Das Herunterregulieren des Bindegewebes Wachstumsfaktor Gewebe hemmt das Wachstum und Invasion von Magenkrebszellen und dämpft Peritonealdialyse dissemination

Herunterregulieren von Bindegewebe-Wachstumsfaktor das Wachstum und die Invasion von Magenkrebszellen hemmt und dämpft Peritonealdialyse Verbreitung
Zusammenfassung
Hintergrund
Connective Gewebewachstumsfaktor (CTGF) wurde in der Tumorentwicklung und das Fortschreiten gebracht zu zeigen. Allerdings bleibt die Rolle von CTGF bei Magenkrebs weitgehend unbekannt.
Ergebnisse dieser Studie
haben wir gezeigt, dass CTGF hoch war im Magenkrebsgewebe verglichen mit angepassten normalen Magengewebe exprimiert wird. Die CTGF-Expression in Tumorgewebe wurde mit histologischen Grad, Lymphknotenmetastasen und peritonealer Verbreitung (P < 0,05) zugeordnet ist. Patienten mit positiven CTGF-Expression signifikant niedrigere kumulative postoperativen 5 Jahre Überlebensrate als solche mit negativem CTGF-Expression (22,9% versus 48,1%, p < 0,001). Wir haben gezeigt, dass die Zuschlags von CTGF-Expression signifikant gehemmt Zellwachstum von Magenkrebszellen und verringert Cyclin D 1-Expression. Außerdem Zuschlagsausdrucks CTGF reduziert deutlich die Migration und Invasion von Magenkrebszellen und verringert die Expression von Matrix-Metalloproteinase (MMP) -2 und MMP-9. Tierstudien zeigten, dass Nacktmäuse injiziert mit der CTGF Knockdown stabilen Zelllinien eine geringere Anzahl von peritonealen seeding Knötchen als die Kontrollzelllinien gekennzeichnet.
Schlussfolgerungen
Diese Daten legen nahe, dass CTGF eine wichtige Rolle in Zellwachstum und Invasion spielt in menschlichen Magenkrebs und es scheint, mit Magenkrebs ein potentieller prognostischer Marker für Patienten.
Schlüsselwörter Connective tissue growth factor Magentumoren Zellproliferation Tumorinvasivität Peritonealdialyse Verbreitung Einführung
Trotz bedeutender Fortschritte in der Krebsforschung, Krebs bleibt ein weltweiten Gesundheitsproblem und Mortalität aufgrund von Krebs bleibt hoch [1]. Magenkrebs ist die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle in der Welt, während es einen rückläufigen Trend bei Auftreten zu sein scheint, vor allem in den westlichen Ländern; es ist immer noch allgemein in China und Japan berichtet [2, 3]. Auch wenn die Prognose von Patienten mit fortgeschrittenem Magenkrebs scheint, als Folge der Standardisierung der Operationstechniken und die jüngsten Fortschritte in der Chemotherapie verbessert zu haben, die 5-Jahres-Überlebensrate der postoperativen bleibt niedrig [4, 5]. Peritoneale Metastasen ist die häufigste und wesentliche Ursache für die Sterblichkeit nach der Operation für Magenkrebs [6, 7]. Jedoch haben die Mechanismen der peritonealen Metastasierung nicht eindeutig definiert.
Connective tissue growth factor (CTGF), auch als CCN2 bekannt, ein Mitglied der CCN-Familie, einschließlich Cystein-reichen Proteins 61 (Cyr61), auch bekannt als CCN1 und Nephroblastoms-over exprimierten Gen (Nov), auch als CCN3 bekannt sowie Wisp-1 /elm1 (CCN4), Wisp-2 /rcop1 (CCN5) und Wisp-3 (CCN6) [8, 9]. CTGF wird angenommen, dass ein multifunktionales Signalmodulator in einer Vielzahl von biologischen oder pathologischen Prozessen, wie Angiogenese, Osteogenese, Fibrose in den Nieren und der Haut, und die Tumorentwicklung [10-12] beteiligt. Obwohl die Rolle der CCN2 in fibrosis normalem Gewebe gut untersucht wurde [13], ist die Funktion der CCN2 in Krebs nicht gut verstanden. Interessanterweise wurde als ein Onkogen in einer Vielzahl von Krebsarten CCN2 identifiziert, aber ist ein Tumor-Suppressor-Gen in anderen Formen von Krebs [14] betrachtet. Die Überexpression von CTGF ist bei Prostatakrebs [15], Gliomen [16], Brustkrebs [17] und Erwachsenen akute lymphatische Leukämie [18] gefunden. Erhöhte CTGF-Expression wurde mit der Progression der zervikalen Tumoren [19], und Plattenepithelkarzinom des Ösophagus [20] in Verbindung gebracht worden. Umgekehrt in Lungenadenokarzinomen [21] und Kolonkarzinomen [22], die Überexpression von CTGF Invasivität und Metastasierung von Krebszellen hemmt sowohl in vitro als auch in vivo.
Klinische Studien haben gezeigt, dass die Überexpression von CTGF gezeigt signifikant mit Lymphknoten korrelierte Metastasierung und schlechter Prognose bei Patienten mit Magenkrebs [23, 24]. Jedoch ist die genaue Rolle von CTGF in Magenkrebs noch unbekannt. In dieser Studie haben wir festgestellt CTGF-Expression in Magenkrebsgewebe. Wir fanden, dass CTGF wurde bei Magenkrebs überexprimiert wird, und seine Expression wurde mit aggressivem Verhalten von Magenkrebs in Verbindung gebracht. Wir haben dann siRNA-Technologie, um endogene CTGF-Expression in Magenkrebszellen Knockdown. Wir haben gezeigt, dass die Herunterregulierung von CTGF das Wachstum und die Invasion von Magenkrebs in vitro gehemmt und abgeschwächten Peritonealdialyse Verbreitung in vivo. Unsere Studie unterstreicht nachdrücklich die Bedeutung von CTGF in das Wachstum und die Invasion von Magenkrebs, und ein therapeutisches Ziel bei Magenkrebs liefern.
Materialien und Methoden
Reagenzien
Dimethylsulfoxid (DMSO) und Trypsin aus gekauft wurden, Sigma (St. Louis, MO, USA). DMEM, Streptomycin und andere Zellkultur Lieferungen waren von GibcoBRL (Grand Island, NY, USA). Fötales Rinderserum wurde von Hyclone (Logan, UT, USA). MTT [3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltrazolium Bromid] wurde von Fluka (Ronkonkoma, NY, USA) erhalten. CTGF, Cyclin D1, Matrix-Metalloproteinase (MMP) -2, MMP-3, MMP-9 und GAPDH primärem Antikörper sowie zweite Antikörper Rhodamin (TRITC) konjugiertem AffiniPure Ziege-anti-Maus-IgG von Santa Cruz Biotechnology erhalten wurden (Santa Cruz, CA, USA). D (Minneapolis, MN, USA); CTGF-ELISA-Kit wurde von R &gekauft. Trizol und Lipofectamine 2000 wurden von Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) erworben. SYBR @ Primescript ™ RT-PCR Kit wurde von Takara Biotechnology, Japan.
Gewebeproben und immunhistochemischen Färbung
Tumorproben von 110 Patienten mit Magenkrebs erhalten wurden, die eine Operation an der Klinik für Chirurgie und Chirurgische Onkologie unterzog, Erste Affiliated Hospital der China Medical University im Zeitraum 2003-2005. Alle Patienten wurden gastrctomy, und ihre klinische und pathologische Daten zur Verfügung standen. Normale Magengewebe wurden von dem angepassten distalen reseziert Marge von Magenkrebs Proben entnommen. Alle chirurgischen Proben wurden von erfahrenen Pathologen untersucht und das distale reseziert Rand war tumorfrei. Die frischen Gewebe wurden in kleine Stücke geschnitten, schockgefroren in flüssigem Stickstoff sofort und bei -80 ° C bis zur Proteinextraktion gespeichert. Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Universität China überprüft und genehmigt.
Zur immunhistochemischen Färbung, 4 um histologische Schnitte mit Xylol und rehydratisiert durch eine abgestufte Reihe von Alkohol entparaffiniert wurden. Die Schnitte wurden dann in 0,01 M Citrat-Puffer für 10 min gekocht und endogene Peroxidase durch Inkubation in 0,3% H 2 O 2 in Methanol für 30 min blockiert. Unspezifische Bindung wurde 30 min bei Raumtemperatur durch Inkubieren Objektträger mit normalem Ziegenserum blockiert. Die Schnitte wurden über Nacht bei 4 ° C mit 01.50 Verdünnung von CTGF primären Antikörper inkubiert. Die Schnitte wurden für 1 h an Biotin-markierten sekundären Antikörper ausgesetzt wird, an eine Streptavidin-Peroxidase-Reaktionssystem, und dann mit DAB- H entwickelt 2 O 2. Die Färbung wurde auf der folgenden Skala bewertet: 0, keine Färbung; 1+, minimal-Färbung; 2+, mäßige bis starke Färbung in mindestens 20% der Zellen; 3+, eine starke Färbung in mindestens 50% der Zellen. Fälle mit 0 oder 1+ Färbung wurden als negativ eingestuft, und Fälle, mit 2+ oder 3+ Färbung wurden als positiv eingestuft.
Mensch
Zellkultur Magenkrebszelllinien, MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 und MGC803 wurden von der Abteilung für Zellbiologie, China Medical University, China erhalten. Sie wurden in DMEM, das 10% fötales Rinderserum, 100 U /ml Penicillin, 100 ug /ml Streptomycin bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2. Die Zellen wurden für die Subkultur 0,25% Trypsin und 0,02 mol /L EDTA in PBS abgelöst werden.
Konstruktion von CTGF Knockdown stabilen Zelllinien
Zwei small interfering RNA (siRNA) Oligonucleotide synthetisiert wurden zwei verschiedene Bereiche in der CTGF Ziel cDNA: GTGCATCCGTACTCCCAAA (PSC1) und GCTAAATTCTGTGGAGTAT (PSC2). Sie wurden in die siRNA-Expressionsvektor pGCsilencer ™ U6.Neo.GFP geklont. Die unspezifische siRNA wurde als negative Kontrolle (PSNC) verwendet. Die siRNA-Expressionsplasmide wurden Transfektion in SGC7901 Zellen unter Verwendung von Lipofectamin 2000. Die Zellen wurden mit G418 (800 ug /ml) gesiebt und die Kolonien wurden nach 3 Wochen, bestimmt durch RT-qPCR und Western-Blot gepflückt. Zellen, die mit PSC1, PSC2 oder PSNC wurden PSC1 Zellen PSC2 Zellen oder PSNC Zellen bezeichnet sind.
Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)
Gesamt-RNA wurde aus den Zellpellets mit Trizolreagenz isoliert. Die Gesamt-RNA (1 ug) wurde unter Verwendung eines RT (reverse Transkriptase) Reaktions-Kits in cDNA umgewandelt. Echtzeit-PCR wurde gemäß Echtzeit-PCR-System Mx3000P auszuführenden Anweisungen des Herstellers und SYBR ® Premix ExTaq als DNA spezifischen Fluoreszenzfarbstoffs. PCR wurde für 5 s für 40 Zyklen von 95 ° C und 60 ° C für 40 s. Primersequenzen sind in der Tabelle 1. Die Schwellenzyklus (Ct) gezeigt, wurde erhalten und relativen Mengen wurden für jede Probe normiert auf GAPDH bestimmt. Ausdrücke von mRNA wurden unter Verwendung des ΔΔCt-Methode [25] .Tabelle 1 PCR-Primer-Sequenzen
berechnet Gene
Primer-Sequenzen (5'-3 ') vorwärts und rückwärts
Produkt (bp)

CTGF
CTTGCGAAGCTGACCTGGAA
AAAGCTCAAACTTGATAGGCTTGGA
90
MMP-2
ATGACATCAAGGGCATTCAGGAG
TCTGAGCGATGCCATCAAATACA
135
MMP-3
GGGTGAGGACACCAGCATGA
CAGAGTGTCGGAGTCCAGCTTC
178
MMP-9
TCCCAGACCTGGGCAGATTC
GCAAAGGCGTCGTCAATCAC
124
Cyclin D1
GATGCCAACCTCCTCAACGAC
CTCCTCGCACTTCTGTTCCTC
171
GAPDH
GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
TGGTGAAGACGCCAGTGGA
138
Western blot analysis
Gewebe oder Zellen wurden in RIPA-Puffer lysiert für 30 min bei 4 ° C mit Protease-Inhibitor-Mischung ergänzt. Die Zell-Lysate wurden mit Ultraschall behandelt, dann kurz und zentrifugiert (14.000 g bei 4 ° C) für 15 min unlösliche Materialien zu entfernen. Gleiche Mengen an Protein wurden durch SDS-PAGE getrennt und auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Membranen wurden mit 5% fettfreier Trockenmilch blockiert und dann mit dem ersten Antikörper, gefolgt von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem sekundärem Antikörper inkubiert. Proteinbanden wurden durch ECL Chemilumineszenz-Methode sichtbar gemacht.
Immunfluoreszenz und konfokale Bildgebung
die Zellen auf Lab-Tek Gewebekulturkammer Objektträger wurden in kaltem 100% Methanol fixiert für 10 min und dann mit normalem Ziegenserum blockiert 30 min . Die Zellen mit dem primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C inkubiert, gewaschen, 3-mal in PBT (PBS mit 1 ‰ Triton X-100), und dann mit dem zweiten Antikörper konjugiert mit Rhodamine inkubiert. Der DNA-Farbstoff DAPI wurde verwendet, um die DNA zu färben. Zellen wurden auf einem Leica abzubildenden SP2AOBS konfokalen Mikroskop.
Konditioniertes Medium (CM) Erheben und Enzyme-Linked Immunoassay (ELISA)
3 x 10 5-Zellen wurden in 100 mm-Gewebekulturschale ausgesät mit DMEM, enthaltend 10 % fötalem Rinderserum für 2 Tage. Dann wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit 5 ml serumfreiem DMEM inkubiert. 48 h später wurde das konditionierte Medium gesammelt und bei 2000 g für 5 min zentrifugiert, durch Filter (Porengröße 0,45 um) geführt und gelagert bei -80 ° C bis zur Verwendung., Die Niveaus von CTGF in den konditionierten Medien von Magenkrebs-Zelllinien wurden unter Verwendung von humanem Quantikine Kit ELISA gemessen nach den Anweisungen des Herstellers.
MTT Proliferationsassay
der Fähigkeit, die Zellproliferation wurde unter Verwendung von MTT untersucht [3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2 5-diphenyltrazolium Bromid] Test. Etwa 5 × 10 3 Zellen wurden in 96-Well-Kulturplatten und kultiviert in serumfreiem DMEM für 24, 48, 72 und 96 h, respectively. Dann inkubiert wurden die Zellen mit 20 ul MTT (10 mg /ml) für 4 h bei 37 ° C und 200 &mgr; l DMSO pipettiert für 20 min bei Raumtemperatur die Formazan-Produkt zu solubilisieren. Die optische Dichte (OD) wurde bei einer Wellenlänge von 570 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers (Bio-Rad) bestimmt.
Koloniebildungstest
5 x 10 2 in 2 ml 0,3% Agarose suspendierten Zellen DMEM-Medium enthaltend 10% fötales Rinderserum wurden in 6-Well-Platten auf der Oberseite plattierten bestehender 0,6% Agarose unten mit dem gleichen Medium. Die Platten wurden bei 37 ° C in einer 5% CO 2 -Inkubator inkubiert. Nach drei Wochen Zellkolonien > 0,1 mm Durchmesser wurden unter einem mikroskopischen Bereich gezählt.
Zellinvasion Assay
Die Invasion wurde durch eine Invasion Kammer-Test bestimmt. Zellen (2 × 10 4) wurden auf die obere Kammer eines Matrigel beschichteten 24-well ausgesät Mikropore Membranfilter mit 8 um Poren und die untere Kammer wurde mit 0,5 ml DMEM mit 10% fötalem Rinderserum als ein gefülltes chemische Lockstoffe. Nach Inkubation für 24 h, nicht-eindringenden Zellen (obere Kammer) wurden unter Verwendung eines Wattestäbchen und eindringenden Zellen (untere Kammer) wurden fixiert und gefärbt mit Methanol unter Verwendung von Trypanblau sanft entfernt. Die invasive Fähigkeit wurde 10 Zufallsfelder in jeder Vertiefung durch die Anzahl der eindringenden Zellen unter einem Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung bestimmt.
Kammer Migrationstest
Das Verfahren der In-vitro-Migrationstest wurde eine nicht-matrigel beschichtet 24-Well-Boyden-Kammer (8 &mgr; m, Millipore). Zellen (2 × 10 4) wurden auf die Einsätze in 0,2 ml serumfreiem DMEM-Medium suspendiert beimpft. Nicht-migrierenden Zellen wurden für 24 h von der oberen Kammer des Filters nach Inkubation entfernt. Gewanderten Zellen wurden gefärbt und quantifiziert auf dem Verfahren basiert, wie zuvor beschrieben. Assays wurden dreifacher Ausfertigung für jede Gruppe von Zellen in Invasion und Migrationsassays durchgeführt, und die Ergebnisse sind ausgedrückt als Mittelwert ± SD.
Gelatin Zymographie
MMP-2 und MMP-9-Aktivität durch Gelatine-Zymographie wurde bestimmt, wie zuvor beschrieben [ ,,,0],26]. Kurz gesagt, nach der Zentrifugation wurde der Überstand abgetrennt und die Proteinkonzentration bestimmt wird; gleiche Mengen an Protein, hinzugefügt von Probenpuffer (Tris-HCl 1 M, pH 6,8, Natriumdodecylsulfat (SDS) 2%, Glycerin 10%) wurden auf 7,5% SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetragen, das 1 mg /ml Gelatine. Nach der Elektrophorese wurde SDS aus dem Gel entfernt, indem für 1 h zweimal mit 2,5% Triton X-100 gewaschen wurde. Nach kurzem Spülen wurde das Gel bei 37 ° C für 18 h in Puffer, pH 7,6 inkubiert, enthaltend 100 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl 2, 20 mM NaCl. Das Gel wurde für 2 h with1% Coomassie Brilliant Blue R250 gefärbt und dann mit Entfärbelösung (40% Methanol, 10% Essigsäure, 50% destilliertem Wasser) behandelt. Proteolytische Aktivität wurde als klare Banden vor dem Hintergrund Fleck von unverdauten Substrat in dem Gel.
Tierstudie von Peritonealdialyse Implantation nachgewiesen
Dieses Experiment in Übereinstimmung mit der Richtlinie von der State Food and Drug Administration (SFDA China ausgestellt wurde durchgeführt, ). Die Tiere wurden untergebracht und versorgt in Übereinstimmung mit den von der National Science Council of Republik China festgelegten Richtlinien.
Weibliche BALB /c Nacktmäuse, 35-40 Tage alt und mit einem Gewicht von 20-22 g, von Shanghai Slac Laboratory geliefert wurden Tier Limited Company. Die Mäuse wurden unter sterilen Bedingungen gehalten und gefüttert eine sterilisierte Mausdiät und Wasser. Die Tiere wurden durch Inhalation von isoflurance narkotisiert. PSC1, PSC2, PSNC und SGC7901 Zellen (1 × 10 7 Zellen) wurden in 0,5 ml DMEM suspendiert und in die Bauchhöhle der Testmäuse inokuliert. Die Mäuse wurden sechs Wochen später getötet, und alle verbreiteten Knötchen, die auf der Gekröse und Membran wurden ausgewertet.
Statistische Analyse
Alle Werte im Text und Zahlen werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Gesamtüberlebensraten wurden mit Kaplan-Meier-Schätzer bestimmt, ein Ereignis wie der Tod für Krebs korreliert Ursache definiert. Der Log-Rank-Test wurde verwendet, um Gruppen zu identifizieren Unterschiede zwischen den Überlebenskurven von verschiedenen Patienten. In univariaten Analyse, 2-tailed χ 2 Tests für kategoriale Variablen und 2-tailed t-Test für kontinuierliche Variablen für statistische Vergleiche verwendet wurden. Werte von p
< 0,05 wurden genommen einen signifikanten Unterschied zwischen den Mittelwerten zu zeigen.
Ergebnisse | CTGF ist in Magenkrebs und korreliert mit klinisch-pathologischen Eigenschaften von Magenkrebs überexprimiert Patienten kaufen Wir die CTGF-Expression in Magenkrebsgewebe bestimmt und distalen normalen Geweben abgestimmt . 1A dargestellt CTGF-Expression in fünf zufällig ausgewählten Patienten. Erhöhte Spiegel von CTGF-Protein wurden in menschlichen Magenkrebsgewebe im Vergleich mit den zusammengepaßten normalen Geweben von Patienten gefunden. Dies wurde auch durch immunhistochemische Färbung (1B) bestätigt. Darüber hinaus ist die Korrelation zwischen der Expression von CTGF und klinisch-pathologischen Eigenschaften, um weiter zu untersuchen, 110 Proben wurden zur Untersuchung mit immunhistochemischen Färbung verwendet. Die statistische Analyse ergab positive CTGF-Expression signifikant mit histologischen Grad, Lymphknotenmetastasen und peritonealer Verbreitung assoziiert war im Vergleich zu den Patienten mit negativen CTGF-Expression (Tabelle 2). Positive CTGF-Expression wurde häufiger in Fällen der Lymphknoten-Metastasen (P = 0,012) festgestellt. Ebenen der CTGF-Expression signifikant in undifferenzierten Magenkrebs erhöhte sich im Vergleich mit differenzierten Magenkrebs (P = 0,039). Und die Expression von CTGF-Proteins war signifikant mit der Entwicklung von peritonealen Verbreitung von Magenkrebs (P = 0,011) korrelierten. Die Berechnung der Überlebensdauer der 110 beteiligten Patienten, die von der Kaplan-Meier-Methode ergab, dass die Patienten, die CTGF-positiven Tumoren kennzeichnete eine kürzere Überleben zeigten im Vergleich zu den Patienten, die von CTGF-negativen Tumoren (1C, P <gelitten; 0,001 ). Abbildung 1 Überexpression von CTGF bei Magenkrebs mit einer schlechteren Prognose. A. Western-Blot-Analyse zeigte die CTGF-Expression in Magenkrebsgewebe und angepasst distalen normalen Geweben von fünf zufällig Magenkrebs-Patienten ausgewählt. B. Immunhistochemie Ergebnisse der CTGF-Expression in gepaart Magenkrebs Gewebeproben. C. Kaplen-Meir-Überlebenskurven für 110 Patienten mit Magenkrebs, gruppiert nach CTGF-Expression.
Tabelle 2 Assoziation zwischen CTGF-Expression und klinisch-pathologische Merkmale von Patienten mit Magenkrebs (n = 110)

CTGF-Expression


Negative
Positive
P-Wert

Gender
Male
33
34
0.779
Weiblich
20
23
Alter (Jahre)
≤ 65
35
40
0.642
> 65
18
17
Tumorgröße (cm)
< 5
26
25
0.585
≥ 5
27
32
Tumor Lage
Lower
42
37
0.413
Mitte
5
8 Ober
3
6 Gesamte
3
6 histologischer Qualität
Differenzierte
26
17
0,039 *
Undifferenzierte
27
40
Lauren Grad
Intestinale
28
21
0.108
Diffuse
25
36
Lymphknotenmetastase
Negative
23
12
0,012 *
Positive
30
45
TNM-Stadium
I
11
8
0.080
II
15
9
III 20
22
IV
7
18
Lebermetastasen
Negative
50
55
0.588
Positive
3 2
Peritonealdialyse Verbreitung
Negative
50
44
0,011 *
Positive
3
13
* P < 0,05; CTGF, Bindegewebe-Wachstumsfaktor.
Expression von CTGF in menschlichen Magenkrebszelllinien und siRNA-vermittelte silence
Zuerst untersuchten wir CTGF-Expression in sechs Magenkrebszelllinien (MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 und MGC803) durch Western-Blot. CTGF wurde in allen Zelllinien ausgewertet detektiert und mit SGC7901 Zellen die höchste Stufe (2A) exprimieren. Daher wurden SGC7901 Zellen als Modell für die nachfolgenden Funktionsstudien ausgewählt. Da biologisch aktive CTGF sowohl sekretiert wird und in das Cytoplasma exprimiert [8, 27], maßen wir auch den Grad der sekretierten CTGF in den konditionierten Medien dieser Magenkrebszelllinien durch ELISA, die mit der Ebene der CTGF im Zytoplasma fiel wurde jeder Zelllinie (2B). Abbildung 2 Expression von CTGF bei Magenkrebs-Zelllinien und Zuschlags von CTGF durch siRNA. A. Western-Blot die Expression von CTGF in 6 Magenkrebszelllinien zeigt. GAPDH diente als Proteinladekontrolle. B. CTGF in konditionierten Medien von 6 Magenkrebszelllinien und stabil transfizierten Zellen wurde durch ELISA analysiert. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als pg /ml /1 × 106cells (Mittelwert ± SD, n = 4). C. Western-Blot-Analyse von CTGF-Protein-Expression in SGC7901, PSNC und CTGF Knockdown stabile Zelllinien (PSC1 und PSC2). D. Immunfluoreszenzanalyse von CTGF-Expression. E. RT-qPCR zeigt CTGF-mRNA-Spiegel in SGC7901, PSNC und CTGF Knockdown stabilen Zelllinien (PSC1 und PSC2). Die Daten werden als fache Veränderung relativ ausgedrückt zu steuern (Kontrolle ist SGC7901). Die Werte sind als Mittelwert ± SD von drei Experimenten angegeben. * P < 0,05 im Vergleich zur Kontrolle.
Um die Funktion von CTGF in SGC7901-Zellen untersucht, die CTGF Knockdown stabilen Zelllinien wurden verwendet, um die Dämpfungswirkung zu analysieren. Wie in 2B gezeigt, wurde das Niveau der sezerniert CTGF in dem konditionierten Medium deutlich zurückgegangen in den siRNA-stabil transfizierten Zellen im Vergleich zur Kontrolle. Western-Blot und Immunfluoreszenz-Färbung zeigte, dass die Expression von CTGF-Proteins im Zytoplasma deutlich in den CTGF Knockdown stabilen Zelllinien (2C, D) verringert. Des Weiteren wurde verringert die Expression von CTGF mRNA auch deutlich in der CTGF Knockdown stabilen Zelllinien (Abbildung 2E).
Sturz des CTGF-Expression das Wachstum von Magenkrebszellen hemmt
Die Koloniebildungstest wurde verwendet, um das Wachstum zu bewerten der Zellen, in denen CTGF zum Schweigen gebracht wurde. Wie in 3A gezeigt, CTGF Knockdown stabilen Zellen (PSC1 und PSC2) signifikant weniger Kolonien auf Weichagar gebildet Vergleich zu SGC7901 und PSNC Zellen (83 ± 10, 90 ± 15 gegenüber 30 ± 7 und 20 ± 5, respectively). Um die negative Wirkung von CTGF Knockdown Test auf Magenkrebszellwachstum wurde MTT-Assay durchgeführt und Wachstumskurven wurden erzeugt (3B). Wie durch die Kurven gezeigt, proliferierten beide PSC1 und PSC2 Zellen langsamer als PSNC Zellen und SGC7901 Zellen während der ersten 96 h, nachdem die Zellen ausplattiert. Die dramatische Reduktion der Koloniebildung und das Wachstum von CTGF verstummt Zellen vorgeschlagen CTGF Suppression negativ Magenkrebszellwachstum regulieren könnten. RT-qPCR zeigte, dass mRNA-Spiegel von Zellzyklus-verwandtes Protein Cyclin D1 nach unten in den beiden CTGF reguliert wurden Knockdown stabilen Zelllinien verglichen mit PSNC und SGC7901 (3C). In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis, beobachteten wir eine deutliche Reduktion von Cyclin D1-Protein-Expression in CTGF Knockdown Zellen PSC1 und PSC2 (Abbildung 3D). Interessanterweise ist die Behandlung mit konditioniertem Medium von SGC7901 die eine große Menge von CTGF sezerniert konnte das Cyclin D1 Herabregulation und zur Wiederherstellung der Zellproliferation in CTGF Knockdown stabile Zellen zu retten. Diese Daten zeigten, dass CTGF Unterdrückung negativ Magenkrebszellwachstum regulieren könnte und Cyclin D1-Expression zu verringern. Figur 3 Knockdown von CTGF-Expression hemmt das Wachstum von Magenkrebszellen. A. Koloniebildungstest. B. MTT-Proliferationstest. C. Preissturz von CTGF Sie die mRNA-Ebene von Cyclin D1 geregelt. D. Sturz von CTGF Sie die Protein-Ebene von Cyclin D1 geregelt. PSC1 /PSC2 + CM von SGC7901: PSC1 oder PSC2 Zellen wurden mit konditioniertem Medium (CM) von SGC7901 inkubiert. Alle Ergebnisse wurden reproduzierbar in drei unabhängigen Experimenten. * P < 0,05 im Vergleich zur Kontrolle (Steuerung ist SGC7901).
Sturz von CTGF-Expression hemmt die Migration und Invasion von Magenkrebszellen
Zellmigration und Invasion sind kritische Prozesse in Tumormetastasierung. Wir untersuchten die Zellmigration durch nicht-Matrigel-beschichteten Boyden-Kammer und Zellinvasion durch Matrigel-beschichteten Invasion Kammer-Assays sind. In den Migrationsassays (4A), Migrationsgeschwindigkeiten der PSC1 und PSC2 Zellen wurden signifikant verringert im Vergleich zu Kontrolle (P < 0,05). Wie in 4B gezeigt, auch CTGF Knockdown deutlich verminderte Eigenschaften Zellinvasion im Vergleich zur Kontrolle. Zellinvasion Raten von PSC1 und PSC2 Zellen wurden um 61,4% bzw. 55,8% zurückgegangen sind. RT-qPCR und Western-Blot zeigte, dass MMP-2 und MMP-9 wurden heruntergeregelt in den beiden stabilen Klone im Vergleich zu Kontrollzellen (4C; D). Im Gegensatz dazu, MMP-3 änderte sich nicht signifikant sowohl in mRNA und Protein-Ebene. Darüber hinaus zeigte Zymographie Analyse die Aktivitäten sowohl von MMP-2 und MMP-9 in den siRNA-stabil transfizierten Zellen waren signifikant niedriger als die in den Kontrollzellen (Abbildung 4E). Interessanterweise Behandlung mit konditionierten Medium von SGC7901, die eine große Menge an CTGF sezerniert induziert die erneute Expression von MMP-2 und MMP-9 und restauriert die Migration und Invasion des CTGF Knockdown stabile Zellen. Diese Ergebnisse legten nahe, dass der Zuschlags CTGF-Expression, die Migration und Invasion von Magenkrebszellen reduziert und verringert die Expression von MMP-2 und MMP-9. Abbildung 4 Knockdown von CTGF-Expression hemmt die Migration und Invasion von Magenkrebszellen. A. Zellmigrationstest. B. Zellinvasionstest. Migration und Invasion Zellen wurden fixiert und gefärbt, und repräsentative Felder wurden fotografiert. Zur Quantifizierung wurden die Zellen in 10 zufälligen Feldern unter einem Lichtmikroskop (x 200) gezählt. Assays wurden dreifacher Ausfertigung für jede Gruppe von Zellen in Invasion und Migrationsassays durchgeführt, und die Ergebnisse, ausgedrückt als ± SD bedeutet. C. RT-qPCR wurde zur Analyse der mRNA-Expression von MMP-2 durchgeführt, MMP-3 und MMP-9 in der CTGF Knockdown stabile Zelllinien und Kontrollzellen. Balken repräsentieren den Mittelwert ± SD von drei Experimenten. D. Die Protein-Spiegel von MMP-2, MMP-3 und MMP-9 wurden durch Western-Blot nachgewiesen. GAPDH diente als Proteinladekontrolle. E. Gelatinzymographie Analyse für die Aktivitäten von MMP-2 und MMP-9. PSC1 /PSC2 + CM von SGC7901: PSC1 oder PSC2 Zellen wurden mit konditioniertem Medium inkubiert (CM) von SGC7901 * P <. 0,05 im Vergleich zur Kontrolle (Steuerung ist SGC7901).
Herunterregulieren der CTGF peritoneal Verbreitung von Magenkrebs in vivo hemmt
Um die Auswirkungen von CTGF auf der peritonealen Verbreitung von Magenkrebszellen in vivo erforschen, inokuliert wir verschiedene Zellen in Nacktmäuse. SGC7901 Zellen steuern stabile Zelllinie (PSNC) und CTGF Knockdown stabile Zellen (PSC1 und PSC2) wurden in vier verschiedene Gruppen von Nacktmäusen injiziert. Als Folge einer solchen Behandlung, die meßbare Unterdrückung der peritonealen Verbreitung in Mäusen, die mit CTGF Knockdown stabilen Zellen injiziert, verglichen mit denjenigen injiziert SGC7901 Zellen oder PSNC Zellen wurde beobachtet (5A). Quantitativ beimpft für Testmäuse 117 ± 20 disseminierte Knötchen mit SGC7901 Zellen und 137 ± 26 disseminierte Knötchen für Mäuse mit PSNC Zellen geimpft wurden festgestellt wurden zur Kenntnis genommen. Im Gegensatz dazu waren signifikant weniger verbreitet Knötchen können für Mäuse, die mit CTGF Knockdown stabilen Zellen (5B) injiziert zu beobachten. Abbildung 5 Knockdown von CTGF hemmt Magenkrebs SGC7901 Xenotransplantat Peritonealdialyse Verbreitung. SGC7901, PSNC und CTGF Knockdown stabilen Zelllinien (PSC1 und PSC2) wurden intraperitoneal wie unter "Material und Methoden" beschrieben. 6 Wochen später wurden die Mäuse getötet, fotografiert, seziert und alle disseminierte Knötchen, die auf dem Mesenterium und die Membran wurden gezählt. A. Die Fotografie von Nacktmäusen mit Peritonealdialyse Verbreitung von jeder Gruppe. B. Die disseminierte Knötchen wurden ausgewertet. Jeder Balken stellt den Mittelwert ± SD (n = 5 für jede Gruppe). * P < 0,05 im Vergleich zur Kontrolle (Steuerung ist SGC7901).
Diskussion
durch die umfangreichste Literatur bisher CTGF in Bezug definiert seine Rolle bei der Wundheilung und fibrotischen Erkrankungen. Vor kurzem verwickeln mehrere Studien CTGF bei der Tumorentwicklung und Überleben von Tumorzellen [28-30]. Dennoch ist die genaue Rolle von CTGF in der Tumorprogression nicht bestimmt, und die Funktion von CTGF in Tumor Zellbiologie von Magenkrebs hat nicht gründlich untersucht worden. Um diese Probleme anzugehen, die wir getestet haben CTGF-Expression im Hinblick auf mögliche direkte Korrelationen mit dem Zellwachstum und Invasion von Magenkrebszellen. Darüber hinaus sind weitere wir die Auswirkungen von CTGF auf Peritonealdialyse Verbreitung von Magenkrebszellen in vivo untersucht.
In dieser Studie unsere Ergebnisse zeigten, dass CTGF hoch im Magenkrebsgewebe verglichen mit angepassten normalen Magengewebe exprimiert wurde. Die Expression von CTGF in undifferenzierten Magenkrebs war signifikant höher als in differenzierten Magenkrebs. Die CTGF-Expression in Tumorgewebe wurde mit Lymphknotenmetastasen und Peritonealdialyse Verbreitung verbunden. Darüber hinaus Patienten mit positiven CTGF-Expression signifikant niedrigere kumulative postoperativen 5 Jahre Überlebensrate (22,9%) als diejenigen mit negativen CTGF-Expression (48,1%, 1C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass CTGF könnte in Progression und Metastasierung von Magenkrebs beteiligt sein. Außerdem könnte CTGF ein nützlicher prognostischer Marker sein.
Mehrere neuere Studien haben gezeigt, dass CTGF Zellwachstum in der Speiseröhre Krebszellen und Pankreaskrebszellen [20, 30] regeln. Es ist jedoch wenig über die Wirkung von CTGF-Expression auf das Zellwachstum von Magenkrebszellen bekannt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass CTGF Suppression führte zu einer Hemmung der Zellproliferation und klonogenen Wachstum.

• Höhere Anzahl von Helicobacter pylori CagA Epiya C Phosphorylierungsstellen erhöht das Risiko von Magenkrebs, nicht aber Ulcus duodeni
• DNA-Kopienzahl Profile von Magenkrebs Vorläuferläsionen