Downregulation vun connective Wuesstem Faktor Otemschwieregkeeten bremst de Wuesstem an Invasioun vun gastric Kriibs Zellen an attenuates peritoneal Weiderleede

Downregulation vun connective Wuesstem Faktor Otemschwieregkeeten bremst de Wuesstem an Invasioun vun gastric Kriibs Zellen an attenuates peritoneal Weiderleede VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung Connective Otemschwieregkeeten Wuesstem Faktor (CTGF) gewise gouf zu entholl Entwécklung an Werdegang agebonne ginn. Allerdéngs bleift d'Roll vun CTGF zu gastric Kriibs schiddene onbekannt. VerfÜgung Resultater An dëser Etude VerfÜgung, awer mir dass CTGF héich war an gastric Kriibs Stoffer Verglach mat reagéiert normal gastric Stoffer ausgedréckt. D'CTGF Ausdrock vun entholl Otemschwieregkeeten war mat histologic Schouljoer, lymph Node Metastasen an peritoneal Publikatioun (P &Si besteet; 0,05) assoziéiert. Patienten mat positive CTGF Ausdrock hu vill manner entwéckele Thes 5 Joer Iwwerliewe Tarif wéi déi mat negativen CTGF Ausdrock (22.9% versus 48,1%, P &Si besteet; 0.001). Mir bewisen datt knockdown vun CTGF Ausdrock vill inhibited Zell Wuesstem vun gastric Kriibs Zellen a rofgaang cyclin D 1 Ausdrock. Desweideren, knockdown vun Ausdrock CTGF och reduzéiert Ofstand der Migratioun an Invasioun vun gastric Kriibs Zellen a rofgaang den Ausdrock vun Matrixentgasung metalloproteinase (MMP) -2 an MMP-9. Déier Studien Teamchef Sauna Mais heijen mat der CTGF knockdown stabil Zell Linnen eng kleng Zuel vun peritoneal Morden noverfollegt wéi d'Kontroll Zell Linnen souzen. VerfÜgung Konklusiounen VerfÜgung Dës Donnéeë hindeit, datt CTGF eng wichteg Roll an der Zell Wuesstem an Invasioun spillt an Mënsch gastric Kriibs an et schengt mat gastric Kriibs eng potentiell prognostic Bewaacher fir Patienten ze ginn. VerfÜgung Schlësselwieder VerfÜgung Connective Otemschwieregkeeten Wuesstem Faktor Mo. neoplasms Zell Prolifératioun Invasiveness Peritoneal Weiderleede Erschléisse VerfÜgung Trotz wesentleche Fortschrëtter an der Kriibsfuerschung, Kriibs bleift e weltwäit Gesondheetsproblem a veruerteelt wéinst Kriibs bleift héich [1]. Gastric Kriibs ass den zweete Spëtzekandidat Ursaach vum Kriibs-Zesummenhang Doud vun der Welt während et ofgeholl Trend zu rare gin schengt, virun allem am westlechen Länner; et ass nach Toast an China a Japan gemellt [2, 3]. Obschonn d'Iwwregens hätt vun Patienten mat fortgeschratt gastric Kriibs schéngt als Resultat vun der Ufuerderungen vun chirurgesch Techniken an de leschte Schrett an Chimiotherapie zu verbessert, de 5-Joer Thes Iwwerliewe Taux bleift héich [4, 5]. Peritoneal Metastasen ass déi gemeinsam a wesentleche Ursaach vun veruerteelt no Chirurgie fir gastric Kriibs [6, 7]. Allerdéngs hunn d'Mechanisme vun peritoneal Metastasen net kloer definéiert ginn. VerfÜgung Connective Otemschwieregkeeten Wuesstem Faktor (CTGF), och als CCN2 bekannt, e Member vun der CCN Famill ass, dorënner cysteine-räiche FAQ 61 (Cyr61), och bekannt als CCN1, an nephroblastoma-iwwer ausgedréckt Gentherapie (Nov), och als CCN3 bekannt, souwéi Wisp-1 /elm1 (CCN4), Wisp-2 /rcop1 (CCN5) an Wisp-3 (CCN6) [8, 9]. CTGF ass gegleeft Salle sécher modulator zu enger grousser Villfalt vu biologic oder pathologic Prozesser, wéi angiogenesis, osteogenesis, fibrosis zu Nier an Haut, an entholl Entwécklung [10-12] Équipe ze ginn. Obwuel d'Roll vun CCN2 zu fibrosis normal Otemschwieregkeeten gutt-studéiert gouf [13], ass d'Funktioun vun CCN2 zu Kriibs net sou gutt verstanen. Spannen, gouf als oncogene zu enger Rei vu Kriibs Zorte CCN2 identifizéiert mee ass eng entholl-suppressor Gentherapie an aner Forme vu Kriibs [14] considéréiert. Overexpression vun CTGF ass an Aarbecht Kriibs [15], gliomas [16], Broscht Kriibs [17], an erwuessener Fouss lymphoblastic Leukämie [18] fonnt. Geklomm CTGF Ausdrock huet mat Werdegang vun cervical erhéijen [19], an esophageal squamous Zell carcinoma [20] assoziéiert gouf. Ëmgekéiert, an haett adenocarcinomas [21] an Colon Cancers [22], overexpression vun CTGF Invasioun an Metastasen vun de Kriibs Zellen bremst souwuel eng kënschtlech an VIVO. VerfÜgung Séminairen Etuden hunn dat overexpression vun CTGF dës vill mat lymph Node soll war Metastasen an aarme hätt an Patienten mat gastric Kriibs [23, 24]. Allerdéngs ass de genee Roll vun CTGF zu gastric Kriibs nach onbekannt. An dëser Etude, nogewise mir CTGF Ausdrock vun gastric Kriibs Stoffer. Mir hu fonnt, datt CTGF war zu gastric Kriibs overexpressed, an hiren Ausdrock war mat aggressive Verhalen vun gastric Kriibs assoziéiert. Mir ginn dann siRNA Technologie ze endogenous CTGF Ausdrock vun gastric Kriibs Zellen knockdown. Mir bewisen datt downregulation vun CTGF de Wuesstem an Invasioun vun gastric Kriibs kënschtlech inhibited an attenuated peritoneal Weiderleede vun VIVO. Eis Etude Héichpunkter betraff der Bedeitung vun CTGF an de Wuesstem an Invasioun vun gastric Kriibs, an eng therapeutesch Zilscheif vun gastric Kriibs suerge kann. VerfÜgung spontan a Methoden VerfÜgung Reagents VerfÜgung Police sulfoxide (DMSO) an trypsin aus kaaft huet Fläch (St. Louis, MO, USA). DMEM, streptomycin an aner Zell Kultur Lager goufen aus GIBCOBRL (Grand Island, NY, USA). An et Bovine serum war vun Hyclone (Logan, féier, USA). MTT [3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltrazolium bromide] war vun Fluka (Ronkonkoma, NY, USA) kritt. CTGF, cyclin D1, Matrixentgasung metalloproteinase (MMP) -2, MMP-3, MMP-9 an GAPDH Primärschoul antibody, souwéi zweet antibody Rhodamine (TRITC) -conjugated affinipure Geess anti-Maus IgG vu Santa Cruz Déi kritt huet (Santa Cruz, CA, USA). D (är ganz Famill, Punktzuel, USA); CTGF Elisa Kit war vun R &kaaft. Trizol an Lipofectamine 2000 goufen aus Invitrogen (Karlsbad CA, USA) kaaft. SYBR @ Primescript ™ RT-Hinnen alleguer Kit war vun Takara Déi, Japan. VerfÜgung Ray uplanzen an immunohistochemical staining VerfÜgung entholl uplanzen vu 110 Patienten mat gastric Kriibs kritt huet deen Agrëff an d'Pompjeeën vun Surgical Zukunft mécht, éischt laizistesch Hospital vu China Medical University während der Period 2003-2005. All Patienten mécht gastrctomy, an hire Medeziner a agebousst Date goufen sinn. Normal Mo. Stoffer sech aus der stemmt distal resected Spillraum vun gastric Kriibs Echantillon. All chirurgesch uplanzen sech duerch erfuerene pathologists iwwerpréift an der distal resected Spillraum war entholl-gratis. Déi frësch Stoffer sech an kleng Stécker geschnidden, virgezunnen-gefruer an flëssege Stéckstoff direkt, a bei -80 ° C bis FAQ Extraktioun gespäichert. D'Etude Protokoll war vun der Ethik Comité vun China Medical University iwwerschafft a guttgeheescht. VerfÜgung Fir immunohistochemical staining, 4 μm histological Sektiounen mat xylene an rehydrated duerch eng graded Serie vun Alkohol deparaffinized goufen. D'Sektiounen sech dann an 0,01 M citrate Prellbock fir 10 min gekachten a endogenous peroxidase vun incubation vun 0.3% H 2 O 2 zu methanol fir 30 min gespaart gouf. Nonspecific bindend war fir 30 min bei Raumtemperatur vun incubating drënner mat normal Geess serum gespaart. D'Sektiounen sech Nuecht op 4 ° C mat 1:50 dilution vun CTGF Primärschoul antibody incubated. D'Sektiounen sech fir 1 h ze biotin-Label Secondaire antibody ausgesat, bis eng streptavidin-peroxidase Reaktioun System, an dann mat DAB- H entwéckelt 2 O 2. Staining war op der folgender Faarwen: 0, kee staining; 1+, minimal staining; 2+, moderéiert ze staark staining an op d'mannst 20% vun Zellen; Iwwer 3, staark staining an op d'mannst 50% vun Zellen. Fäll mat 0 oder 1+ staining sech als negativ klengen, a Fäll mat 2+ oder Iwwer 3 staining sech als positive klassifizéiert. VerfÜgung Mënscherechter VerfÜgung Zell Kultur gastric Kriibs Zell Linnen, MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 an MGC803 sech aus de Chiffer vun Zell Biologie, China Medical University, China kritt. Si waren cultured zu DMEM 10% An et Bovine serum wouvun, 100 U /ml vun penicillin, 100 ug /ml vun streptomycin bei 37 ° C an enger humidified Atmosphär vu 5% CO 2. D'Zellen sech fir zësummen 0,25% trypsin an 0,02 mol /L héich zu PBS dislodged benotzt. VerfÜgung Bau vun CTGF knockdown stabil Zell Linnen VerfÜgung Zwee kleng interfering RNS (siRNA) oligonucleotides Wierderbuch waren zwee verschidde Regiounen am CTGF ze viséieren cDNA: GTGCATCCGTACTCCCAAA (PSC1) an GCTAAATTCTGTGGAGTAT (PSC2). Si goufen an der siRNA Ausdrock Vecteure pGCsilencer ™ U6.Neo.GFP gekloonten. D'nonspecific siRNA war als negativ Kontroll (PSNC) benotzt. D'siRNA Ausdrock plasmids sech transfected an SGC7901 Zellen mat Lipofectamine 2000. D'Zellen sech mat G418 (800 ug /ml) opgefouert, an de Kolonien huet no 3 Wochen, alles vun RT-QPCR a Western blot erausgesicht. Zellen transfected mat PSC1, PSC2 oder PSNC sech PSC1 Zellen, PSC2 Zellen oder PSNC Zellen designéierte, bzw.. VerfÜgung Real-Time Chemeschen Polymerase Kettereaktioun (RT-QPCR) VerfÜgung Total RNS war vun Zell Pellets benotzt Trizol reagent isoléiert. Total RNS (1 ug) war mat engem RT (ëmgedréint transcriptase) Reaktioun Kit fir cDNA ëmgerechent. Real-Zäit Hinnen alleguer war no real-Zäit Hinnen alleguer System benotzt Mx3000P standing fir den Hiersteller d'Uweisunge an SYBR ® Premix ExTaq als DNA spezifesch unisse hannendrun. Hinnen alleguer war fir 5 ass fir 40 Zykle vun 95 ° C duerchgefouert an 60 ° C fir 40 ass. Primer Message sinn an Dësch 1. D'loung Zyklus (Kosovo) gewisen kritt an relativ Quantitéite sech fir all Prouf normalized zu GAPDH alles. Ausdrock vun mRNA sech mat der ΔΔCt Method [25] .Table 1 Hinnen alleguer Primer Message VerfÜgung berechent Gene
Primer Message (5'-3) Stiermer an Réckproduktioun
Product (bp)

CTGF
CTTGCGAAGCTGACCTGGAA
AAAGCTCAAACTTGATAGGCTTGGA
90
MMP-2
ATGACATCAAGGGCATTCAGGAG
TCTGAGCGATGCCATCAAATACA
135
MMP-3
GGGTGAGGACACCAGCATGA
CAGAGTGTCGGAGTCCAGCTTC
178
MMP-9
TCCCAGACCTGGGCAGATTC
GCAAAGGCGTCGTCAATCAC
124
Cyclin D1
GATGCCAACCTCCTCAACGAC
CTCCTCGCACTTCTGTTCCTC
171
GAPDH
GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
TGGTGAAGACGCCAGTGGA
138
Western blot Analyse VerfÜgung Stoffer oder Zellen sech am Ripa lysed Prellbock fir 30 min bei 4 ° C mat protease inhibitor Mëschung ergänzt. D'Zell lysates sech sonicated dann kuerz an centrifuged (14.000 g bei 4 ° C) fir 15 min insoluble Material ze läschen. Gläich Montanten vun FAQ sech duerch SDS-PAGE getrennt an zu enger PVDF Membran transferéiert. Schläimhait sech mat 5% nonfat dréchen Mëllech gespaart an dann mat éischte antibody, gefollegt vun horseradish peroxidase-conjugated Secondaire antibody incubated. Protein Bands sech duerch ECL chemiluminescence Method visualized. VerfÜgung Immunofluorescence an Confocal Imaging VerfÜgung D'Zellen op déngt-Tek Otemschwieregkeeten Kultur Chambre drënner waren am kal 100% methanol fix fir 10 min, an dann mat normal Geess serum gespaart fir 30 min . D'Zellen mat der Primärschoul antibody Nuecht op 4 ° C incubated waren, gewäsch 3 Mol am PBT (PBS mat 1 ‰ Triton X-100), an dann mat zweet antibody conjugated mat Rhodamine incubated. Den DNA Hoerfaarw DAPI war benotzt der DNA zu stain. Zellen sech op eng Leica Radioberäich SP2AOBS confocal microscope. VerfÜgung bedingt mëttelfristeg (CM) Kollektioun an Aktivitéit-Hausnummeren immunoassay (Elisa) VerfÜgung 3 × 10 5 Zellen sech zu 100 mm Otemschwieregkeeten Kultur Plat rakommen mat DMEM 10 wouvun % an et Bovine serum fir 2 Deeg. Dunn huet d'Zellen zweemol mat PBS gewäsch a mat 5 ml vun serum gratis DMEM incubated. 48 h drop, war d'bedingt mëttelfristeg gesammelt an op 2000 g fir 5 min centrifuged, duerch Filter (pore Gréisst, 0,45 bon) batter a gespäichert bei -80 ° C bis benotzen. VerfÜgung Den Niveau vun CTGF an der bedingt Medien aus gastric Kriibs Zell goufe mat mënschlechen Kit Quantikine Elisa gemooss folgenden d'Uweisungen d'Hiersteller. VerfÜgung MTT Prolifératioun assay VerfÜgung d'Méiglechen stoussen vun bewosst Prolifératioun war mat MTT évaluéieren [3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2 , 5-diphenyltrazolium bromide] assay. Ongeféier 5 × 10 3 Zellen sech rakommen an 96-gutt Kultur Telleren an cultured zu serum gratis DMEM fir 24, 48, 72, an 96 h, bzw.. Dunn incubated sech Zellen mat 20 μl MTT (10 mg /ml) fir 4 h bei 37 ° Cand 200 μl DMSO war pipetted fir 20 min bei Raumtemperatur der formazan Produit ze solubilize. D'optesch Dicht (sel) war bei enger Wellelängt vun 570 nm mat engem spectrophotometer (Bio-Rad) alles. VerfÜgung Kolonie Opstellung assay VerfÜgung 5 × 10 2 an 2 ml vun 0.3% suspendéiert Zellen agarose DMEM mëttel- mat 10% an et Bovine serum sech zu 6-gutt Placken op der erop plated vun bestehend 0.6% ënnen agarose mat der selwechter mëttelfristeg. D'Placke waren op 37 ° C an engem 5% CO 2 incubator incubated. No dräi Wochen, Zell Kolonien > 0,1 mm Duerchmiesser goufen ënner engem microscopic Terrain gezielt. VerfÜgung Zell Invasioun assay VerfÜgung D'Invasioun war vun enger Invasioun Chambre assay alles. Zellen (2 × 10 4) waren op der erop ëmkomm vun engem matrigel-Beschichtete 24-gutt rakommen micropore Membran filter mat 8 μm Pore an der leschter Chamber war mat 0,5 ml vun DMEM mat 10% An et Bovine serum als gefëllt chemoattractant. No incubating fir 24 h, Net-hypothetesch Zellen (ieweschte Chambre) huet andems e Koteng-harmlos Swab an hypothetesch Zellen (ënneschten Chambre) waren fix methanol an Kierchefënster mat trypan blo mat verbannen geläscht. D'invasiv ëmmer war fir 10 ënnerschiddleche Beräicher an all gutt vun der Zuel vun andeems Zellen ënnert engem microscope um 200 × Vergréisserung alles. VerfÜgung Chamber Migratioun assay VerfÜgung der Method vun kënschtlech Migratioun assay war en Net-matrigel-bedeckt mat 24-gutt Boyden ëmkomm (8 μm, Millipore). Zellen (2 × 10 4) waren op der Text vun 0,2 ml vun serum-gratis DMEM mëttelfristeg suspendéiert rakommen. Non-wanderen Zellen sech fir 24 h aus der ieweschter ëmkomm vun der filter der incubation geläscht. Migrated Zellen sech Kierchefënster an laachen iwwert déi Prozedur baséiert wéi virdrun beschriwwen. Triplicate assays sech fir all Grupp vun Zellen zu Invasioun an Migratioun assays gesuergt, an d'Resultater sinn ausdrécke wéi heescht ± Fils. VerfÜgung gelatin zymography VerfÜgung MMP-2 an MMP-9 Aktivitéit vun gelatin zymography alles war wéi virdru beschriwwen [ ,,,0],26]. An dowéinst, no centrifugation war d'supernatant getrennt an FAQ Konzentratioun alles; selwecht Héicht vun FAQ, Zousatz vun Prouf Prellbock (Tris-HCl 1 M, pH 6,8, Natrium dodecyl sulphate (SDS) 2%, glycerol 10%) waren zu 7.5% SDS-polyacrylamide gelies applizéiert mat 1 mg /ml gelatine. No electrophoresis, war SDS aus der gelies geläscht fir 1 h zweemol mat 2,5% TritonX-100 wäschen. No enger kuerzer Computer-, war d'gelies bei 37 ° C fir 18 h am Prellbock, pH 7,6 incubated, wouvun déi 100 mm Tris-HCl, 10 mm CaCl 2, 20 mm NaCl. D'gelies huet fir 2 h with1% Coomassie Brilliant Blue R250 Kierchefënster an duerno mat destaining Léisung (40% methanol, 10% acetic Seier, 50% destilléiert Waasser) traitéiert. Proteolytic Aktivitéit war wéi kloer Bands géint den Hannergrond stain vun undigested Realitéiten am gelies. VerfÜgung Déieren Etude vun peritoneal ofgestouss fonnt VerfÜgung Dës Experimenter am Aklang mat de Linne vun der Staat Food a Cargolux Administration (SFDA vu China erausgaange gehaal huet ). D'Déiere waren Haffbibliothéik Refuge fir am Aklang mat der vun der National Science Conseil vun Republik China etabléierten Richtlinnen. VerfÜgung Weiblech BALB /c Sauna Mais, 35-40 Deeg al a Persoun vu 20-22 g, vun Shanghai Slac schafft geliwwert goufen Déier Limited Company. De Mais goufen ënner steril Konditiounen gehaalen an z'iesse enger goen Maus Ernährung a Waasser. Déieren sech via inhalation vun isoflurance anaesthetized. PSC1, PSC2, PSNC an SGC7901 Zellen (1 × 10 7 Zellen) huet an 0,5 ml DMEM Sursis an an der postwendend misse Discours vun Test Mais inoculated. De Mais sech sechs Woche méi spéit geaffert, an all disseminated noverfollegt Moment op der mesentery an Blend bewäert huet. VerfÜgung statistique Analyse VerfÜgung All Wäerter an den Text an Zuelen sinn als mengen ± Fils presentéiert. Allgemeng Survival Tariffer benotzt Kaplan-Meier estimator sech, en Evenement, wéi Doud vum Kriibs soll féieren definéiert ginn. D'Logbuch-Platz Test war benotzt Gruppen ze identifizéieren Differenzen tëscht der Iwwerliewe Kéiren vun verschidden Patienten. An univariate Analyse, 2-tailed χ 2 Tester fir Diskussioun Verännerlechen an 2-tailed t Test fir eng kontinuéierlech Verännerlechen fir statistesch Vergläicher benotzt goufen. Wäerter vun p VerfÜgung &Si besteet; 0,05 sech geholl e wesentlechen Ënnerscheed tëscht Mëttelen ze weisen. VerfÜgung Resultater VerfÜgung CTGF ass zu gastric Cancers a soll mat clinicopathological Charakteristike vun gastric Kriibs overexpressed Patienten VerfÜgung Mir der CTGF Ausdrock vun gastric Kriibs Stoffer sech an distal normal Stoffer reagéiert . Figur 1A illustréiert CTGF Ausdrock zu fënnef Borschte Patienten. Nik Niveau vun CTGF FAQ waren am mënschleche gastric Kriibs Stoffer Verglach mat der vläit normal Stoffer aus der Patienten fonnt. Dëst war och déi immunohistochemical staining (Dorënner 1B) confirméiert. Desweideren, déi Korrelatioun tëscht Ausdrock vun CTGF an clinicopathological Fonctiounen fir weider z'ënnersichen, 110 Echantillon sech fir seng Examen mat immunohistochemical staining benotzt. Statistesch Analyse réischt positive CTGF Ausdrock vill mat histologic Schouljoer, lymph Node Metastasen an peritoneal Weiderleede verbonne war am Verglach mat deene Patiente mat negativen CTGF Ausdrock (Table 2). Positiv CTGF Ausdrock war méi dacks zu Fäll vu lymph Wirbelen Metastasen (P = 0,012) fonnt. Niveau vun CTGF Ausdrock sech däitlech zu Strenz gastric Cancers fräi Verglach mat aneren ënnerscheet gastric Cancers (P = 0.039). An der Expressioun vun CTGF FAQ war vill mat der Entwécklung vun peritoneal Weiderleede vun gastric Kriibs (P = 0.011) soll. Verrechne vun den Iwwerliewe Dauer vun den 110 Équipe Patienten vun der Kaplan-Meier Method verroden, datt d'Patienten, déi CTGF-positiv erhéijen souzen eng kuerz Iwwerliewe bewisen, wou am Verglach mat deene Patienten, déi aus CTGF-negativ erhéijen (Dorënner 1c, P &Si besteet gelidden; 0,001 ). Figur 1 Overexpression vun CTGF zu gastric Kriibs mat verschlechtert hätt. A. Western blot Analyse Gewise CTGF Ausdrock vun gastric Kriibs Stoffer a reagéiert distal normal Stoffer aus fënnef zoufälleg gastric Kriibs Patienten ausgewielt. B. Immunohistochemistry Resultater vun CTGF Ausdrock an vläit gastric Kriibs Otemschwieregkeeten Echantillon. C. Kaplen-Meir Iwwerliewe Kéiren fir 110 Patienten mat gastric Kriibs, gruppéiere no CTGF Ausdrock. VerfÜgung Table 2 Association tëscht CTGF Ausdrock an clinicopathologic Charakteristiken vun Patienten mat gastric Kriibs (n = 110) VerfÜgung zu CTGF Ausdrock
zu zu Negativ VerfÜgung positiv VerfÜgung P Wäert

Geschlecht VerfÜgung Männlech VerfÜgung 33 zu 34 VerfÜgung 0,779 VerfÜgung Weiblech VerfÜgung 20 zu 23 VerfÜgung Alter (Joer) VerfÜgung ≤ 65 zu 35 VerfÜgung 40 VerfÜgung 0,642 VerfÜgung > 65 zu 18 zu 17 VerfÜgung entholl Gréisst (cm) VerfÜgung &Si besteet; 5 zur VerfÜgung 26 zu 25 VerfÜgung 0,585 VerfÜgung ≥ 5 zur VerfÜgung 27 zu 32 VerfÜgung entholl Standuert VerfÜgung niddreg VerfÜgung 42 zu 37 VerfÜgung 0,413 VerfÜgung Mëtt VerfÜgung 5 zur VerfÜgung 8 VerfÜgung Uewerstad VerfÜgung 3 VerfÜgung 6 VerfÜgung ganze VerfÜgung 3 VerfÜgung 6 VerfÜgung Histologic Schouljoer VerfÜgung ënnerscheet VerfÜgung 26 zu 17 VerfÜgung 0,039 * VerfÜgung Strenz VerfÜgung 27 zu 40 VerfÜgung Lauren Schouljoer VerfÜgung Intestinal VerfÜgung 28 zu 21 VerfÜgung 0,108 VerfÜgung Firwat VerfÜgung 25 zu 36 VerfÜgung Lymph Node Metastasen VerfÜgung Negativ VerfÜgung 23 zu 12 VerfÜgung 0,012 * VerfÜgung positiv VerfÜgung 30 zu 45 VerfÜgung TNM Etapp VerfÜgung ech VerfÜgung 11
8 VerfÜgung 0,080 VerfÜgung II VerfÜgung 15 VerfÜgung 9 VerfÜgung III 20
22 VerfÜgung IV VerfÜgung 7 VerfÜgung 18 VerfÜgung Hepatic Metastasen VerfÜgung negativ VerfÜgung 50 zu 55 VerfÜgung 0,588 VerfÜgung positiv VerfÜgung 3 VerfÜgung 2 VerfÜgung Peritoneal Weiderleede VerfÜgung negativ VerfÜgung 50 zu 44 VerfÜgung 0,011 * VerfÜgung positiv VerfÜgung 3 VerfÜgung 13 VerfÜgung * P &Si besteet; 0,05; CTGF, connective Otemschwieregkeeten Wuesstem Faktor. VerfÜgung Expression vun CTGF zu Mënsch gastric Kriibs Zell Linnen an siRNA-mediated Hammers VerfÜgung Éischt, mir iwwerpréift CTGF Ausdrock zu sechs gastric Kriibs Zell Linnen (MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 an MGC803) vun Western blot. CTGF war an all Zell Linnen bewäert fonnt, a mat SGC7901 Zellen den héchsten Niveau (Dorënner 2A) ausdrécken. Dofir, goufen SGC7901 Zellen als Modell fir d'Kierzunge Funktioun Studien ausgewielt. Well biologically aktiv CTGF souwuel secreted ass an an der Zytoplasma ausgedréckt [8, 27], mir gemooss och den Niveau vun secreted CTGF an der bedingt Medien vun dësen gastric Kriibs Zell Linnen vum Elisa, déi mat de Niveau vun CTGF an der Zytoplasma coincided war vun vunenee Linn (Dorënner 2B). Figur 2 Expression vun CTGF zu gastric Kriibs Zell Linnen an knockdown vun CTGF vun siRNA. A. Western blot den Ausdrock vun CTGF zu 6 gastric Kriibs Zell Linnen weist. GAPDH als FAQ Luede Kontroll. B. CTGF zu bedingt Medien vun 6 gastric Kriibs Zell Linnen a stabil transfected Zellen war vun Elisa analyséiert. Resultater sinn ausdrécke well PG /ml /1 × 106cells (mengen ± Fils, n = 4). C. Western blot Analyse vun CTGF FAQ Ausdrock vun SGC7901, PSNC an CTGF knockdown stabil Zell Linnen (PSC1 an PSC2). D. Immunofluorescence Analyse vun CTGF Ausdrock. E. RT-QPCR weist CTGF mRNA Niveauen am SGC7901, PSNC an CTGF knockdown stabil Zell Linnen (PSC1 an PSC2). Date sinn als eng fantastesch änneren relativ ausgedréckt ze kontrolléieren (Kontroll ass SGC7901). Wäerter sinn als mengen ± Fils vun dräi Experimenter entscheet. * P &Si besteet; 0,05 als Verglach ze kontrolléieren. VerfÜgung Fir d'Funktioun vun CTGF zu SGC7901 Zellen Etude, déi CTGF knockdown stabil Zell goufe benotzt der silencing Effekt ze analyséieren. Als zu Dorënner 2B gewisen, war de Niveau vun secreted CTGF an der bedingt mëttelfristeg ofgeholl vill an der siRNA-stabil transfected Zellen am Verglach zu Kontroll. Western blot an immunofluorescence staining zougedréckt datt Ausdrock vun CTGF FAQ am Zytoplasma Ofstand zu der CTGF knockdown stabil Zell Linnen (Dorënner 2C, D) ofgeholl. Doriwwer eraus, war et ofgeholl den Ausdrock vun CTGF mRNA och vill zu der CTGF knockdown stabil Zell Linnen (Dorënner 2E). VerfÜgung Knockdown vun CTGF Ausdrock de Wuesstem vun gastric Kriibs Zellen bremst VerfÜgung D'Kolonie Opstellung assay benotzt gouf de Wuesstem ze diskutéieren vun den Zellen zu wat CTGF entsat war. Als zu Dorënner 3A gewisen, CTGF knockdown stabil Zellen (PSC1 an PSC2) bedeitend manner Kolonien op mëll Agar geformt Verglach zu SGC7901 an PSNC Zellen (83 ± 10, 90 ± 15 versus 30 ± 7 an 20 ± 5, respektiv). Fir weider den negativen Effet vun CTGF knockdown Test op gastric Kriibs Zell Wuesstem, war MTT assay standing a Wuesstem Kéieren waren entsteet (Dorënner 3B). Wéi déi vun de Kéieren gewisen, proliferated souwuel PSC1 an PSC2 Zellen lues wéi PSNC Zellen an SGC7901 Zellen während den éischten 96 h no der Zellen plated goufen. Déi dramatesch Reduktioun vun Amphipolis Équipe an Wuesstem vun CTGF entsat Zellen ugeholl CTGF Ennerdréckung negatif gastric Kriibs Zell Wuesstem regléieren kéint. RT-QPCR zougedréckt datt mRNA Niveau vun Zell Zyklus Zesummenhang FAQ cyclin D1 verwandelt an déi zwee CTGF knockdown regulariséiert goufen stabil Zell Linnen Verglach mat PSNC an SGC7901 (Dorënner 3C). Konsequent mat dësem Resultat, observéiert mir eng schéi Reduktioun vun cyclin D1 FAQ Ausdrock vun CTGF knockdown Zellen PSC1 an PSC2 (Dorënner 3D). Spannen, Behandlung mat bedingt mëttel- vun SGC7901 déi eng grouss Quantitéit vun CTGF secreted konnt de cyclin D1 downregulation a restauréiert der Zell Verbreedung zu CTGF knockdown stabil Zellen ze retten. Dës Donnéeë uginn dass CTGF Ennerdréckung negatif gastric Kriibs Zell Wuesstem regléieren kéint an cyclin D1 Ausdrock erofgoen. Figur 3 Knockdown vun CTGF Ausdrock bremst den Wuesstem vun gastric Kriibs Zellen. A. Kolonie Opstellung assay. B. MTT Prolifératioun assay. C. Knockdown vun CTGF verwandelt der mRNA Niveau vun cyclin D1 reegelen. D. Knockdown vun CTGF verwandelt d'FAQ Niveau vun cyclin D1 reegelen. PSC1 /PSC2 + CM vun SGC7901: PSC1 oder PSC2 Zellen sech mat bedingt mëttelfristeg (CM) vun SGC7901 incubated. All Resultater goufen reproducible zu dräi onofhängeg Experimenter. * P &Si besteet; 0,05 als Verglach ze kontrolléieren (Kontroll ass SGC7901). VerfÜgung Knockdown vun CTGF Ausdrock bremst d'Wanderung an Invasioun vun gastric Kriibs Zellen VerfÜgung Zell Wanderung an Invasioun si kritesch Prozesser an entholl Metastasen. Mir propagéieren Zell Wanderung duerch Nët-matrigel-Beschichtete Boyden ëmkomm an Zell Invasioun vun matrigel-Beschichtete Invasioun Chambre assays, bzw.. An der Migratioun assays (Dorënner 4A), Migratioun Taux vun der PSC1 an PSC2 Zellen sech ofgeholl däitlech wann Verglach ze kontrolléieren (P &Si besteet; 0,05). Als zu Dorënner 4B gewisen, och CTGF knockdown Ofstand reduzéiert Eegeschafte Zell Invasioun wéini Kontroll Verglach. Zell Invasioun Tariffer vun PSC1 an PSC2 Zellen sech vun 61,4% a 55,8% erofgaangen, bzw.. RT-QPCR a Western blot zougedréckt datt MMP-2 an MMP-9 waren reegelen verwandelt an déi zwee stabil clones Verglach mat Kontroll Zellen (Dorënner 4C; D). Am Géigesaz, MMP-3 hutt änneren net vill souwuel mRNA an FAQ Niveauen. Ausserdeem, zougedréckt zymography Analyse de Aktivitéite vun béiden MMP-2 an MMP-9 an der siRNA-stabil transfected Zellen sech wesentlech méi niddreg wéi déi vun der Kontroll Zellen (Dorënner 4E). Spannen, Behandlung mat bedingt mëttel- vun SGC7901 déi eng grouss Quantitéit vun CTGF secreted entschlof de bass-Ausdrock vun MMP-2 an MMP-9 a restauréiert der Migratioun an Invasioun vun der CTGF knockdown stabil Zellen. Dës Resultater ugeholl datt knockdown vun CTGF Ausdrock der Migratioun an Invasioun vun gastric Kriibs Zellen reduzéiert a rofgaang ass d'Expressioun vun MMP-2 an MMP-9. Figur 4 Knockdown vun CTGF Ausdrock bremst d'Wanderung an Invasioun vun gastric Kriibs Zellen. A. Zell Migratioun assay. B. Zell Invasioun assay. Migratioun an Invasioun Zellen sech fest an Kierchefënster, a Vertrieder Felder goufen fotografeschen. Fir quantification, goufen d'Zellen zu 10 ënnerschiddleche Beräicher ënner engem Liicht microscope (× 200) gezielt. Triplicate assays sech fir all Grupp vun Zellen zu Invasioun an Migratioun assays gesuergt, an d'Resultater ausgedréckt sinn als ± Fils heescht. C. RT-QPCR war fir Analys der mRNA Ausdrock vun MMP-2 gemaach, MMP-3, an MMP-9 an der CTGF knockdown stabil Zell Linnen a Kontroll Zellen. Erausgoen vertrieden mengen ± Fils vun dräi Experimenter. D. D'FAQ Niveau vun MMP-2, MMP-3, an MMP-9 sech duerch Western blot fonnt. GAPDH als FAQ Luede Kontroll. E. gelatin zymography Analyse fir d'Aktivitéite vun MMP-2 an MMP-9. PSC1 /PSC2 + CM vun SGC7901: PSC1 oder PSC2 Zellen sech mat bedingt mëttelfristeg incubated (CM) vun SGC7901 * P &Si besteet;. 0,05 als ze kontrolléieren Verglach (Kontroll ass SGC7901). VerfÜgung Downregulation vun CTGF peritoneal Weiderleede vun gastric Kriibs bremst zu VIVO VerfÜgung Fir d'Auswierkunge vun CTGF op der peritoneal Weiderleede vun gastric Kriibs Zellen zu VIVO beschen, inoculated mir verschidden Zellen an Sauna Mais. SGC7901 Zellen, Kontroll stabil Zell Linn (PSNC), an CTGF knockdown stabil Zellen (PSC1 an PSC2) waren an véier trennen Gruppe vun Sauna Mais heijen. Als Konsequenz vun esou behandelt, déi miessbar Ennerdréckung vun peritoneal Verbreedung zu Mais mat CTGF knockdown stabil Zellen heijen als Verglach mat deene heijen mat SGC7901 Zellen oder PSNC Zellen war bemierken (Dorënner 5A). Quantitativ inoculated fir Test Mais 117 ± 20 disseminated noverfollegt mat SGC7901 Zellen an 137 ± 26 disseminated Véi fir Mais mat PSNC Zellen inoculated huet sech feststellen bemierken. Am Géigesaz, bedeitendst sech manner disseminated Véi konnt fir Mais mat CTGF knockdown stabil Zellen (Dorënner 5B) heijen observéiert ginn. Figur 5 Knockdown vun CTGF bremst gastric Kriibs SGC7901 xenograft peritoneal anzebezéien. SGC7901, PSNC an CTGF knockdown stabil Zell Linnen (PSC1 an PSC2) waren intraperitoneally heijen wéi ënner "Material a Methoden" beschriwwen. 6 Woche méi spéit, huet de Mais geaffert fotografeschen, Leschten an all disseminated noverfollegt Moment op der mesentery an Blend goufen gezielt. A. D'Foto vun Sauna Mais mat peritoneal Weiderleede vun all Grupp. B. D'disseminated Véi ukomm waren bewäert. All Bar duerstellt der heeschen ± Fils (n = 5 fir all Grupp). * P &Si besteet; 0,05 als Verglach ze kontrolléieren (Kontroll ass SGC7901). VerfÜgung Diskussioun VerfÜgung De stäerkste extensiv Literatur zu Datum CTGF iwwert definéiert seng Roll am Meter-Heelung a fibrotic Krankheet. Kuerzem, implicate puer Studien CTGF zu entholl Entwécklung an entholl Zell Iwwerliewe [28-30]. Trotzdeem ass, ass déi exakt Roll vun CTGF zu entholl Werdegang net definitiv, an d'Funktioun vun CTGF zu entholl Zell Biologie vun gastric Kriibs huet net grëndlech ënnersicht ginn. Fir dës Problemer Adress, mir bewäert CTGF Ausdrock zuer méiglech direkt kennenzeléieren mat Zell Wuesstem an Invasioun vun gastric Kriibs Zellen. Desweideren, weider mir d'Effete vun CTGF op peritoneal Weiderleede vun gastric Kriibs Zellen zu VIVO propagéieren. VerfÜgung An dëser Etude, eis Resultater weisen, datt CTGF héich zu gastric Kriibs Stoffer Verglach mat reagéiert normal gastric Stoffer ausgedréckt huet. Den Ausdrock vun CTGF zu Strenz gastric Kriibs war méi héich wéi déi vun aneren ënnerscheet gastric Kriibs. D'CTGF Ausdrock vun entholl Otemschwieregkeeten war mat lymph Node Metastasen an peritoneal Weiderleede assoziéiert. Ausserdeem, Patienten mat positive CTGF Ausdrock hu vill manner entwéckele Thes 5 Joer Iwwerliewe Tarif (22.9%) wéi déi mat negativen CTGF Ausdrock (48.1%, Dorënner 1c). Dës Resultater ugeholl datt CTGF kéint zu Werdegang an Metastasen vun gastric Kriibs Équipe ginn. Desweideren, kéint CTGF eng nëtzlech prognostic Bissau ginn. VerfÜgung puer rezent Studien hunn bekannt ginn dass CTGF Zell Wuesstem zu esophageal Kriibs Zellen an pancreatic Kriibs Zellen [20, 30] regléieren. Allerdéngs ass, wéineg iwwert den Effet vun CTGF Ausdrock op Zell Wuesstem vun gastric Kriibs Zellen bekannt. Eis Resultater weisen, datt CTGF Ennerdréckung schéinen inhibition vun Zell Prolifératioun an clonogenic Wuesstem. Ännerungen am Zell Wuesstem kéint Schlësselelement ginn an Regulatioun Kriibs Werdegang [31].

• Héich Zuel vun Helicobacter pylori CagA EPIYA C phosphorylation Siten erhéigt de Risiko vun gastric Kriibs, mä net ausléisen ulcer
• DNA Kopie Zuel Profiler vun gastric Kriibs Virleefer lesions