Downregulációját kötőszöveti növekedési faktor gátolja a növekedést és a invázió gyomorrák sejtek és csökkenti a hashártya terjesztés

Downregulációját kötőszöveti növekedési faktor gátolja a növekedést és invázió gyomor rákos sejteket, és enyhíti a peritoneális terjesztés
Abstract
alapon
kötőszöveti növekedési faktor (CTGF) kimutatták, hogy szerepet játszik a daganat fejlődését és progresszióját. Szerepe azonban CTGF gyomorrák még jórészt ismeretlen. Katalógusa Eredmények
Ebben a tanulmányban azt mutatták, hogy CTGF nagyra kifejezve gyomorrák szövetekben képest kiegyenlített normális gyomor szövetekben. A CTGF-expresszió tumorszövetben társult szövettani fokozatú, nyirokcsomó-metasztázis és a peritoneális terjesztés (P < 0,05). Pozitív betegek CTGF expressziója szignifikánsan alacsonyabb kumulatív posztoperatív 5 éves túlélési aránya, mint a negatív CTGF expressziója (22,9% versus 48,1%, P < 0,001). Kimutattuk, hogy a kiütése CTGF expressziója szignifikánsan gátolta a sejtek növekedését gyomorrák sejtek csökkent ciklin D 1 kifejezés. Sőt, kiütése CTGF expressziójának is szignifikánsan csökkentette a migrációs és behatolás a gyomor rákos sejteket, és csökkent a kifejezés a mátrix metalloproteináz (MMP) -2 és MMP-9. Az állatkísérletek során kiderült, hogy csupasz egerekben fecskendeznek a CTGF knockdown stabil sejtvonalak szerepelt egy kisebb számú peritoneális vetés csomók, mint a kontroll sejtvonalak.
Következtetések
Ezek az adatok arra utalnak, hogy CTGF fontos szerepet játszik a sejt növekedés és inváziót humán gyomorrák, és úgy tűnik, hogy egy potenciális prognosztikai markere gyomorrákos betegeknél. katalógusa Kulcsszavak katalógusa kötőszöveti növekedési faktor gyomor daganatok sejtproliferációt invazív peritoneális terjesztése Bevezetés katalógusa ellenére jelentős előrelépést a rákkutatás, a rák továbbra is a világméretű egészségügyi problémát és daganatos megbetegedések miatti halálozás magas [1]. A gyomorrák a második vezető oka a rák okozta halál a világon, miközben úgy tűnik, hogy csökkenő tendenciát mutat előfordulása, különösen a nyugati országokban; még mindig gyakran számoltak be Kínában és Japánban [2, 3]. Annak ellenére, hogy a betegek prognózisát előrehaladott gyomorrák látszik javulni eredményeként a szabványosítás a műtéti technikák és legújabb előrelépések kemoterápia, az 5 éves túlélési arány posztoperatív továbbra is alacsony [4, 5]. Peritoneális metasztázis a leggyakoribb és szignifikáns halálozási ok a műtét után gyomorrák [6, 7]. Azonban azok a mechanizmusok peritoneális áttétek még nem határozták meg világosan.
Kötőszöveti növekedési faktor (CTGF), más néven CCN2, tagja a CCN család, beleértve a cisztein-gazdag fehérje 61 (Cyr61), más néven CCN1, és nephroblastoma-over expresszált gén (növ), más néven CCN3, valamint a WISP-1 /elm1 (CCN4), a WISP-2 /rcop1 (CCN5) és a WISP-3 (CCN6) [8, 9]. CTGF úgy vélik, hogy egy multifunkcionális jelátviteli modulátor vesz részt a legkülönbözőbb biológiai vagy kóros folyamatok, például az angiogenezis, osteogenesis, fibrózis a vesékben és a bőr, és a tumor fejlődését [10-12]. Bár a szerepe CCN2 a normál szövethez fibrózis már jól tanulmányozott [13], a funkció a CCN2 rák nem olyan jól érthető. Érdekes, CCN2 már azonosították egy onkogént a különböző ráktípusok, de tekinthető egy tumor-szuppresszor gén más formái rák [14]. Overexpressziója CTGF található prosztatarákban [15], gliómák [16], a mellrák, [17] és a felnőttkori akut limfoblasztos leukémia [18]. Fokozott CTGF expressziója összefüggésbe hozták progressziójával nyaki tumorok [19], és a nyelőcső pikkelyes sejtes karcinóma [20]. Ezzel szemben, a tüdő adenocarcinoma [21] és vastagbélrák [22], overexpressziója CTGF gátolja invázió és metasztázis a rákos sejtek in vitro és in vivo.
Klinikai vizsgálatok azt mutatták, hogy a túlzott mértékű expressziója CTGF szignifikáns korrelációt mutatott a nyirokcsomó metasztázis és rossz prognózissal betegeknél gyomorrák [23, 24]. Azonban a pontos szerepe CTGF a gyomorrák még mindig ismeretlen. Ebben a tanulmányban feltárt CTGF expressziója gyomorrákban szövetekben. Azt találtuk, hogy CTGF-t túlzott mértékben a gyomorrák, és expresszióját összefüggésbe hozták az agresszív viselkedés a gyomorrák. Ezután használt siRNS technológiát knockdown endogén CTGF expressziója gyomorrákban sejtekben. Kimutattuk, hogy downregulációját CTGF gátolta a növekedést és a invázió gyomorrák in vitro és legyengített peritoneális terjesztés in vivo. Vizsgálatunk erősen kiemeli a jelentősége a CTGF növekedésében és invázió gyomorrák, és rendelkezhet terápiás célpont a gyomorrák.
Anyagok és módszerek
reagensek
dimetil-szulfoxid (DMSO), és a tripszin vásárolt Sigma (St. Louis, MO, USA). DMEM, sztreptomicin és egyéb sejttenyésztő kellékek voltak GIBCOBRL (Grand Island, NY, USA). Magzati borjúszérummal volt a Hyclone (Logan, UT, USA). MTT [3- (4, 5-dimetil-tiazol-2-il) -2, 5-diphenyltrazolium bromid] kaptuk a Fluka (Ronkonkoma, NY, USA). CTGF, a ciklin D1, mátrix metalloproteináz (MMP) -2, MMP-3, MMP-9 és GAPDH primer antitest, valamint a második ellenanyag Rodamin (TRITC) konjugált AffiniPure kecske anti-egér IgG-t nyertünk a Santa Cruz Biotechnology is (Santa Cruz, CA, USA). CTGF ELISA kit vásároltunk a R &D (Minneapolis, MN, USA). Trizol és Lipofectamine 2000 vásároltuk (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). SYBR @ Primescript ™ RT-PCR kit volt a Takara Biotechnology, Japánban. Katalógusa szövetmintából és immunhisztokémiai festéssel katalógusa daganatmintákat nyert 110 gyomorrákos betegeknél műtéten átesett, a Department of Surgical Oncology, First kapcsolt Kórház kínai Orvostudományi Egyetem 2003-2005-ös időszakban. Minden betegnél gastrctomy, és a klinikai és patológiai adatok álltak rendelkezésre. Normál gyomor szöveteket vettünk a párosított disztális reszekált mérlegelési gyomorrák mintákban. Minden sebészeti mintákban vizsgáltuk a tapasztalt patológusok és a távoli kimetszett árrés tumormentesen. A friss szöveteket kis darabokra vágva, lefagyasztottuk folyékony nitrogénben azonnal, és -80 ° C-on, amíg fehérje kitermelése. A vizsgálati protokollt felül és hagyja jóvá az Etikai Bizottság a Kínai Orvostudományi Egyetem.
Immunhisztokémiai festéssel, 4 um szövettani metszeteket paraffint xilollal és rehydráltuk keresztül egy fokozatos sor alkoholt. A metszeteket ezután 10 percig forraljuk 0,01 M citrát pufferben, és az endogén peroxidázt blokkoljuk 0,3% -os H 2 O 2 metanollal 30 percig keverjük. A nemspecifikus kötődést blokkolta inkubáljuk tárgylemezeket normál kecske szérummal 30 percig, szobahőmérsékleten. A metszeteket egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on 1:50 hígítású CTGF primer antitesttel. A metszeteket kitéve biotinnal jelzett szekunder antitesttel 1 órán, a streptavidin-peroxidáz reakció rendszert, majd fejlesztették DAB- H 2 O 2. Festést szerezte a következő skála alapján: 0, nincs festés; 1+ minimális festés; 2+, közepesen erős festődés legalább 20% a sejtek; 3+, erős festődést legalább 50% a sejtek. Olyan esetek, 0 vagy 1+ festéssel sorolták a negatív, és azokat az eseteket a 2+ vagy 3+ festődést sorolták pozitív.
Cell Culture
emberi gyomorban rákos sejtvonalak, MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 és MGC803 kaptuk a Department of Cell Biology, Kína Orvostudományi Egyetem, Kína. Ezek DMEM-ben tenyésztjük, amely 10% magzati borjúszérumot, 100 U /ml penicillint, 100 ug /ml sztreptomicin-37 ° C hőmérsékleten nedvesített atmoszférában, 5% CO 2. A sejteket elmozdulhatnak alkalmazásával 0,25% tripszin és 0,02 mol /l EDTA-t tartalmazó PBS-ben szubkultúra.
Építőipari CTGF knockdown stabil sejtvonalak
Két kis interferáló RNS-t (siRNS-t) oligonukleotidokat a cél két különböző régiók a CTGF cDNS: GTGCATCCGTACTCCCAAA (PSC1) és GCTAAATTCTGTGGAGTAT (PSC2). Ezeket klónoztuk siRNS expressziós vektorba pGCsilencer ™ U6.Neo.GFP. A nem-specifikus siRNS-t alkalmaztunk negatív kontroll (PSNC). Az siRNS expressziós plazmidokat transzfektáljuk SGC7901 sejtekbe Lipofectamine 2000 A sejteket átvizsgáljuk G418-cal (800 ng /ml), és a kolóniákat szedtünk 3 hét után meghatározva RT-QPCR és Western-blottal. A sejteket transzfektáltuk PSC1, PSC2 vagy PSNC arra kijelölt PSC1 sejtek PSC2 sejtek vagy PSNC sejtekben az.
Valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakció (RT-QPCR)
Az összes RNS-t izoláltunk sejt pelletet Trizol reagens. A teljes RNS (1 ug) alakítjuk cDNS segítségével RT (reverz transzkriptáz) reakció kit. Real-time PCR-t Mx3000P valós idejű PCR-rendszer szerint a gyártó utasításainak és SYBR ® Premix ExTaq, mint egy DNS-specifikus fluoreszcens festékkel. PCR-t végeztünk 40 ciklusban 95 ° C 5 s és 60 ° C-on 40 másodpercig. Primer szekvenciákat 1. táblázatban mutatjuk be A küszöb ciklus (Ct) kaptunk, és a relatív mennyiségek minden mintánál meghatározzuk normalizált GAPDH. Kifejezések mRNS számították ki az ΔΔCt módszer [25] .table 1 PCR primer szekvenciák katalógusa Gene Matton primer szekvenciák (5'-3 ') és fordított
Termék (bp)

CTGF
CTTGCGAAGCTGACCTGGAA
AAAGCTCAAACTTGATAGGCTTGGA
90
MMP-2
ATGACATCAAGGGCATTCAGGAG
TCTGAGCGATGCCATCAAATACA
135
MMP-3
GGGTGAGGACACCAGCATGA
CAGAGTGTCGGAGTCCAGCTTC
178
MMP-9
TCCCAGACCTGGGCAGATTC
GCAAAGGCGTCGTCAATCAC
124
Cyclin D1
GATGCCAACCTCCTCAACGAC
CTCCTCGCACTTCTGTTCCTC
171
GAPDH
GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
TGGTGAAGACGCCAGTGGA
138
Western-blot analízis katalógusa A szöveteket vagy sejteket lizáltuk RIPA puffert kiegészítve a proteáz-inhibitor keveréket 30 percen át 4 ° C-on. A sejt lizátumokat azután ultrahanggal kezeljük, rövid ideig, és centrifugáljuk (14.000 g, 4 ° C) 15 percig, hogy eltávolítsuk az oldhatatlan anyagokat. Egyenlő mennyiségű fehérjét elválasztottuk SDS-PAGE, és átvisszük egy PVDF membránon. A membránokat blokkoltuk 5% zsírmentes tejpor, majd inkubáljuk első ellenanyag, majd tormaperoxidáz-konjugált másodlagos antitesttel. Protein sávokat láthatóvá ECL kemilumineszcenciás módszerrel.
Immunfluoreszcens és konfokális képalkotó
a sejteket Lab-Tek szövettenyésztő kamra tárgylemezeket fixáltuk hideg 100% -os metanolban 10 percig, majd blokkoltuk normál kecske szérummal 30 percig . A sejteket inkubáltuk a primer antitest egy éjszakán át 4 ° C-on, 3-szor mossuk PBT (PBS 1 ‰ Triton X-100), majd inkubáljuk második antitesttel konjugált rodamin. A DNS festék DAPI használtunk folt a DNS-t. A sejteket leképezett Leica SP2AOBS konfokális mikroszkóppal.
Kondicionált tápközeget (CM) gyűjtés és az enzim-kapcsolt immunoassay (ELISA) katalógusa 3 × 10 5 sejteket beoltottuk 100 mm-es szövettenyésztő csészébe DMEM, amely 10 % magzati borjúszérumot 2 napig. Ezután a sejteket kétszer mostuk PBS-sel, és inkubáltuk 5 ml szérummentes DMEM-ben. 48 óra elteltével a kondicionált tápközeget összegyűjtjük, és centrifugáljuk 2000 g-vel 5 percig, átengedjük szűrőkön (pórusméret, 0,45 um), és -80 ° C-on tároltuk felhasználásig.
A szintek CTGF a származó kondicionált tápközeg gyomor rákos sejtvonalak alkalmazásával mértük humán Quantikine ELISA kit követve a gyártó utasításait.
MTT proliferációs vizsgálati
az képessége sejtproliferáció alkalmazásával vizsgáltuk MTT [3- (4, 5-dimetil-tiazol-2-il) -2 , 5-diphenyltrazolium bromid] assay. Körülbelül 5 × 10 3 sejteket oltottunk 96 lyukú lemezeken és tenyésztettünk szérummentes DMEM, 24, 48, 72, és 96 óra, ill. Ezután a sejteket inkubáltuk 20 ul MTT-t (10 mg /ml) 4 órán át 37 ° Cand 200 ul DMSO-t pipettáztunk szolubilizálására a formazán termék 20 percig, szobahőmérsékleten. Az optikai sűrűség (OD) alkalmazásával határozzuk meg spektrofotométerrel (Bio-Rad) egy 570 nm hullámhosszon.
Telepképző assay
5 × 10 2 sejteket szuszpendálunk 2 ml 0,3% -os agaróz DMEM közeg amely 10% magzati marhaszérumot szélesztettünk 6 lyukú lemezekre a tetején a meglévő 0,6% alsó agaróz azonos közegben. A lemezeket inkubáljuk 37 ° C-on, 5% CO 2 inkubátorban. Három hét múlva, a sejt kolóniákat > 0,1 mm átmérőjű alatt megszámoltuk mikroszkopikus területen.
Sejtek invázióját assay
Az invázió határoztuk meg egy invázió kamra vizsgálatban. A sejteket (2 × 10 4) oltunk a felső kamrájába egy 24 mélyedéses Matrigel bevont mikropórusos membrán szűrő 8 um pórusokat, és az alsó kamrába töltöttük 0,5 ml DMEM, 10% magzati borjúszérumot, mint egy chemoattractant. Inkubálás után 24 óra, a nem behatoló sejtek (felső kamra) adtunk óvatosan eltávolítjuk egy pamut végű pálcikát, és betörő sejtek (alsó kamra) fixáltuk, eluensként metanol és festettük tripánkék. Az invazív képességét határoztuk száma behatoló sejteket mikroszkóp alatt 200 × nagyítással 10 véletlen mezők minden egyes lyukba.
Chamber migrációs assay
A módszer in vitro migrációs assay-t egy nem-Matrigel-bevonatos 24 lyukú Boyden-kamra (8 um, Millipore). A sejteket (2 × 10 4) oltunk a lapkák szuszpendáljuk 0,2 ml szérummentes DMEM-közegben. Nem-migráló sejteket eltávolítottuk a felső kamrából a szűrő inkubáció után 24 órán át. A migrált sejteket megfestettük és mennyiségileg eljárás alapján a korábban leírt módon. Három párhuzamos vizsgálatot végeztünk minden egyes csoport a sejtek inváziójára és migrációjára esszék, és eredményeket mint átlag ± SD.
Zselatin zimográfia
MMP-2 és MMP-9-aktivitást úgy határoztuk meg, zselatin zimográfiával a korábban ismertetett módon [ ,,,0],26]. Röviden, Centrifugálás után a felülúszót elválasztjuk, és fehérje-koncentráció határozza meg; egyenlő mennyiségű fehérje, hozzáadott minta-pufferben (Tris-HCl 1 M, pH = 6,8, nátrium-dodecil-szulfát (SDS) 2%, glicerin 10%) vittük fel 7,5% -os SDS-poliakrilamid-gélen, amely 1 mg /ml zselatin. Az elektroforézis után SDS-t eltávolítottuk a gélből kétszer mostuk 2,5% Triton X-100, 1 órán át. Miután egy rövid öblítés után a gélt 37 ° C-on 18 órán át, pH = 7,6, 100 mM Tris-HCl, 10 mM CaCI 2, 20 mM NaCi. A gélt with1% Coomassie Brilliant Blue R250-on 2 órán át, majd kezeltük színtelenítő oldat (40% metanol, 10% ecetsav, 50% desztillált víz). Proteolitikus aktivitást észleltek egyértelmű szalagok a háttérben foltot emésztetlen szubsztrátot a gélben. Katalógusa Állat tanulmány peritonealis implantáció katalógusa Ezt a kísérletet összhangban iránymutatást az állam által kibocsátott Food and Drug Administration (SFDA Kína ). Az állatokat és gondozott összhangban megállapított iránymutatások az Országos Tudományos Tanács Köztársaság Kínában. Katalógusa nőstény BALB /c csupasz egerek, 35-40 naposak, és a súlya 20-22 g szállította Shanghai SLAC Laboratory állat Limited Company. Az egereket tartottuk steril körülmények között, és tápláljuk egy sterilizált egér diéta és a víz. Az állatokat elaltattuk keresztül belélegzése isoflurance. PSC1, PSC2, PSNC és SGC7901 sejteket (1 × 10 7 sejt) szuszpendálunk 0,5 ml DMEM és inokuláljuk a hasüregbe vizsgálati egerekbe. Az egereket megöltük hat héttel később, és minden terjeszteni csomók jelen a bélfodor, rekeszizom értékeltük.
Statisztikai analízis Tanuld az összes értékeket a szöveg és számok átlag ± SD. A teljes túlélési ráták alkalmazásával határoztuk meg Kaplan-Meier, egy esemény van definiálva, mint a halál rák korrelált oka. A log-rank tesztet alkalmaztunk azonosítani közötti különbségek a túlélési görbéket a különböző betegcsoportok. Az egyváltozós elemzés szerint 2 farkú χ 2 teszt a kategorikus változók és 2 mintás t próba folytonos változókat használtak statisztikai összehasonlításokat. P értéke katalógusa < 0,05 vitték szignifikáns különbség módon. Katalógusa Eredmények katalógusa CTGF túlzottan kifejeződik gyomorrák, és összefügg a klinikopatológiai jellemzői gyomorrákos betegek
Meghatároztuk a CTGF expressziója gyomorrákban szövetek és kiegyenlített távolabbi normál szövetekben . 1A illusztrált CTGF expressziójának öt véletlenszerűen kiválasztott betegek. Emelkedett CTGF fehérje találtak humán gyomorrák szöveteket összehasonlítva a párosított normális szövetekben a betegektől. Ezt megerősítette immunhisztokémiai festésével (1b ábra). Továbbá annak érdekében, hogy tovább vizsgáljuk az összefüggést a kifejezése CTGF és klinikopatológiai jellemzői, 110 mintákat használtuk vizsgálat immunhisztokémiai festéssel. Statisztikai analízis feltárta, pozitív CTGF expressziója szignifikánsan összefüggött a szövettani fokozatú, nyirokcsomó-metasztázis és a peritoneális terjesztés képest negatív betegeknél CTGF-expressziót (2. táblázat). Pozitív CTGF-expressziót gyakrabban kimutatható esetekben nyirokcsomóáttét (P = 0,012). Szintek CTGF expressziója jelentősen növelték differenciálatlan gyomorrák képest differenciált gyomorrák (P = 0,039). És kifejezése CTGF fehérje szignifikáns korrelációt a fejlesztési peritoneális terjesztése gyomorrák (P = 0,011). Kiszámítása túlélés időtartama a 110 betegek vettek részt a Kaplan-Meier-módszerrel feltárta, hogy a betegek, akik szerepelt CTGF-pozitív daganatok bizonyította rövidebb túlélési ha összehasonlítjuk azokat a betegeket, akik szenvedtek CTGF-negatív tumorok (1C, a P < 0,001 ). 1. ábra túltermelése CTGF gyomorrák prognózisa rosszabb. A. Western blot analízis során CTGF expressziója gyomorrákban szövetek és kiegyenlített távolabbi normál szövetekben öt véletlenszerűen kiválasztott gyomorrákos betegek. B. Immunhisztokémia eredményeit CTGF expressziójának párosított gyomorrák szöveti mintákat. C. Kaplen-Meir túlélési görbéi 110 gyomorrákos betegeknél szerint csoportosítva CTGF kifejezést. Katalógusa 2. táblázat közötti társulás CTGF a klinikopatológiai jellemzői gyomorrákos betegeknél (n = 110) hotelben katalógusa CTGF kifejezés Matton katalógusa katalógusa Negatív
Pozitív Matton p
A nemek katalógusa Férfi katalógusa 33 katalógusa 34 katalógusa 0,779 fiatal női katalógusa 20 katalógusa 23 katalógusa Életkor (év) hotelben ≤ 65 katalógusa 35 katalógusa 40
0.642 katalógusa > 65 katalógusa 18 katalógusa 17 katalógusa daganat mérete (cm) hotelben < 5 katalógusa 26 katalógusa 25 katalógusa 0.585 katalógusa ≥ 5 katalógusa 27 katalógusa 32 katalógusa tumor helyét katalógusa Alsó katalógusa 42 katalógusa 37 katalógusa 0.413 katalógusa Közel katalógusa 5 katalógusa 8 katalógusa Felső katalógusa 3 katalógusa 6 katalógusa teljes katalógusa 3 katalógusa 6 katalógusa szövettani grade katalógusa differenciált katalógusa 26 katalógusa 17
0,039 * katalógusa differenciálatlan katalógusa 27 katalógusa 40 katalógusa Lauren minőségű katalógusa Bél katalógusa 28 katalógusa 21 katalógusa 0.108 katalógusa Diffúz katalógusa 25 katalógusa 36
nyirokcsomó áttétek katalógusa Negatív katalógusa 23 katalógusa 12 katalógusa 0,012 * katalógusa Pozitív katalógusa 30 katalógusa 45 katalógusa TNM katalógusa I
11
8 katalógusa 0.080 katalógusa II
15 katalógusa 9 katalógusa III
20 katalógusa 22 katalógusa IV katalógusa 7 katalógusa 18 katalógusa Beszűkült metasztázis katalógusa negatív katalógusa 50 katalógusa 55 katalógusa 0,588 katalógusa Pozitív katalógusa 3 katalógusa 2

• A magasabb számú Helicobacter pylori CagA EPIYA C foszforilációs helyek növeli a gyomorrák, de nem duodenális ulcer
• Kópiaszám profilok gyomorrák prekurzor elváltozások