoperatoria 5-años sigue siendo baja [4, 5]. metástasis peritoneal es la causa más común e importante de la mortalidad después de la cirugía para el cáncer gástrico [6, 7]. Sin embargo, los mecanismos de la metástasis peritoneal no se han definido claramente.
Factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF), también conocido como CCN2, es un miembro de la familia CCN, incluyendo la proteína rica en cisteína 61 (Cyr61), también conocido como CCN1, y nefroblastoma-over gen expresado (Nov), también conocido como CCN3, así como Wisp-1 /elm1 (CCN4), Wisp-2 /rcop1 (CCN5) y Wisp-3 (CCN6) [8, 9]. CTGF se cree que es un modulador de la señalización de múltiples funciones que participan en una amplia variedad de procesos biológicos o patológicos, tales como la angiogénesis, la osteogénesis, fibrosis en los riñones y la piel, y el desarrollo de tumores [10-12]. Aunque el papel de CCN2 en la fibrosis del tejido normal ha sido bien estudiado [13], la función de CCN2 en el cáncer no se entiende tan bien. Curiosamente, CCN2 se ha identificado como un oncogén en una variedad de tipos de cáncer pero se considera un gen supresor de tumores en otras formas de cáncer [14]. La sobreexpresión de CTGF se encuentra en el cáncer de próstata [15], gliomas [16], cáncer de mama [17], y el adulto leucemia linfoblástica aguda [18]. El aumento de expresión de CTGF se ha asociado con la progresión de los tumores cervicales [19], y el carcinoma de células escamosas de esófago [20]. Por el contrario, en adenocarcinomas de pulmón [21] y los cánceres de colon [22], la sobreexpresión de CTGF inhibe la invasión y la metástasis de las células cancerosas tanto in vitro como in vivo.
Estudios clínicos han demostrado que la sobreexpresión de CTGF se correlacionó significativamente con los ganglios linfáticos metástasis y mal pronóstico en pacientes con cáncer gástrico [23, 24]. Sin embargo, el papel preciso de CTGF en el cáncer gástrico es todavía desconocida. En este estudio, se detectó la expresión de CTGF en tejidos de cáncer gástrico. Se encontró que CTGF se sobreexpresa en el cáncer gástrico, y su expresión se asocia con comportamiento agresivo del cáncer gástrico. A continuación, utiliza la tecnología siRNA desmontables expresión de CTGF endógeno en células de cáncer gástrico. Hemos demostrado que la regulación a la baja de CTGF inhibió el crecimiento y la invasión del cáncer gástrico in vitro y atenuada diseminación peritoneal in vivo. Nuestro estudio destaca fuertemente la importancia de CTGF en el crecimiento y la invasión del cáncer gástrico, y puede proporcionar una diana terapéutica en cáncer gástrico.
Materiales y métodos Reactivos

dimetil sulfóxido (DMSO) y tripsina fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). DMEM, estreptomicina y otros suministros de cultivo de células eran de GIBCOBRL (Grand Island, NY, EE.UU.). El suero bovino fetal era de Hyclone (Logan, UT, EE.UU.). MTT [3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, bromuro de 5-diphenyltrazolium] se obtuvo de Fluka (Ronkonkoma, NY, EE.UU.). CTGF, ciclina D1, metaloproteinasa de matriz (MMP) -2, MMP-3, MMP-9 y el anticuerpo primario GAPDH, así como segundo anticuerpo rodamina (TRITC) conjugado con AffiniPure de cabra anti-IgG de ratón se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.). CTGF kit ELISA fue adquirido de R & D (Minneapolis, MN, EE.UU.). Trizol y Lipofectamine 2000 se compraron de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). kit SYBR @ Primescript ™ RT-PCR fue de Takara Biotecnología, Japón. Las muestras de tejido
y tinción inmunohistoquímica
Tumor especímenes fueron obtenidos de 110 pacientes con cáncer gástrico que se sometieron a cirugía en el Departamento de Oncología Quirúrgica, Primera afiliado del hospital de la Universidad de Medicina china durante el período 2003-2005. Todos los pacientes fueron sometidos a gastrctomy, y estaban disponibles los datos clínicos y patológicos. tejidos normales del estómago se tomaron desde el margen distal resecado emparejado de las muestras de cáncer gástrico. Todos los especímenes quirúrgicos fueron examinados por patólogos experimentados y el margen de resección distal era libre de tumor. Los tejidos frescos se cortaron en trozos pequeños, se congelaron en nitrógeno líquido inmediatamente, y se almacenaron a -80 ° C hasta la extracción de proteínas. El protocolo de estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Medicina China.
Para la tinción inmunohistoquímica, 4 micras secciones histológicas se deparaffinized con xileno y rehidratada a través de una serie graduada de alcohol. Las secciones fueron hervidas durante 10 min en tampón de citrato 0,01 M y la peroxidasa endógena fue bloqueada por incubación en 0,3% H 2 O 2 en metanol durante 30 min. La unión no específica fue bloqueada por incubación de diapositivas con suero normal de cabra durante 30 min a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 ° C con una dilución 1:50 de CTGF anticuerpo primario. Las secciones fueron expuestas a anticuerpo secundario marcado con biotina durante 1 h, a un sistema de reacción de estreptavidina-peroxidasa, y después desarrollaron con DAB- H 2 O 2. La tinción se anotó en la siguiente escala: 0, sin manchas; 1+, una mínima tinción; 2+, moderada a fuerte tinción en al menos 20% de las células; 3+, fuerte tinción en al menos 50% de las células. Los casos con 0 ó 1 + tinción fueron clasificados como negativos, y los casos con 2+ o 3+ tinción se clasificaron como positivos. Cell Culture
líneas celulares de cáncer gástrico humano MKN-45,, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 y MGC803 se obtuvieron del Departamento de Biología celular de la Universidad médica de china, china. Se cultivaron en DMEM que contenía 10% de suero fetal bovino, 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2. Las células se desalojaron utilizando tripsina al 0,25% y 0,02 mol /l de EDTA en PBS para el subcultivo.
Construcción de CTGF desmontables líneas celulares
Dos pequeñas de ARN (siRNA) oligonucleótidos de interferencia estables se sintetizaron para apuntar dos regiones diferentes en el CTGF cDNA: GTGCATCCGTACTCCCAAA (PSC1) y GCTAAATTCTGTGGAGTAT (PSC2). Ellos fueron clonados en el vector de expresión de siRNA pGCsilencer ™ U6.Neo.GFP. El siRNA no específica se utilizó como control negativo (PSNC). Los plásmidos de expresión de siRNA fueron transfectadas en células usando Lipofectamina SGC7901 2000. Las células se seleccionaron con G418 (800 ug /ml), y nos recogieron las colonias después de 3 semanas, determinados por RT-qPCR y Western blot. Las células transfectadas con PSC1, PSC2 o PSNC se designaron las células PSC1, células o células PSC2 PSNC, respectivamente.
En tiempo real cuantitativa de la polimerasa reacción en cadena (RT-qPCR)
RNA total se aisló de los sedimentos celulares usando el reactivo Trizol. El ARN total (1 ug) se convirtió en cDNA usando una RT (transcriptasa inversa) kit de reacción. PCR en tiempo real se realizó utilizando el sistema de PCR en tiempo real Mx3000P de acuerdo con las instrucciones del fabricante y SYBR ® Premix ExTaq como un colorante fluorescente específico de ADN. PCR se llevó a cabo durante 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 40 s. Primer secuencias se muestran en la tabla 1. Se obtuvo el ciclo umbral (Ct) y cantidades relativas se determinaron para cada muestra se normalizó a GAPDH. Las expresiones de ARNm se calcularon utilizando el método ΔΔCt [25] .Tabla 1 PCR Primer secuencias
Gene
Secuencias de los Cebadores (5'-3 ') de avance y retroceso
Producto (bp)

CTGF
CTTGCGAAGCTGACCTGGAA
AAAGCTCAAACTTGATAGGCTTGGA
90
MMP-2
ATGACATCAAGGGCATTCAGGAG
TCTGAGCGATGCCATCAAATACA
135
MMP-3
GGGTGAGGACACCAGCATGA
CAGAGTGTCGGAGTCCAGCTTC
178
MMP-9
TCCCAGACCTGGGCAGATTC
GCAAAGGCGTCGTCAATCAC
124
Cyclin D1
GATGCCAACCTCCTCAACGAC
CTCCTCGCACTTCTGTTCCTC
171
GAPDH
GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
TGGTGAAGACGCCAGTGGA
138
El análisis de transferencia Western
tejidos o células se lisaron en tampón RIPA suplementado con mezcla de inhibidor de proteasa durante 30 minutos a 4 ° C. Los lisados ​​celulares se sometieron a ultrasonidos brevemente y se centrifugó (14.000 g a 4 ° C) durante 15 min para eliminar los materiales insolubles. Cantidades iguales de proteína fueron separadas por SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF. Las membranas se bloquearon con leche en polvo desnatada al 5% y después se incubaron con anticuerpo primero, seguido de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante. Las bandas de proteína se visualizaron por quimioluminiscencia ECL método.
inmunofluorescencia y confocal de formación de imágenes
Las células en Lab-Tek cultivo de tejidos de la cámara de diapositivas fueron fijadas en metanol frío 100% durante 10 min, y luego se bloquearon con suero normal de cabra durante 30 min . Las células se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C, se lavaron 3 veces en PBT (PBS con 1 ‰ Triton X-100), y luego incubadas con segundo anticuerpo conjugado con rodamina. El DAPI tinte de ADN se usó para teñir el ADN. Las células fueron imágenes en un microscopio confocal Leica SP2AOBS.
Medio acondicionado (CM) de recogida y de inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) página 3 × 10 5 células fueron sembradas en 100 mm placa de cultivo de tejidos con DMEM que contiene 10 % de suero bovino fetal durante 2 días. Luego, las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con 5 ml de DMEM libre de suero. 48 h más tarde, se recogió el medio acondicionado y se centrifugó a 2000 g durante 5 min, pasado a través de filtros (tamaño de poro, 0,45 um) y almacenados a -80 ° C hasta su uso.
Los niveles de CTGF en el medio acondicionado a partir de líneas celulares de cáncer gástrico se midieron usando kit Quantikine ELISA humana siguiendo las instrucciones del fabricante. ensayo de proliferación de MTT

la capacidad de la proliferación celular se evaluó mediante MTT [3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2 , bromuro de 5-diphenyltrazolium] ensayo. Aproximadamente 5 × 10 3 células fueron sembradas en placas de cultivo de 96 pocillos y se cultivaron en DMEM libre de suero durante 24, 48, 72, y 96 h, respectivamente. Luego, las células se incubaron con 20 l de MTT (10 mg /ml) durante 4 horas a 37 ° Cand DMSO 200 l se pipeteó para solubilizar el producto de formazán durante 20 min a temperatura ambiente. La densidad óptica (OD) se determinó utilizando un espectrofotómetro (Bio-Rad) a una longitud de onda de 570 nm.
Ensayo de formación de colonias
5 × 10 2 células en suspensión en 2 ml de 0,3% de agarosa medio DMEM que contenía suero bovino fetal al 10% se sembraron en placas de 6 pocillos en la parte superior de la existente 0,6% inferior de agarosa con el mismo medio. Las placas se incubaron a 37 ° C en un 5% CO 2 incubadora. Después de tres semanas, las colonias de células > 0.1 mm de diámetro fueron contados bajo un campo microscópico.
Ensayo de invasión de la célula
La invasión se determinó mediante un ensayo de cámara de invasión. Las células (2 × 10 4) se sembraron en la cámara superior de un filtro de membrana de microporos matrigel recubierto de 24 pocillos con 8 micras poros y la cámara inferior se llenó con 0,5 ml de DMEM con suero bovino fetal al 10% como una quimioatrayente. Después de incubar durante 24 h, las células no invasor (cámara superior) se retiraron con cuidado utilizando un hisopo de algodón y las células invasoras (cámara baja) fueron fijadas mediante metanol y teñidos con azul de tripano. La capacidad invasiva se determinó por el número de células que penetran bajo un microscopio a 200 aumentos, por 10 campos al azar en cada pocillo ensayo de migración de Cámara.
El método de ensayo de migración in vitro fue el uso de un no-matrigel recubierto 24 pocillos cámara de Boyden (8 m, Millipore). Las células (2 × 10 4) se sembraron en los insertos en suspensión en 0,2 ml de medio DMEM libre de suero. Las células no migran se retiran de la cámara superior del filtro después de la incubación durante 24 h. Las células migradas se tiñeron y cuantificadas según el procedimiento descrito anteriormente. ensayos por triplicado se realizaron para cada grupo de células en ensayos de invasión y migración, y los resultados se expresan como medias ± SD.
gelatina zimografía
MMP-2 y la actividad de MMP-9 se determinó por zimografía de gelatina como se describe anteriormente [ ,,,0],26]. En resumen, después de la centrifugación el sobrenadante se separó y se determinó la concentración de proteínas; cantidades iguales de proteína, añadido por tampón de muestra (Tris-HCl 1 M, pH 6,8, dodecil sulfato de sodio (SDS) 2%, glicerol 10%) se aplicaron a 7,5% de gel de SDS-poliacrilamida que contiene 1 mg /ml de gelatina. Después de la electroforesis, SDS se eliminó del gel por lavado dos veces con 2,5% Triton X-100 durante 1 h. Después de un breve enjuague, el gel se incubó a 37 ° C durante 18 h en tampón, pH 7,6, que contiene 100 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl mM NaCl 2, 20. El gel se tiñó with1% Coomassie Brilliant Blue R250 durante 2 h y después se trató con solución decolorante (40% de metanol, ácido acético 10%, 50% de agua destilada). La actividad proteolítica se detectó como bandas claras contra el fondo mancha del sustrato sin digerir en el gel. Estudio en Animales Red de implantación peritoneal
Este experimento se llevó a cabo de acuerdo con la directriz emitida por la Food and Drug Administration (SFDA China ). Los animales fueron alojados y atendidos de acuerdo con las directrices establecidas por el Consejo Nacional de Ciencia de la República de China ratones desnudos hembra Balb /c.
, 35-40 días de edad y un peso de 20-22 g, fueron suministrados por el Laboratorio de Shangai Slac Animal Company Limited. Los ratones se mantuvieron en condiciones estériles y alimentados con una dieta de ratón esterilizada y agua. Los animales fueron anestesiados por inhalación de isoflurance. PSC1, PSC2, PSNC y SGC7901 células (1 × 10 7 células) se suspendieron en 0,5 ml de DMEM y se inocularon en la cavidad abdominal de los ratones de prueba. Los ratones se sacrificaron seis semanas más tarde, y se evaluaron los nódulos diseminados presentes en el mesenterio y el diafragma.
El análisis estadístico
Todos los valores en el texto y las figuras se presentan como media ± desviación estándar. En general las tasas de supervivencia se determinaron utilizando el estimador de Kaplan-Meier, un evento que se define como la muerte por cáncer en correlación causa. Se utilizó la prueba de log-rank para identificar las diferencias entre las curvas de supervivencia de los grupos de pacientes diferentes. En el análisis univariante, 2 colas χ 2 pruebas para las variables categóricas y de 2 colas prueba de la t para variables continuas se utilizaron para las comparaciones estadísticas. Los valores de p <
0.05 se tomaron para mostrar una diferencia significativa entre las medias.
Resultados
CTGF se sobreexpresa en los cánceres gástricos y se correlacionaron con las características clínico-patológicas de los pacientes de cáncer gástrico
se determinó la expresión de CTGF en tejidos de cáncer gástrico y los tejidos normales emparejados distales . La figura 1A ilustra la expresión de CTGF en cinco pacientes escogidos al azar. Los niveles elevados de proteína CTGF se encontraron en los tejidos de cáncer gástrico humano en comparación con los tejidos normales emparejados de los pacientes. Esto también fue confirmado por tinción inmunohistoquímica (Figura 1B). Por otra parte, con el fin de investigar más la correlación entre la expresión de CTGF y características clinicopatológicas, se utilizaron 110 muestras para el examen con tinción inmunohistoquímica. El análisis estadístico reveló la expresión de CTGF positiva se asoció significativamente con el grado histológico, la metástasis de los ganglios linfáticos y la diseminación peritoneal en comparación con aquellos pacientes con expresión de CTGF negativo (Tabla 2). expresión CTGF positiva se detectó con más frecuencia en los casos de metástasis los ganglios linfáticos (P = 0,012). Los niveles de expresión de CTGF se incrementaron significativamente en los cánceres gástricos no diferenciadas en comparación con el cáncer gástrico diferenciadas (P = 0,039). Y la expresión de la proteína CTGF se correlacionó significativamente con el desarrollo de la diseminación peritoneal del cáncer gástrico (P = 0,011). El cálculo de la duración de la supervivencia de los 110 pacientes involucrados por el método de Kaplan-Meier reveló que los pacientes que contó con tumores de CTGF-positivas demostraron una supervivencia más corta en comparación con aquellos pacientes que sufrían de tumores CTGF-negativo (Figura 1 C, P < 0,001 ). Figura 1 La sobreexpresión de CTGF en el cáncer gástrico con un peor pronóstico. A. Análisis de transferencia Western demostró la expresión de CTGF en tejidos de cáncer gástrico y los tejidos normales emparejados distales de los cinco pacientes con cáncer gástrico seleccionados al azar. B. Resultados de inmunohistoquímica de la expresión de CTGF en muestras de tejido de cáncer gástrico pareadas. C. Kaplen-Meir curvas de supervivencia de 110 pacientes con cáncer gástrico, agrupadas de acuerdo a la expresión de CTGF.
Tabla 2 Asociación entre la expresión de CTGF y las características clínico-patológicas de los pacientes con cáncer gástrico (n = 110)

la expresión de CTGF


negativo positivo


valor de p
Sexo Masculino

33
34
0.779
mujer
20
23
Edad (años)
≤ 65
35
40
0,642 Hotel > 65
18
17
el tamaño del tumor (cm) Hotel < 5
26
25
0.585
≥ 5
27
32
tumor Ubicación y Baja
42
37
0,413
media página 5 página 8
superior página 3 página 6
Toda la página 3 página 6
El grado histológico
diferenciada
26 17

0.039 *
indiferenciado
27
40
Lauren grado
intestinal
28
21
0,108
difusa
25 36

metástasis de ganglios linfáticos
negativo
23 página 12
0,012 *
TNM positiva
etapa 30
45
I
11
8
0.080
II
15 página 9
III
20
22
IV página 7
18
metástasis hepática
negativo
50
55
0,588
positivo 3
2 diseminación peritoneal
negativo
50
44
0,011 *
positivo página 3 página 13
* P < 0,05; CTGF, factor de crecimiento de tejido conjuntivo.
Expresión de CTGF en líneas celulares de cáncer gástrico humano y el silencio mediada por siRNA
En primer lugar, hemos examinado la expresión de CTGF en seis líneas celulares de cáncer gástrico (MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 y MGC803) por Western blot. CTGF se detectó en todas las líneas celulares evaluadas, y con SGC7901 células que expresan el nivel más alto (Figura 2A). Por lo tanto, se seleccionaron las células SGC7901 como el modelo para los estudios de función siguientes. Debido a CTGF biológicamente activo es a la vez secretada y se expresa en el citoplasma [8, 27], también medimos el nivel de CTGF secretada en los medios de estas líneas celulares de cáncer gástrico mediante ELISA, que se coincide con el nivel de CTGF en el citoplasma acondicionado de cada línea celular (Figura 2B). Figura 2 La expresión de CTGF en líneas celulares de cáncer gástrico y desmontables de CTGF de siRNA. A. Transferencia Western que muestra la expresión de CTGF en 6 líneas celulares de cáncer gástrico. GAPDH sirvió como control de carga de proteínas. B. CTGF en medios acondicionados de 6 líneas celulares de cáncer gástrico y las células transfectadas estables se analizó por ELISA. Los resultados se expresan como pg /ml /1 x 106 células (media ± SD, n = 4). El análisis de transferencia Western de la expresión C. proteína CTGF en SGC7901, PSNC y CTGF líneas celulares estables desmontables (PSC1 y PSC2). D. Análisis de inmunofluorescencia de la expresión de CTGF. E. RT-qPCR que muestra los niveles de mRNA CTGF en SGC7901, PSNC y CTGF líneas celulares estables desmontables (PSC1 y PSC2). Los datos se expresan como factor de cambio con relación al control (control es SGC7901). Los valores se expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos. * P < 0,05 comparado con el control.
A estudiar la función de CTGF en SGC7901 células, el CTGF desmontables se utilizaron líneas celulares estables para analizar el efecto de silenciamiento. Como se muestra en la Figura 2B, el nivel de CTGF secretada en el medio condicionado se redujo significativamente en las células transfectadas siRNA-estable en comparación con el control. Western blot y tinción de inmunofluorescencia mostraron que la expresión de la proteína de CTGF en el citoplasma disminuyó notablemente en las líneas celulares estables de CTGF desmontables (Figura 2C, D). Además, la expresión de CTGF mRNA también se redujo significativamente en el CTGF líneas celulares estables desmontables (Figura 2E).
Desmontables de expresión CTGF inhibe el crecimiento de células de cáncer gástrico comentario El ensayo de formación de colonias se utilizó para evaluar el crecimiento de las células en las que se volvían CTGF. Como se muestra en la Figura 3A, CTGF desmontables células estables (PSC1 y PSC2) formada número significativamente menor de colonias en agar blando en comparación con las células SGC7901 y PSNC (83 ± 10, 90 ± 15 frente a 30 ± 7 y 20 ± 5, respectivamente). A fin de probar el efecto negativo de CTGF caída en el crecimiento de células de cáncer gástrico, el ensayo de MTT se realizó y curvas de crecimiento fueron generados (Figura 3B). Como se muestra por las curvas, tanto las células PSC1 y PSC2 proliferaron más lento que las células PSNC y SGC7901 células durante la primera 96 ​​h después se sembraron las células. La reducción dramática de la formación de colonias y el crecimiento de las células CTGF silenciados sugirió supresión CTGF podría regular negativamente el crecimiento de células de cáncer gástrico. RT-QPCR mostró que los niveles de ARNm de proteína relacionada con el ciclo celular ciclina D1 fueron regulados hacia abajo en las dos líneas celulares estables CTGF desmontables en comparación con PSNC y SGC7901 (Figura 3C). De acuerdo con este resultado, se observó una marcada reducción de la expresión de la proteína ciclina D1 en las células desmontables de CTGF PSC1 y PSC2 (Figura 3D). Curiosamente, el tratamiento con medio condicionado de SGC7901 que segrega una gran cantidad de CTGF fue capaz de rescatar la ciclina D1 downregulation y restaurar la proliferación celular en CTGF desmontables células estables. Estos datos indicaron que la supresión CTGF podría regular negativamente el crecimiento de células de cáncer gástrico y disminuir la expresión de ciclina D1. Figura 3 Desmontables de expresión CTGF inhibe el crecimiento de células de cáncer gástrico. ensayo de formación de colonias A.. B. Ensayo de proliferación de MTT. C. Desmontables de CTGF el regulado el nivel de mRNA de la ciclina D1. D. Desmontables de CTGF el regulado el nivel de proteína de la ciclina D1. PSC1 /PSC2 + CM de SGC7901: células PSC1 o PSC2 se incubaron con medio condicionado (CM) de SGC7901. Todos los resultados fueron reproducibles en tres experimentos independientes. * P < 0,05 en comparación con el control (control es SGC7901).
Desmontables de expresión CTGF inhibe la migración y la invasión de células de cáncer gástrico
la migración celular y la invasión son procesos críticos en la metástasis tumoral. Hemos investigado la migración de células por cámara de Boyden no matrigel recubierto y la invasión de células por ensayos de cámara de invasión de Matrigel recubiertos, respectivamente. En los ensayos de migración (Figura 4A), las tasas de migración de la PSC1 y células PSC2 se redujo significativamente en comparación con el control (P < 0,05). Como se muestra en la Figura 4B, CTGF desmontables también redujo notablemente las propiedades de invasión de células en comparación con el control. tasas de invasión celular de las células PSC1 y PSC2 se redujeron en 61,4% y 55,8%, respectivamente. RT-QPCR y Western blot mostró que MMP-2 y MMP-9 fueron regulados hacia abajo en los dos clones estables en comparación con las células control (Figura 4C; D). Por el contrario, MMP-3 no cambió de manera significativa tanto en el ARNm y los niveles de proteína. Además, el análisis de zimografía mostró las actividades tanto de MMP-2 y MMP-9 en las células transfectadas siRNA-estable fueron significativamente inferiores a los de las células control (Figura 4E). Curiosamente, el tratamiento con medio condicionado de SGC7901 que segrega una gran cantidad de CTGF indujo la re-expresión de MMP-2 y MMP-9 y restauró la migración y la invasión de la CTGF desmontables células estables. Estos resultados sugieren que desmontables de expresión CTGF redujo la migración y la invasión de células de cáncer gástrico y la disminución de la expresión de MMP-2 y MMP-9. Figura 4 Desmontables de expresión CTGF inhibe la migración y la invasión de células de cáncer gástrico. ensayo de migración de células de A.. ensayo de invasión de la célula B.. células migración y la invasión fueron fijadas y teñidas, y se fotografiaron campos representativos. Para la cuantificación, se contaron las células en 10 campos al azar bajo un microscopio óptico (x 200). ensayos por triplicado se realizaron para cada grupo de células en ensayos de invasión y migración, y los resultados se expresan como media ± SD. C. RT-QPCR se llevó a cabo para el análisis de la expresión de mRNA de MMP-2, MMP-3, MMP-9 y en la caída de líneas celulares estables y células de control de CTGF. Las barras representan la media ± desviación estándar de tres experimentos. D. Los niveles de proteína de MMP-2, MMP-3, MMP-9 y se detectaron mediante transferencia de Western. GAPDH sirvió como control de carga de proteínas. análisis de zimografía E. gelatina para las actividades de MMP-2 y MMP-9. PSC1 /PSC2 + CM de SGC7901: células PSC1 o PSC2 se incubaron con medio condicionado (CM) de SGC7901 * P <. 0,05 comparado con el control (control es SGC7901).
Regulación a la baja de CTGF inhibe la diseminación peritoneal del cáncer gástrico en vivo
Para explorar los efectos de CTGF en la diseminación peritoneal de células de cáncer gástrico in vivo, se inocularon células en diferentes ratones desnudos. SGC7901 células, control de línea celular estable (PSNC), y se inyectaron CTGF desmontables células estables (PSC1 y PSC2) en cuatro grupos separados de ratones desnudos. Como consecuencia de dicho tratamiento, la supresión medible de diseminación peritoneal en ratones inyectados con células estables CTGF desmontables en comparación con los inyectados con SGC7901 células o células PSNC se observó (Figura 5A). Cuantitativamente, se observaron 117 ± 20 nódulos diseminados para los ratones de ensayo inoculados con células SGC7901 y 137 ± 26 nódulos diseminados se observaron en los ratones inoculados con células PSNC. Por el contrario, significativos menos nódulos diseminados fueron capaces de ser observado para los ratones inyectados con células estables CTGF desmontables (Figura 5B). Figura 5 Desmontables de CTGF inhibe el cáncer gástrico SGC7901 xenoinjerto diseminación peritoneal. SGC7901, PSNC y CTGF líneas celulares estables desmontables (PSC1 y PSC2) fueron inyectados por vía intraperitoneal como se describe en "Materiales y Métodos". 6 semanas más tarde, los ratones se sacrificaron, fotografiado, diseccionaron y se contaron los nódulos diseminados presentes en el mesenterio y el diafragma. A. La fotografía de ratones desnudos con diseminación peritoneal de cada grupo. Se evaluaron B. Los nódulos diseminados. Cada barra representa la media ± desviación estándar (n = 5 para cada grupo). * P < 0,05 comparado con el control (control es SGC7901)
. Discusión
La más extensa literatura hasta la fecha en relación con CTGF define su papel en la curación de heridas y la enfermedad fibrótica. Recientemente, varios estudios implican CTGF en el desarrollo tumoral y la supervivencia de las células tumorales [28 a 30]. Sin embargo, la función exacta de CTGF en la progresión del tumor no es definitivo, y la función de CTGF en la biología de las células tumorales del cáncer gástrico no se ha investigado a fondo. Para abordar estas cuestiones, se evaluó la expresión de CTGF en relación con las correlaciones directas con el crecimiento celular y la invasión de células de cáncer gástrico. Por otra parte, se investigó adicionalmente los efectos de CTGF en la difusión peritoneal de células de cáncer gástrico in vivo.
En este estudio, nuestros resultados mostraron que CTGF fue altamente expresado en tejidos de cáncer gástrico en comparación con los tejidos gástricos normales emparejados. La expresión de CTGF en el cáncer gástrico indiferenciado fue significativamente mayor que los de cáncer gástrico diferenciado. La expresión de CTGF en el tejido tumoral se asoció con metástasis en los ganglios linfáticos y la diseminación peritoneal. Por otra parte, los pacientes con expresión de CTGF positivos tenían significativamente menor postoperatoria acumulada tasa de supervivencia de 5 años (22,9%) que aquellos con la expresión de CTGF negativo (48,1%, Figura 1C). Estos resultados sugieren que CTGF podría estar implicado en la progresión y la metástasis de cáncer gástrico. Además, CTGF podría ser un marcador pronóstico útil.
Varios estudios recientes han revelado que CTGF regular el crecimiento celular en células de cáncer de esófago y las células de cáncer de páncreas [20, 30]. Sin embargo, poco se sabe sobre el efecto de la expresión de CTGF sobre el crecimiento celular de células de cáncer gástrico. Nuestros resultados mostraron que la supresión CTGF como resultado la inhibición de la proliferación celular y el crecimiento clonogénico.

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