Nedregulering af bindevæv vækstfaktor hæmmer væksten og invasion af gastriske cancerceller og dæmper peritoneal formidling

Nedregulering af bindevæv vækstfaktor hæmmer væksten og invasion af gastriske cancerceller og dæmper peritoneal formidling
Abstract
Baggrund
Connective vækst vævsfaktor (CTGF) er blevet vist at være impliceret i tumorudvikling og progression. Men den rolle af CTGF i gastrisk cancer forbliver stort set ukendt. Search Results
I denne undersøgelse viste vi, at CTGF blev højt udtrykt i gastrisk cancer væv sammenlignet med matchede normale gastriske væv. CTGF-ekspression i tumorvæv var forbundet med histologiske, lymfeknudemetastase og peritoneal formidling (P < 0,05). Patienter med positiv CTGF udtryk havde signifikant lavere kumulativ postoperative fem år overlevelsesrate end dem med negativ CTGF udtryk (22,9% versus 48,1%, P < 0,001). Vi viste, at knockdown af CTGF ekspression signifikant inhiberede cellevækst af gastriske cancerceller og nedsat cyclin D 1 ekspression. Endvidere knockdown af CTGF-ekspression også tydeligt reducerer migration og invasion af gastriske cancerceller og faldt ekspressionen af ​​matrixmetalloproteinase (MMP) -2 og MMP-9. Dyreforsøg afslørede, at nøgne mus injiceret med CTGF knockdown stabile cellelinjer fremhævede en mindre antal peritoneale seeding knuder end kontrollen cellelinier.
Konklusioner Salg Disse data antyder, at CTGF spiller en vigtig rolle i cellevækst og invasion i menneskelig gastrisk cancer, og det ser ud til at være en potentiel prognostisk markør for patienter med mavekræft.
Nøgleord
Bindevæv vækstfaktor mave neoplasmer Cell spredning invasiv peritoneal formidling Introduktion
trods betydelige fremskridt i kræftforskning, kræft er fortsat en verdensomspændende sundhedsproblem og dødelighed på grund af kræft er fortsat høj [1]. Mavekræft er den næststørste årsag til kræft dødsfald i verden, mens der synes at være en faldende tendens i forekomst, især i de vestlige lande; er det stadig almindeligt rapporteret i Kina og Japan [2, 3]. Selvom prognosen for patienter med fremskreden mavekræft synes at have forbedret som følge af standardisering af kirurgiske teknikker og de seneste fremskridt inden kemoterapi, den 5-årige postoperativ overlevelse fortsat lav [4, 5]. Peritoneal metastase er den mest almindelige og væsentlig årsag til dødelighed efter operation for mavekræft [6, 7]. Men mekanismerne i peritoneal metastase ikke er blevet klart defineret,.
Connective vækst vævsfaktor (CTGF), også kendt som CCN2, er medlem af CCN familien, herunder cystein-rige protein 61 (Cyr61), også kendt som CCN1, og nefroblastom-over udtrykt gen (nov), også kendt som CCN3 samt Wisp-1 /elm1 (CCN4), Wisp-2 /rcop1 (CCN5) og Wisp-3 (CCN6) [8, 9]. CTGF menes at være et multifunktionelt signalering modulator involveret i en lang række biologiske eller patologiske processer, såsom angiogenese, osteogenese, fibrose i nyrer og hud, og tumorudvikling [10-12]. Selv rolle CCN2 i normalt væv fibrose har været godt undersøgt [13], hvis funktion CCN2 i cancer er ikke så godt forstået. Interessant CCN2 er blevet identificeret som et onkogen i en række forskellige cancertyper, men betragtes som en tumor-suppressor gen i andre former for cancer [14]. Overekspression af CTGF findes i prostatacancer [15], gliomer [16], brystcancer [17], og voksen akut lymfoblastisk leukæmi [18]. Forøget CTGF ekspression er blevet associeret med progression af cervikale tumorer [19], og esophageal pladecellecarcinom [20]. Omvendt i lunge-adenokarcinomer [21] samt tyktarmskræft [22], overekspression af CTGF inhiberer invasion og metastase af cancercellerne både in vitro og in vivo. Salg Kliniske undersøgelser har vist, at overekspression af CTGF var signifikant korreleret med lymfeknude metastase og dårlig prognose hos patienter med gastrisk cancer [23, 24]. Imidlertid er stadig ukendt den præcise rolle af CTGF i gastrisk cancer. I denne undersøgelse påvist vi CTGF ekspression i gastrisk cancer væv. Vi fandt, at CTGF blev overudtrykt i gastrisk cancer, og dets ekspression var forbundet med aggressiv adfærd af gastrisk cancer. Vi brugte derefter siRNA-teknologi til at knockdown endogen CTGF udtryk i gastriske kræftceller. Vi viste, at nedregulering af CTGF hæmmede væksten og invasion af gastrisk cancer in vitro og svækket peritoneal udbredelse in vivo. Vores undersøgelse fremhæver kraftigt betydningen af ​​CTGF i væksten og invasionen af ​​mavekræft, og kan give et terapeutisk mål i mavekræft.
Materialer og metoder
Reagenser
Dimethylsulfoxid (DMSO) og trypsin blev købt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). DMEM, streptomycin og andre cellekultur forsyninger var fra GIBCOBRL (Grand Island, NY, USA). Føtalt bovint serum var fra Hyclone (Logan, UT, USA). MTT [3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltrazolium bromid] blev opnået fra Fluka (Ronkonkoma, NY, USA). CTGF, cyclin D1, matrixmetalloproteinase (MMP) -2, MMP-3, MMP-9 og GAPDH primært antistof, samt andet antistof Rhodamin (TRITC) -konjugeret AffiniPure gede anti-mus IgG blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). CTGF-ELISA-kit blev indkøbt fra R &D (Minneapolis, MN, USA). Trizol og Lipofectamine 2000, blev købt hos Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). SYBR @ Primescript ™ RT-PCR-kit var fra Takara Biotechnology, Japan.
Vævsprøver og immunhistokemisk farvning
Tumor prøver blev indhentet fra 110 patienter med mavekræft, som gennemgik kirurgi ved Kirurgisk Afdeling Oncology, First tilknyttet Hospital i Kina Medical University i perioden 2003-2005. Alle patienter undergik gastrctomy, og deres kliniske og patologiske data var tilgængelige. Normale mave væv blev taget fra den matchede distale reseceret margen på mavekræft prøver. Alle kirurgiske prøver blev undersøgt af erfarne patologer og den distale resekterede margin var tumor-fri. De friske væv blev skåret i små stykker, snap-frosset i flydende nitrogen umiddelbart og opbevaret ved -80 ° C indtil proteinekstraktion. Undersøgelsen Protokollen blev gennemgået og godkendt af den etiske komité i Kina Medical University.
For immunhistokemisk farvning, 4 um histologiske snit blev afparaffiniseret med xylen og rehydreret gennem en gradueret serie af alkohol. Snittene blev derefter kogt i 10 minutter i 0,01 M citratpuffer og endogen peroxidase blev blokeret ved inkubering i 0,3% H 2 O 2 i methanol i 30 min. Ikke-specifik binding blev blokeret ved at inkubere objektglassene med normalt gedeserum i 30 minutter ved stuetemperatur. Sektionerne blev inkuberet natten over ved 4 ° C med 1:50 fortynding af CTGF primært antistof. Snittene blev eksponeret for biotin-mærket sekundært antistof i 1 time, til en streptavidin-peroxidase reaktionssystem, og derefter fremkaldt med DAB- H 2 O 2. Farvning blev scoret på følgende skala: 0, ingen farvning; 1+, minimal farvning; 2+, moderat til stærk farvning i mindst 20% af celler; 3+, stærk farvning i mindst 50% af cellerne. Sager med 0 eller 1+ farvning blev klassificeret som negativ, og sager med 2+ eller 3+ farvning blev klassificeret som positive.
Cell Culture
Humane gastriske kræft cellelinjer, MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 og MGC803 blev opnået fra Institut for cellebiologi, Kina Medical University, Kina. De blev dyrket i DMEM indeholdende 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO 2. Cellerne blev løsnet anvendelse af 0,25% trypsin og 0,02 mol /l EDTA i PBS i subkultur.
Konstruktion af CTGF knockdown stabile cellelinjer Salg To små interfererende RNA (siRNA) oligonukleotider blev syntetiseret til at målrette to forskellige regioner i CTGF cDNA: GTGCATCCGTACTCCCAAA (PSC1) og GCTAAATTCTGTGGAGTAT (PSC2). De blev klonet i siRNA ekspressionsvektoren pGCsilencer ™ U6.Neo.GFP. Den uspecifikke siRNA blev anvendt som en negativ kontrol (PSNC). SiRNA ekspressionsplasmider blev transficeret ind SGC7901 celler under anvendelse af Lipofectamine 2000. Cellerne blev screenet med G418 (800 ug /ml), og de kolonier blev opsamlet efter 3 uger, bestemt ved RT-QPCR og Western blot. Celler transficeret med PSC1, PSC2 eller PSNC blev betegnet PSC1 celler, PSC2 celler eller PSNC celler.
Real-Time Quantitative polymerasekædereaktion (RT-QPCR)
Totalt RNA blev isoleret fra cellepellets ved anvendelse af Trizol-reagens. Total RNA (1 ug) blev omdannet til cDNA ved anvendelse af en RT (revers transkriptase) omsætning kit. Real-time PCR blev udført under anvendelse Mx3000P realtids-PCR system ifølge fabrikantens instruktioner og SYBR ® Premix ExTaq som en DNA specifik fluorescerende farvestof. PCR blev udført i 40 cykler ved 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 40 s. Primersekvenser er vist i tabel 1. Tærsklen cyklus (Ct) blev opnået og relative mængder blev bestemt for hver prøve normaliseret til GAPDH. Udtryk af mRNA blev beregnet ved hjælp af den ΔΔCt metoden [25] .table en PCR Primer sekvenser
Gene
primersekvenserne (5'-3 ') Frem og Reverse

Produkt (bp)

CTGF
CTTGCGAAGCTGACCTGGAA
AAAGCTCAAACTTGATAGGCTTGGA
90
MMP-2
ATGACATCAAGGGCATTCAGGAG
TCTGAGCGATGCCATCAAATACA
135
MMP-3
GGGTGAGGACACCAGCATGA
CAGAGTGTCGGAGTCCAGCTTC
178
MMP-9
TCCCAGACCTGGGCAGATTC
GCAAAGGCGTCGTCAATCAC
124
Cyclin D1
GATGCCAACCTCCTCAACGAC
CTCCTCGCACTTCTGTTCCTC
171
GAPDH
GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
TGGTGAAGACGCCAGTGGA
138
Western blot-analyse
Vævene eller cellerne blev lyseret i RIPA-buffer suppleret med proteaseinhibitor-blanding i 30 minutter ved 4 ° C. Cellelysaterne blev derefter sonikeret kortvarigt og centrifugeret (14.000 g ved 4 ° C) i 15 minutter for at fjerne uopløselige materialer. Lige store mængder protein blev separeret ved SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran. Membraner blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk og inkuberes derefter med første antistof, efterfulgt af peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof. Proteinbånd blev visualiseret ved ECL kemiluminescensmetode.
Immunofluorescens og Konfokal imaging
Cellerne på Lab-Tek vævskultur- chamber objektglas blev fikseret i kold 100% methanol i 10 min, og derefter blokeret med normalt gedeserum i 30 minutter . Cellerne blev inkuberet med det primære antistof natten over ved 4 ° C, vasket 3 gange i PBT (PBS med 1 ‰ Triton X-100), og derefter inkuberet med andet antistof konjugeret med rhodamin. DNA farvestof DAPI blev anvendt til at farve DNA'et. Celler blev afbildet på et Leica SP2AOBS konfokalt mikroskop.
Konditioneret medium (CM) indsamling og Enzyme-linked immunoassay (ELISA)
3 × 10 5-celler blev podet i 100 mm vævskulturskål med DMEM indeholdende 10 % føtalt bovint serum i 2 dage. Derefter blev cellerne vasket to gange med PBS og inkuberet med 5 ml serumfrit DMEM. 48 timer senere blev det konditionerede medium opsamlet og centrifugeret ved 2000 g i 5 min, ledes gennem filtre (porestørrelse, 0,45 um) og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse.
Niveauerne af CTGF i det konditionerede medier fra gastrisk cancer cellelinjer blev målt ved anvendelse af humant Quantikine ELISA kit ifølge producentens instruktioner.
MTT proliferationsassay
evnen af ​​cellulær proliferation blev vurderet ved anvendelse af MTT [3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2 , 5-diphenyltrazolium bromid] assay. Ca. 5 x 10 3 celler blev podet i 96-brønds kulturplader og dyrket i serumfrit DMEM i 24, 48, 72 og 96 timer, hhv. Derefter blev cellerne inkuberet med 20 pi MTT (10 mg /ml) i 4 timer ved 37 ° Cand 200 pi DMSO blev pipetteret at solubilisere formazan produkt i 20 min ved stuetemperatur. Den optiske densitet (OD) blev bestemt ved anvendelse af et spektrofotometer (Bio-Rad) ved en bølgelængde på 570 nm.
Kolonidannelse assay
5 × 10 2 celler suspenderet i 2 ml 0,3% agarose DMEM-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum blev udpladet i 6-brønds plader oven på eksisterende 0,6% bund agarose med det samme medium. Pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i en CO 5% 2 incubator. Efter tre uger, celle kolonier > 0,1 mm i diameter blev talt under et mikroskopisk område.
Cell invasion assay
invasion blev bestemt ved en invasion kammer assay. Celler (2 x 10 4) blev podet på den øverste kammer i en 24-brønds Matrigelcoatede mikropore membranfilter med 8 um porer og bundkammeret blev fyldt med 0,5 ml DMEM med 10% føtalt bovint serum som en kemoattraktant. Efter inkubering i 24 timer blev ikke-invaderende celler (øvre kammer) forsigtigt fjernes med en vatpind og invaderende celler (nederste kammer) blev fastsat ved anvendelse af methanol og farvet med trypanblåt. Den invasive evne blev bestemt ved antallet af gennemtrængende celler under et mikroskop ved 200 x forstørrelse i 10 tilfældige felter i hver brønd.
Chamber migration assay
fremgangsmåde til in vitro migration assay blev anvendelse af et ikke-Matrigelcoatede 24-brønds Boyden kammer (8 um, Millipore). Celler (2 x 10 4) podedes på indsatsene suspenderet i 0,2 ml serumfrit DMEM-medium. Ikke-migrerende celler blev fjernet fra det øvre kammer af filteret efter inkubation i 24 timer. Migrerede celler blev farvet og kvantificeret på grundlag af den procedure, som beskrevet tidligere. Tredobbelte analyser blev udført for hver gruppe af celler i invasion og migration assays, og resultaterne er udtrykt som middelværdi ± SD.
Gelatinezymografi
MMP-2 og MMP-9-aktivitet blev bestemt ved gelatinezymografi som tidligere beskrevet [ ,,,0],26]. Kort fortalt, efter centrifugering blev supernatanten separeret, og proteinkoncentrationen bestemmes; lige store mængder af protein, der er tilføjet af prøvepuffer (Tris-HCI 1 M, pH 6,8, natriumdodecylsulfat (SDS) 2%, glycerol 10%) blev påført 7,5% SDS-polyacrylamidgel indeholdende 1 mg /ml gelatine. Efter elektroforese blev SDS fjernet fra gelen ved vask to gange med 2,5% Triton X-100 i 1 time. Efter en kort skylning blev gelen inkuberet ved 37 ° C i 18 timer i puffer, pH 7,6, indeholdende 100 mM Tris-HCI, 10 mM CaCI 2, 20 mM NaCl. Gelen blev farvet with1% Coomassie Brilliant Blue R250 i 2 timer og derefter behandlet med Affarvningsopløsningen (40% methanol, 10% eddikesyre, 50% destilleret vand). Proteolytisk aktivitet blev detekteret som klare bånd på baggrund pletten af ​​ufordøjet substrat i gelen.
Animal undersøgelse af peritoneal implantation
Dette forsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjen udstedt af staten Food and Drug Administration (SFDA Kina ). Dyrene blev opstaldet og plejes i overensstemmelse med de retningslinjer, som National Science Råd Republic Kina.
BALB /c nøgne mus, 35-40 dage gamle og vejer 20-22 g, blev leveret af Shanghai SLAC Laboratory Animal Limited Company. Musene blev holdt under sterile betingelser og fodret med en steriliseret muse kost og vand. Dyrene blev bedøvet via inhalation af isoflurance. PSC1, PSC2, PSNC og SGC7901 celler (1 x 10 7 celler) blev suspenderet i 0,5 ml DMEM og inokuleret i bughulen af ​​test-mus. Musene blev aflivet seks uger senere, og eventuelle formidles knuder stede på mesenteriet og membranen blev evalueret.
Statistisk analyse
Alle værdier i teksten og figurerne er præsenteret som gennemsnit ± SD. Samlet overlevelsesrater blev bestemt ved hjælp af Kaplan-Meier estimator, en begivenhed er defineret som død for kræft korreleret årsag. Af log-rank testen blev anvendt til at identificere forskelle mellem overlevelseskurverne for forskellige patientgrupper. I univariat analyse, 2-tailed χ 2 test for kategoriske variable og to-halet t-test for kontinuerlige variabler blev anvendt til statistiske sammenligninger. Værdier af p
< 0,05 blev taget for at vise en signifikant forskel mellem midler.
Resultater
CTGF er overudtrykt i gastrisk kræft og korreleret med klinisk-patologiske træk af mavekræft patienter
Vi bestemmes CTGF udtryk i mavekræft væv og matches distale normale væv . Figur 1A illustreret CTGF ekspression i fem tilfældigt valgte patienter. Forhøjede niveauer af CTGF-protein blev fundet i humane gastriske cancervæv sammenlignet med de parrede normale væv fra patienterne. Dette blev også bekræftet ved immunohistokemisk farvning (figur 1B). Endvidere med henblik på yderligere at undersøge korrelationen mellem ekspression af CTGF og klinisk-patologiske træk, blev 110 prøver anvendt til undersøgelse med immunhistokemisk farvning. Statistisk analyse viste positiv CTGF-ekspression blev signifikant associeret med histologiske, lymfeknudemetastase og peritoneal udbredelse sammenlignet med patienter med negativ CTGF-ekspression (tabel 2). Positiv CTGF udtryk blev oftere påvist i tilfælde af lymfeknuder metastaser (P = 0,012). Niveauer af CTGF udtryk blev forøget betydeligt i udifferentierede gastrisk kræft sammenlignet med differentierede gastrisk kræft (P = 0,039). Og ekspressionen af ​​CTGF-protein var signifikant korreleret med udviklingen af ​​peritoneal formidling af gastrisk cancer (P = 0,011). Beregning af overlevelse varigheden af ​​de 110 involverede patienter ved Kaplan-Meier-metoden viste, at de patienter, der fremhævede CTGF-positive tumorer udviste en kortere overlevelse sammenlignet med de patienter, der led af CTGF-negative tumorer (figur 1C, P < 0,001 ). Figur 1 Overekspression af CTGF i gastrisk cancer med dårligere prognose. A. Western blot-analyse viste CTGF ekspression i gastrisk cancer væv og matchede distale normale væv fra fem tilfældigt valgte mavecancerpatienter. B. Immunhistokemi resultater af CTGF udtryk i parrede gastrisk cancer vævsprøver. C. Kaplen-Meir overlevelse kurver for 110 patienter med mavekræft, grupperet efter CTGF udtryk.
Tabel 2 associering mellem CTGF udtryk og clinicopathologic karakteristika patienter med mavekræft (n = 110)

CTGF udtryk


Negativ
Positiv
P-værdi

Køn
Mand
33
34
0,779
Kvindelige
20
23
Alder (år)
≤ 65
35
40
0,642
> 65
18
17
Tumor størrelse (cm)
< 5
26
25
0,585
≥ 5
27
32
Tumor placering
Lavere
42
37
0,413
Mellemøsten
5
8
Upper
3
6
Hele
3
6
Histologisk klasse
Differentieret
26
17
0,039 *
Udifferentieret
27
40
Lauren kvalitet
Intestinal
28
21
0,108
Diffus
25
36
lymfeknudemetastase
Negativ
23
12
0,012 *
Positiv
30
45
TNM stadie
jeg
11
8
0.080
II
15
9
III
20
22
IV
7
18
Nedsat metastaser
Negativ
50
55
0,588
Positiv
3
2
Peritoneal formidling
Negativ
50
44
0,011 *
Positiv
3
13
* P < 0,05; CTGF, bindevæv vækstfaktor.
Ekspression af CTGF i humane gastrisk cancer cellelinjer og siRNA-medieret tavshed
Først undersøgte vi CTGF udtryk i seks gastrisk cancer cellelinier (MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 og MGC803) ved Western blot. CTGF blev påvist i alle cellelinjer evaluerede, og med SGC7901 celler, der udtrykker det højeste niveau (figur 2A). Derfor blev SGC7901 celler valgt som model for de efterfølgende funktion studier. Fordi biologisk aktivt CTGF er både secerneret og udtrykkes i cytoplasmaet [8, 27], målte vi også niveauet af udskilt CTGF i de konditionerede medier af disse gastriske cancer cellelinjer ved ELISA, som blev faldt sammen med niveauet af CTGF i cytoplasmaet af hver cellelinje (figur 2B). Figur 2 Ekspression af CTGF i gastrisk cancer-cellelinjer og knockdown af CTGF by siRNA. A. Western blot, der viser ekspression af CTGF i 6 gastriske cancercellelinier. GAPDH tjente som protein loading kontrol. B. CTGF i konditionerede medier af 6 gastriske cancercellelinier og stabile transficerede celler blev analyseret ved ELISA. Resultater er udtrykt som pg /ml /1 × 106cells (gennemsnit ± SD, n = 4). C. Western blot-analyse af CTGF proteinekspression i SGC7901, PSNC og CTGF knockdown stabile cellelinjer (PSC1 og PSC2). D. Immunofluorescensanalyse af CTGF-ekspression. E. RT-QPCR viser CTGF-mRNA-niveauer i SGC7901, PSNC og CTGF knockdown stabile cellelinjer (PSC1 og PSC2). Data udtrykkes som en fold ændring i forhold til kontrol (kontrol er SGC7901). Værdier er angivet som middel ± SD af tre eksperimenter. * P < 0,05 sammenlignet med kontrol.
For at undersøge funktionen af ​​CTGF i SGC7901 celler, CTGF knockdown stabile cellelinier blev anvendt til at analysere lyddæmpende effekt. Som vist i figur 2B, blev niveauet af udskilt CTGF i det konditionerede medium signifikant reduceret i siRNA-stabilt transficerede celler sammenlignet med kontrol. Western blot og immunfluorescensfarvning viste, at ekspression af CTGF-protein i cytoplasmaet faldt markant i CTGF knockdown stabile cellelinjer (figur 2C, D). Endvidere ekspressionen af ​​CTGF-mRNA blev også signifikant reduceret i CTGF knockdown stabile cellelinjer (figur 2E).
Knockdown af CTGF-ekspression inhiberer væksten af ​​gastriske cancerceller
kolonidannelse assayet blev anvendt til at evaluere vækst af de celler, hvor CTGF blev stille. Som vist i figur 3A, CTGF knockdown stabile celler (PSC1 og PSC2) dannet signifikant færre kolonier på blød agar sammenlignet med SGC7901 og PSNC celler (83 ± 10, 90 ± 15 versus 30 ± 7 og 20 ± 5, henholdsvis). For yderligere at teste den negative effekt af CTGF knockdown på gastrisk vækst kræftcelle, blev MTT assay udført og vækstkurver blev genereret (figur 3B). Som det fremgår af kurverne, både PSC1 og PSC2 celler prolifererede langsommere end PSNC celler og SGC7901 celler i det første 96 timer efter at cellerne blev udpladet. Den dramatiske reduktion af kolonidannelse og vækst af CTGF tavshed celler foreslog CTGF undertrykkelse måske negativt regulere gastrisk vækst kræftcelle. RT-QPCR viste, at mRNA-niveauer af cellecyklus beslægtet protein cyclin D1 ned reguleret i de to CTGF knockdown stabile cellelinjer sammenlignet med PSNC og SGC7901 (figur 3C). I overensstemmelse med dette resultat, observerede vi en markant reduktion af cyclin D1 proteinekspression i CTGF knockdown celler PSC1 og PSC2 (figur 3D). Interessant behandling med konditioneret medium af SGC7901 som udskilles en stor mængde af CTGF var i stand til at redde cyclin D1 nedregulering og genoprette celleproliferation i CTGF knockdown stabile celler. Disse data viste, at CTGF undertrykkelse negativt kunne regulere gastrisk vækst kræftcelle og mindske cyklin D1 udtryk. Figur 3 Knockdown af CTGF-ekspression inhiberer væksten af ​​gastriske cancerceller. A. Kolonidannelse assay. B. MTT proliferationsassay. C. Knockdown af CTGF nedregulerede mRNA-niveauet af cyclin D1. D. Knockdown af CTGF nedregulerede proteinniveauet af cyclin D1. PSC1 /PSC2 + CM af SGC7901: PSC 1 eller PSC2 celler blev inkuberet med konditioneret medium (CM), i SGC7901. Alle resultater var reproducerbare i tre uafhængige forsøg. * P < 0,05 sammenlignet med kontrol (kontrol er SGC7901).
Knockdown af CTGF-ekspression inhiberer migration og invasion af gastriske cancerceller
Cell migration og invasion er kritiske processer i tumormetastase. Vi undersøgte cellemigrering af ikke-Matrigelcoatede Boyden kammer og celleinvasion ved Matrigelcoatede invasion kammer assays hhv. I assayene migration (figur 4A), blev vandringshastigheder af PSC1 og PSC2 celler faldt betydeligt sammenlignet med kontrol (P < 0,05). Som vist i figur 4B, CTGF knockdown også markant reduceret celleinvasion egenskaber i sammenligning med kontrollen. Celleinvasion satser PSC1 og PSC2 celler blev reduceret med 61,4% og 55,8%, hhv. RT-QPCR og Western blot viste, at MMP-2 og MMP-9 ned reguleret i de to stabile kloner sammenlignet med kontrolceller (figur 4C; D). I modsætning hertil MMP-3 ikke signifikant ændre både i mRNA og protein niveauer. Endvidere viste zymografi analyse aktiviteter både MMP-2 og MMP-9 i siRNA-stabilt transficerede celler var signifikant lavere end i kontrolcellerne (figur 4E). Interessant behandling med konditioneret medium af SGC7901 som udskilles en stor mængde af CTGF inducerede genekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9 og restaureret migration og invasion af CTGF knockdown stabile celler. Disse resultater antydede, at knockdown af CTGF-ekspression reducerede migration og invasion af gastriske cancerceller og faldt ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9. Figur 4 Knockdown af CTGF-ekspression inhiberer migration og invasion af gastriske cancerceller. A. Cell migration assay. B. Cell invasion assay. Migration og invasion celler blev fikseret og farvet, og repræsentative felter blev fotograferet. For kvantificering blev cellerne talt i 10 tilfældige felter under et lysmikroskop (x 200). Tredobbelte analyser blev udført for hver gruppe af celler i invasion og migration assays, og resultaterne er udtrykt som middelværdi ± SD. C. RT-QPCR blev gjort til analyse af mRNA-ekspression af MMP-2, MMP-3 og MMP-9 i CTGF knockdown stabile cellelinier og kontrolceller. Bjælkerne repræsenterer middelværdien ± SD af tre eksperimenter. D. proteinniveauer af MMP-2, MMP-3 og MMP-9 blev påvist ved Western blot. GAPDH tjente som protein loading kontrol. E. gelatinezymografi analyse for aktiviteterne i MMP-2 og MMP-9. PSC1 /PSC2 + CM af SGC7901: PSC 1 eller PSC2 celler blev inkuberet med konditioneret medium (CM) af SGC7901 * P. ≪ 0,05 sammenlignet med kontrol (kontrol er SGC7901).
Nedregulering af CTGF inhiberer peritoneal udbredelse af gastrisk cancer in vivo
at udforske virkningerne af CTGF på den peritoneale udbredelse af gastriske cancerceller in vivo, vi podet forskellige celler i nøgne mus. SGC7901 celler, styre stabil cellelinie (PSNC), og CTGF knockdown stabile celler (PSC1 og PSC2) injiceret i fire separate grupper af nøgne mus. Som følge af en sådan behandling, den målelige undertrykkelse af peritoneal udbredelse i mus injiceret med CTGF knockdown stabile celler i forhold til dem injiceret med SGC7901 celler eller PSNC celler blev bemærket (figur 5A). Kvantitativt, blev 117 ± 20 formidles knuder kendt for test mus podet med SGC7901 celler og 137 ± 26 formidles knuder blev noteret for mus inokuleret med PSNC celler. I modsætning hertil betydelige færre formidles knuder kunne observeres for mus injiceret med CTGF knockdown stabile celler (figur 5B). Figur 5 Knockdown af CTGF hæmmer mavekræft SGC7901 xenograft peritoneal formidling. SGC7901, PSNC og CTGF knockdown stabile cellelinier (PSC 1 og PSC2) blev injiceret intraperitonealt som beskrevet under "Materiale og metoder". 6 uger senere blev musene aflivet, fotograferet, dissekeret og eventuelle formidles knuder stede på mesenteriet og membranen blev talt. A. fotografi af nøgne mus med peritoneal udbredelse fra hver gruppe. B. formidles knuder blev evalueret. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD (n = 5 for hver gruppe). * P < 0,05 sammenlignet med kontrol (kontrol er SGC7901).
Diskussion
mest omfattende litteratur til dato om CTGF definerer sin rolle i sårheling og fibrotisk sygdom. For nylig har flere undersøgelser implicerer CTGF i tumorudvikling og tumorcelleoverlevelse [28-30]. Ikke desto mindre er den præcise rolle CTGF i tumor progression ikke bestemt, og funktionen af ​​CTGF i tumor celle biologi mavekræft er ikke blevet grundigt undersøgt. For at løse disse problemer, vurderet vi CTGF udtryk med hensyn til eventuelle direkte korrelationer med cellevækst og invasion af gastriske kræftceller. Desuden har vi undersøgt yderligere virkningerne af CTGF om peritoneal udbredelse af gastriske cancerceller in vivo.
I dette studie viste vores resultater, at CTGF blev højt udtrykt i gastrisk cancer væv sammenlignet med matchede normale gastriske væv. Ekspressionen af ​​CTGF i udifferentierede gastrisk cancer var signifikant højere end i differentieret gastrisk cancer. CTGF-ekspression i tumorvæv var forbundet med lymfeknudemetastaser og peritoneal formidling. Desuden patienter med positiv CTGF udtryk havde signifikant lavere kumulativ postoperative fem år overlevelsesraten (22,9%) end dem med negativ CTGF udtryk (48,1%, figur 1C). Disse resultater antydede, at CTGF kan være involveret i progression og metastase af mavekræft. Desuden CTGF kunne være en nyttig prognostisk markør.
Adskillige nyere undersøgelser har afsløret, at CTGF regulere cellevækst i esophageal kræftceller og bugspytkirtelkræftceller [20, 30]. Imidlertid vides der kun lidt om virkningen af ​​CTGF-ekspression på cellevækst af gastriske cancerceller. Vores resultater viste, at CTGF undertrykkelse resulterede i inhibering af celleproliferation og klonogene vækst. Ændringer i cellevækst kan være vigtige faktorer i reguleringen af ​​kræft progression [31].

• Højere antal Helicobacter pylori CagA EPIYA C phosphoryleringssites øger risikoen for mavekræft, men ikke duodenale ulcer
• DNA-kopi nummer profiler af mavekræft forløber lesions