L'abbassamento del connettivo fattore di crescita del tessuto inibisce la crescita e l'invasione delle cellule di cancro gastrico e attenua peritoneale dissemination

sottoregolazione di connettivo fattore di crescita del tessuto inibisce la crescita e l'invasione delle cellule di cancro gastrico e attenua diffusione peritoneale
Abstract
sfondo
connettivo è stato dimostrato che il fattore di crescita tissutale (CTGF) per essere implicati nello sviluppo del tumore e la progressione. Tuttavia, il ruolo di CTGF nel carcinoma gastrico rimane in gran parte sconosciuta.
Risultati
In questo studio, abbiamo dimostrato che CTGF è stato altamente espresso nei tessuti di cancro gastrico rispetto ai tessuti normali gastrici abbinati. L'espressione CTGF nel tessuto tumorale è stato associato con il grado istologico, metastasi linfonodali e la diffusione peritoneale (P < 0,05). I pazienti con espressione CTGF positivo avevano tasso di sopravvivenza significativamente più bassa postoperatoria cumulativo 5 anni rispetto a quelli con espressione negativa CTGF (22,9% contro 48,1%, P < 0,001). Abbiamo dimostrato che atterramento di espressione CTGF crescita cellulare ha inibito significativamente di cellule di cancro gastrico e una diminuzione della ciclina D 1 espressione. Inoltre, l'abbattimento di espressione CTGF anche marcatamente ridotto la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico e diminuito l'espressione della metalloproteinasi della matrice (MMP) -2 e MMP-9. Gli studi sugli animali hanno rivelato che i topi nudi iniettati con il CTGF atterramento linee cellulari stabili caratterizzato da un minor numero di noduli semina peritoneali rispetto alle linee di cellule di controllo.
Conclusioni
Questi dati suggeriscono che CTGF svolge un ruolo importante nella crescita cellulare e l'invasione in cancro gastrico umano e sembra essere un potenziale marker prognostico per i pazienti con cancro gastrico.
Parole
connettivo crescita del tessuto neoplasie fattore di stomaco la proliferazione cellulare invasività peritoneale diffusione Introduzione
Nonostante i progressi significativi nella ricerca sul cancro, il cancro rimane una problema di salute in tutto il mondo e la mortalità dovuta al cancro rimane elevato [1]. cancro gastrico è la seconda causa di morte per cancro nel mondo, mentre sembra che vi sia una tendenza alla diminuzione a verificarsi, in particolare nei paesi occidentali; è ancora comunemente riportata in Cina e in Giappone [2, 3]. Anche se la prognosi di pazienti con carcinoma gastrico avanzato sembra essere migliorata a seguito della standardizzazione delle tecniche chirurgiche e recenti progressi nella chemioterapia, il tasso di sopravvivenza postoperatoria 5 anni rimane basso [4, 5]. metastasi peritoneale è la causa più comune e significativa della mortalità dopo intervento chirurgico per cancro gastrico [6, 7]. Tuttavia, i meccanismi di metastasi peritoneale non sono stati chiaramente definiti
. Fattore di crescita del tessuto connettivo (CTGF), noto anche come CCN2, è un membro della famiglia CCN, compreso cisteina-rich proteina 61 (Cyr61), noto anche come CCN1, e nefroblastoma-over gene espresso (Nov), noto anche come CCN3, così come Wisp-1 /elm1 (CCN4), Wisp-2 /rcop1 (CCN5) e Wisp-3 (CCN6) [8, 9]. CTGF è ritenuta essere un modulatore segnalazione multifunzionale coinvolta in un'ampia varietà di processi biologici o patologici, quali l'angiogenesi, osteogenesi, fibrosi nei reni e pelle, e lo sviluppo del tumore [10-12]. Anche se il ruolo di CCN2 in condizioni normali la fibrosi dei tessuti è stato ben studiato [13], la funzione di CCN2 nel cancro non è così ben compreso. È interessante notare, CCN2 è stato identificato come un oncogene in una varietà di tipi di cancro, ma è considerato un gene soppressore del tumore in altre forme di cancro [14]. Sovraespressione di CTGF si trova nel carcinoma della prostata [15], i gliomi [16], il cancro al seno [17], e adulti leucemia linfoblastica acuta [18]. espressione CTGF L'aumento è stato associato con la progressione dei tumori del collo dell'utero [19], e carcinoma a cellule squamose dell'esofago [20]. Al contrario, negli adenocarcinomi polmonari [21] e tumori del colon [22], l'iperespressione di CTGF inibisce invasione e metastasi delle cellule tumorali sia in vitro che in vivo.
Studi clinici hanno dimostrato che la sovraespressione di CTGF è risultata significativamente correlata con linfonodo metastasi e prognosi infausta in pazienti con cancro gastrico [23, 24]. Tuttavia, il ruolo preciso di CTGF nel carcinoma gastrico è ancora sconosciuta. In questo studio, abbiamo rilevato espressione CTGF nei tessuti di cancro gastrico. Abbiamo scoperto che CTGF è stato sovraespresso nel cancro gastrico, e la sua espressione è stata associata ad un comportamento aggressivo di cancro gastrico. Abbiamo poi utilizzato la tecnologia siRNA per abbattere l'espressione CTGF endogena in cellule di cancro gastrico. Abbiamo dimostrato che sottoregolazione di CTGF ha inibito la crescita e l'invasione del cancro gastrico in vitro e attenuato diffusione peritoneale in vivo. Il nostro studio mette in evidenza con forza l'importanza della CTGF nella crescita e l'invasione del cancro gastrico, e può fornire un obiettivo terapeutico nel cancro gastrico.
Materiali e metodi
reagenti
Dimetilsolfossido (DMSO) e tripsina sono stati acquistati da Sigma (St. Louis, MO, USA). DMEM, streptomicina e altre forniture di coltura cellulare sono stati da GIBCOBRL (Grand Island, NY, USA). siero fetale bovino era da Hyclone (Logan, UT, USA). MTT [3- (4, 5-dimethylthiazol-2-il) -2, 5-diphenyltrazolium bromuro] è stato ottenuto da Fluka (Ronkonkoma, NY, USA). CTGF, ciclina D1, metalloproteinasi della matrice (MMP) -2, MMP-3, MMP-9 e GAPDH anticorpo primario, così come secondo anticorpo rodamina (TRITC) coniugata AffiniPure capra anti-IgG di topo sono stati ottenuti da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Kit CTGF ELISA è stato acquistato da R & D (Minneapolis, MN, Stati Uniti d'America). Trizol e Lipofectamine 2000 sono state acquistate da Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Kit SYBR @ Primescript ™ RT-PCR era da Takara biotecnologie, in Giappone.
campioni di tessuto e la colorazione immunoistochimica
campioni tumorali sono stati ottenuti da 110 pazienti con carcinoma gastrico sottoposti a chirurgia presso il Dipartimento di Chirurgia Oncologica, First affiliato Ospedale di China Medical University durante il periodo 2003-2005. Tutti i pazienti sono stati sottoposti gastrctomy, ed i loro dati clinici e patologici erano disponibili. i tessuti dello stomaco normali sono stati presi dal abbinato margine distale resezione di campioni di cancro gastrico. Tutti i campioni chirurgici sono stati esaminati dai patologi esperti e il margine di resezione distale era libera da tumore. I tessuti freschi sono stati tagliati in piccoli pezzi, snap-congelato in azoto liquido immediatamente, e conservati a -80 ° C fino estrazione delle proteine. Il protocollo di studio è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico della China Medical University. Compra di immunoistochimica, 4 micron sezioni istologiche sono state deparaffinate con xilene e reidratate attraverso una serie graduata di alcol. Le sezioni sono state poi bolliti per 10 min in 0,01 M tampone citrato e perossidasi endogena è stata bloccata mediante incubazione in 0,3% H 2 O 2 in metanolo per 30 min. Il legame non specifico è stata bloccata incubando diapositive con siero di capra normale per 30 minuti a temperatura ambiente. Le sezioni sono state incubate overnight a 4 ° C con 1:50 CTGF anticorpo primario. Le sezioni sono state esposte a anticorpo secondario marcato con biotina per 1 h, ad un sistema di reazione streptavidina-perossidasi, e quindi sviluppate con DAB- H 2 O 2. La colorazione è stato segnato sulla seguente scala: 0, nessuna colorazione; 1+, colorazione minima; 2+, da moderata a forte colorazione in almeno il 20% delle cellule; 3+, forte colorazione in almeno il 50% delle cellule. I casi con 0 o 1+ colorazione sono stati classificati come negativi, ed i casi con 2+ o 3+ colorazione sono stati classificati come positivi.
Cellulare Cultura
linee di cellule di cancro gastrico umano, MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 e MGC803 sono stati ottenuti dal Dipartimento di Biologia cellulare, China Medical University, Cina. Esse sono state coltivate in DMEM contenente siero fetale bovino 10%, 100 U /ml di penicillina, 100 ug /ml di streptomicina a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO 2. Le cellule sono state sloggiati con 0,25% tripsina e 0,02 mol /L EDTA in PBS per sottocultura.
Edilizia di CTGF atterramento stabili linee cellulari
Due piccoli RNA interferenti (siRNA) oligonucleotidi sono stati sintetizzati a bersaglio due regioni diverse in CTGF cDNA: GTGCATCCGTACTCCCAAA (PSC1) e GCTAAATTCTGTGGAGTAT (PSC2). Essi sono stati clonati nel vettore di espressione di siRNA pGCsilencer ™ U6.Neo.GFP. Il siRNA non specifico è stato utilizzato come controllo negativo (PSNC). I plasmidi di espressione siRNA sono stati trasfettati in cellule utilizzando SGC7901 Lipofectamine 2000. Le cellule sono stati esaminati con G418 (800 ug /ml), e le colonie sono stati raccolti dopo 3 settimane, determinati mediante RT-QPCR e Western blot. Le cellule trasfettate con PSC1, PSC2 o PSNC sono stati designati cellule PSC1, cellule PSC2 o cellule PSNC, rispettivamente. Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-QPCR)
RNA totale è stato isolato da pellet cellulari utilizzando Trizol reagente. RNA totale (1 ug) è stato convertito in cDNA utilizzando un RT (trascrittasi inversa) kit di reazione. Real-time PCR è stata effettuata utilizzando in tempo reale del sistema PCR Mx3000P secondo le istruzioni del produttore e SYBR ® Premix ExTaq come un colorante fluorescente specifica del DNA. PCR è stata condotta per 40 cicli di 95 ° C per 5 s e 60 ° C per 40 s. sequenze primer sono riportate in tabella 1. Il ciclo soglia (Ct) è stato ottenuto e quantità relative sono stati determinati per ciascun campione normalizzato a GAPDH. Espressioni di mRNA sono stati calcolati secondo il metodo ΔΔCt [25] .table 1 PCR Primer Sequenze
Gene
Primer sequenze (5'-3 ') in avanti e inverso
prodotto (bp)

CTGF
CTTGCGAAGCTGACCTGGAA
AAAGCTCAAACTTGATAGGCTTGGA
90
MMP-2
ATGACATCAAGGGCATTCAGGAG
TCTGAGCGATGCCATCAAATACA
135
MMP-3
GGGTGAGGACACCAGCATGA
CAGAGTGTCGGAGTCCAGCTTC
178
MMP-9
TCCCAGACCTGGGCAGATTC
GCAAAGGCGTCGTCAATCAC
124
Cyclin D1
GATGCCAACCTCCTCAACGAC
CTCCTCGCACTTCTGTTCCTC
171
GAPDH
GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
TGGTGAAGACGCCAGTGGA
138
Analisi Western Blot
tessuti o cellule sono state lisate in RIPA Buffer di completati con la miscela inibitore della proteasi per 30 minuti a 4 ° C. I lisati cellulari sono stati poi sonicato brevemente e centrifugati (14.000 ga 4 ° C) per 15 minuti per rimuovere i materiali insolubili. Uguali quantità di proteine ​​sono state separate mediante SDS-PAGE e trasferite su una membrana PVDF. Le membrane sono state bloccate con latte in polvere 5% senza grassi e poi incubate con primo anticorpo, seguito da anticorpo secondario perossidasi-coniugato. bande proteiche sono state visualizzate con il metodo di chemiluminescenza ECL.
immagini immunofluorescenza confocale e
Le celle di Lab-Tek colture di tessuti diapositive da camera sono stati fissati a freddo 100% di metanolo per 10 minuti, e poi bloccato con siero normale di capra per 30 min . Le cellule sono state incubate con l'anticorpo primario overnight a 4 ° C, lavate 3 volte in PBT (PBS con 1 ‰ Triton X-100), e poi incubate con secondo anticorpo coniugato con rodamina. Il DAPI colorante DNA è stato usato per colorare il DNA. Le cellule sono state ripreso su una Leica SP2AOBS microscopio confocale.
Medio condizionata (CM) raccolta e immunoenzimatico (ELISA)
3 × 10 5 cellule sono state seminate in 100 millimetri piatto di coltura di tessuti con DMEM contenente 10 siero fetale bovino% per 2 giorni. Quindi le cellule sono state lavate due volte con PBS e incubati con 5 ml di siero DMEM libera. 48 ore più tardi, il mezzo condizionato è stato raccolto e centrifugato a 2000 g per 5 minuti, passati attraverso i filtri (dimensione dei pori, 0,45 um) e conservati a -80 ° C fino all'utilizzo.
I livelli di CTGF nei media non condizionata linee cellulari di cancro gastrico sono stati misurati utilizzando kit ELISA Quantikine umano seguendo le istruzioni del produttore. saggio di proliferazione
MTT
la capacità di proliferazione cellulare è stata valutata utilizzando MTT [3- (4, 5-dimethylthiazol-2-il) -2 , 5-diphenyltrazolium bromuro] saggio. Circa il 5 × 10 3 cellule sono state seminate in piastre di coltura da 96 pozzetti e coltivate in DMEM siero gratuito per 24, 48, 72, e 96 ore, rispettivamente. Quindi le cellule sono state incubate con 20 microlitri MTT (10 mg /ml) per 4 ore a 37 ° Cand 200 ml DMSO è stato pipettato per solubilizzare il prodotto formazan per 20 minuti a temperatura ambiente. La densità ottica (OD) è stata determinata utilizzando uno spettrofotometro (Bio-Rad) alla lunghezza d'onda di 570 nm
. Assay formazione Colony
5 × 10 2 cellule sospese in 2 ml di 0,3% agarosio DMEM medio contenente 10% di siero fetale bovino sono state piastrate in piastre da 6 pozzetti sulla cima esistente 0,6% inferiore agarosio con lo stesso mezzo. Le piastre sono state incubate a 37 ° C in un CO 5% 2 incubatore. Dopo tre settimane, colonie di cellule > 0,1 mm di diametro sono stati contati in un campo microscopico.
Cellulare invasione saggio
L'invasione è stata determinata da un saggio di camera di invasione. Cellule (2 × 10 4) sono state seminate su camera superiore di un filtro a membrana micropori matrigel rivestite con 24 pozzetti con 8 micron pori e la camera inferiore è stato riempito con 0,5 ml di DMEM con 10% di siero fetale bovino come chemiotattico. Dopo incubazione per 24 ore, le cellule non invadere (camera alta) sono stati gentilmente rimosso utilizzando un batuffolo di cotone con punta e invadere le cellule (camera bassa) sono stati fissati con metanolo e colorate con trypan blu. La capacità invasiva è stata determinata dal numero di cellule penetranti sotto un microscopio a 200 × ingrandimenti per 10 campi casuali in ogni
. Dosaggio migrazione ben Sezione
Il metodo di saggio di migrazione in vitro è stato utilizzando un non-matrigel rivestita 24 pozzetti camera di Boyden (8 micron, Millipore). Cellule (2 × 10 4) sono state seminate su inserti sospese in 0,2 ml di terreno DMEM privo di siero. Le cellule non-migrazione sono stati rimossi dalla camera superiore del filtro dopo incubazione per 24 h. cellule migrate sono state colorate e quantificati in base alla procedura descritta in precedenza. test sono stati eseguiti in triplicato per ogni gruppo di cellule in saggi di invasione e di migrazione, ed i risultati sono espressi come media ± SD.
gelatina zimografia
MMP-2 e l'attività di MMP-9 è stato determinato da gelatina zimografia, come descritto in precedenza [ ,,,0],26]. In breve, dopo centrifugazione il supernatante è stato separato e la concentrazione proteica determinata; uguali quantità di proteine, aggiunto da tampone (Tris-HCl 1 M, pH 6,8, sodio dodecil solfato (SDS) 2%, glicerolo 10%) sono stati applicati al 7,5% gel di SDS-poliacrilammide contenente 1 mg /ml di gelatina. Dopo l'elettroforesi, SDS è stato rimosso dal gel lavando due volte con 2,5% TritonX-100 per 1 h. Dopo un breve risciacquo, il gel è stato incubato a 37 ° C per 18 ore in un tampone, pH 7,6, contenente 100 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl 2, 20 mM NaCl. Il gel è stato colorato con1% Coomassie Brilliant Blue R250 per 2 ore e quindi trattata con soluzione decolorante (40% metanolo, acido acetico 10%, 50% di acqua distillata). attività proteolitica è stato rilevato come bande chiare sullo sfondo macchia di substrato digerito nel gel.
studio su animali di impianto peritoneale
Questo esperimento è stato condotto in conformità con le linee guida rilasciata dallo Stato Food and Drug Administration (SFDA della Cina ). Gli animali sono stati alloggiati e curati in conformità con le linee guida stabilite dal Consiglio Nazionale della Scienza della Repubblica Cina
. Femminile BALB /c topi nudi, 35-40 giorni di vita e del peso di 20-22 g, sono stati forniti dal Laboratorio di Shanghai Slac Animal Company Limited. I topi sono stati mantenuti in condizioni sterili e alimentati con una dieta del mouse sterilizzato e acqua. Gli animali sono stati anestetizzati mediante inalazione di isoflurance. PSC1, PSC2, PSNC e SGC7901 cellule (1 × 10 7 cellule) sono state sospese in 0,5 ml DMEM e inoculati nella cavità addominale di topi di prova. I topi sono stati sacrificati sei settimane più tardi, e gli eventuali noduli diffusi presenti sul mesentere e il diaframma sono stati valutati.
Analisi statistica
Tutti i valori nel testo e dati sono presentati come media ± SD. I tassi globali di sopravvivenza sono stati determinati usando Kaplan-Meier stimatore, un evento definito come morte per cancro correlato causa. Il log-rank test è stato utilizzato per identificare le differenze tra le curve di sopravvivenza dei diversi gruppi di pazienti. All'analisi univariata, 2-code χ 2 test per le variabili categoriche e test t 2-code per le variabili continue sono stati utilizzati per i confronti statistici. I valori di p
< 0,05 sono stati presi a mostrare una differenza significativa tra i mezzi.
Risultati
CTGF è sovraespresso nei tumori gastrici e correlati con le caratteristiche clinico-patologici di cancro gastrico pazienti
Abbiamo determinato l'espressione CTGF nei tessuti di cancro gastrico e abbinati tessuti normali distali . Figura 1A illustrato espressione CTGF in cinque pazienti selezionati a caso. Elevati livelli di proteina CTGF stati trovati in tessuti di cancro gastrico umano rispetto ai tessuti normali accoppiati dalla pazienti. Ciò è stato confermato anche dalla colorazione immunoistochimica (Figura 1B). Inoltre, al fine di approfondire la correlazione tra l'espressione di CTGF e le caratteristiche clinico-patologici, 110 campioni sono stati utilizzati per l'esame con colorazione immunoistochimica. L'analisi statistica ha rivelato espressione CTGF positivo era significativamente associato con il grado istologico, metastasi linfonodali e la diffusione peritoneale rispetto a quei pazienti con espressione CTGF negativo (Tabella 2). espressione CTGF positivo era più frequentemente rilevata nel caso di linfonodi metastasi (P = 0,012). I livelli di espressione CTGF sono stati aumentati in modo significativo nei tumori gastrici indifferenziate rispetto ai tumori gastrici differenziati (P ​​= 0,039). E l'espressione della proteina CTGF era significativamente correlata con lo sviluppo di disseminazione peritoneale di cancro gastrico (P = 0,011). Calcolo della durata della sopravvivenza dei 110 pazienti coinvolti con il metodo di Kaplan-Meier ha rivelato che i pazienti che hanno caratterizzato i tumori CTGF-positivi hanno dimostrato una sopravvivenza più breve se confrontato con i pazienti che hanno sofferto di tumori CTGF-negativi (Figura 1C, P < 0,001 ). Figura 1 sovraespressione di CTGF a cancro gastrico con prognosi peggiore. A. analisi Western Blot ha dimostrato l'espressione CTGF nei tessuti di cancro gastrico e abbinati tessuti normali distali da cinque pazienti affetti da cancro gastrico selezionati in modo casuale. B. Immunoistochimica risultati di espressione CTGF in campioni di tessuto di cancro gastrico appaiati. curve di sopravvivenza C. Kaplen-Meir per 110 pazienti con cancro gastrico, raggruppati secondo l'espressione CTGF.
Tabella 2 associazione tra espressione CTGF e le caratteristiche clinico-patologici di pazienti con cancro gastrico (n = 110)

espressione CTGF


negativo positivo

valore di P
Sesso
Maschio
33
34
0,779
femminili
20
23
Età (anni)
≤ 65
35
40
0,642
> 65
18
17
Le dimensioni del tumore (cm)
< 5
26
25
0.585
≥ 5
27
32
Tumore posizione
Inferiore
42
37
0,413
Medio
5
8
Alto 3
6
Tutto il 3
6
grado istologico
differenziata
26
17
0,039 *
indifferenziato
27
40
Lauren grado
intestinale
28
21
0,108
Diffondere
25
36
metastasi linfonodali
negativo
23
12
0,012 *
positivo
30
45
stadio TNM
I
11
8
0,080
II
15
9
III
20
22
IV 7
18
epatica metastasi
negativo
50
55
0.588
positivo 3 2
peritoneale diffusione
negativo
50 | 44
0.011 *

positivo 3
13
* P < 0,05; CTGF, tessuto connettivo fattore di crescita.
Espressione di CTGF in linee gastriche umane delle cellule tumorali e il silenzio siRNA-mediata
In primo luogo, abbiamo esaminato l'espressione CTGF in sei linee di cellule di cancro gastrico (MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 e MGC803) di Western blot. CTGF è stata rilevata in tutte le linee cellulari valutati, e con SGC7901 cellule che esprimono il più alto livello (Figura 2A). Pertanto, SGC7901 cellule sono state selezionate come modello per gli studi di funzione successive. Poiché CTGF biologicamente attiva sia secreto ed espressa nel citoplasma [8, 27], abbiamo misurato anche il livello di secreto CTGF nei media condizionata di queste linee gastrico cellulari tumorali di ELISA, che era coinciso con il livello di CTGF nel citoplasma di ciascuna linea cellulare (Figura 2B). Figura 2 L'espressione di CTGF in linee cellulari di cancro gastrico e atterramento di CTGF di siRNA. A. Western Blot che mostra l'espressione di CTGF in 6 linee di cellule di cancro gastrico. GAPDH servito come il controllo delle proteine ​​di carico. B. CTGF nei mezzi condizionati di 6 linee di cellule di cancro gastrico e cellule trasfettate stabili è stata analizzata mediante ELISA. I risultati sono espressi come pg /ml /1 × 106cells (media ± SD, n = 4). C. occidentale blot analisi di espressione della proteina CTGF in SGC7901, PSNC e CTGF linee cellulari stabili atterramento (PSC1 e PSC2). Analisi D. immunofluorescenza dell'espressione CTGF. E. RT-QPCR che mostra i livelli di mRNA CTGF in SGC7901, PSNC e CTGF linee cellulari stabili atterramento (PSC1 e PSC2). I dati sono espressi come variazione volte rispetto al controllo (controllo è SGC7901). I valori sono espressi come media ± SD di tre esperimenti. * P < 0,05 rispetto al controllo.
Per studiare la funzione di CTGF in SGC7901 cellule, il CTGF atterramento linee cellulari stabili sono stati utilizzati per analizzare l'effetto di silenziamento. Come mostrato nella Figura 2B, il livello di secreto CTGF nel mezzo condizionato è stato significativamente ridotto nelle cellule transfettate siRNA stabile rispetto al controllo. Western blot e immunofluorescenza hanno mostrato che l'espressione di proteine ​​nel citoplasma CTGF diminuisce significativamente nel CTGF knockdown linee cellulari stabili (Figura 2C, D). Inoltre, l'espressione di mRNA CTGF è stato anche significativamente diminuito nel CTGF linee cellulari stabili atterramento (Figura 2E).
Knockdown di espressione CTGF inibisce la crescita di cellule di cancro gastrico
Il saggio formazione di colonie è stato utilizzato per valutare la crescita delle cellule in cui è stato silenziato CTGF. Come mostrato in figura 3A, CTGF cellule knockdown stabili (PSC1 e PSC2) formata significativamente meno colonie su agar morbido rispetto alle cellule SGC7901 e PSNC (83 ± 10, 90 ± 15 vs 30 ± 7 e 20 ± 5, rispettivamente). Per testare ulteriormente l'effetto negativo di CTGF atterramento sulla crescita delle cellule del cancro gastrico, saggio MTT è stato eseguito e curve di crescita sono stati generati (Figura 3B). Come mostrato dalle curve, sia cellule PSC1 e PSC2 proliferavano più lento di cellule PSNC e SGC7901 cellule durante il primo 96 ore dopo le cellule sono state piastrate. La drastica riduzione della formazione di colonie e la crescita delle cellule CTGF silenziate suggerito CTGF soppressione potrebbe regolare negativamente la crescita delle cellule del cancro gastrico. RT-QPCR ha mostrato che i livelli di mRNA di proteine ​​del ciclo cellulare relative ciclina D1 sono stati regolati verso il basso nelle due linee cellulari stabili CTGF knockdown rispetto a PSNC e SGC7901 (Figura 3C). Coerentemente con questo risultato, abbiamo osservato una marcata riduzione dell'espressione della proteina ciclina D1 nelle cellule atterramento CTGF PSC1 e PSC2 (Figura 3D). È interessante notare che il trattamento con mezzo condizionato di SGC7901 che secreto una grande quantità di CTGF è stato in grado di salvare la ciclina D1 downregolazione e ripristinare la proliferazione delle cellule in cellule CTGF atterramento stabili. Questi dati hanno indicato che CTGF soppressione potrebbe regolare negativamente la crescita delle cellule del cancro gastrico e diminuire l'espressione della ciclina D1. Figura 3 Knockdown di espressione CTGF inibisce la crescita di cellule di cancro gastrico. saggio di formazione A. Colony. B. MTT saggio di proliferazione. C. Knockdown di CTGF giù regolato il livello di mRNA della ciclina D1. D. Knockdown di CTGF giù regolato il livello della proteina della ciclina D1. PSC1 /PSC2 + CM di SGC7901: cellule PSC1 o PSC2 sono state incubate con medium condizionato (CM) di SGC7901. Tutti i risultati erano riproducibili in tre esperimenti indipendenti. * P < 0,05 rispetto al controllo (controllo è SGC7901).
Knockdown di espressione CTGF inibisce la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico
migrazione cellulare e dell'invasione sono processi critici di metastasi tumorali. Abbiamo studiato la migrazione delle cellule da parte di non-Matrigel rivestite camera di Boyden e l'invasione delle cellule mediante saggi camera invasione Matrigel rivestite rispettivamente. Nei saggi di migrazione (Figura 4A), tassi di migrazione del PSC1 e cellule PSC2 sono risultati significativamente diminuiti rispetto al controllo (P < 0,05). Come mostrato in Figura 4B, CTGF knockdown anche marcatamente ridotta proprietà di invasione delle cellule rispetto al controllo. tassi cellulare invasione delle cellule PSC1 e PSC2 sono diminuiti del 61,4% e 55,8%, rispettivamente. RT-QPCR e Western Blot hanno mostrato che MMP-2 e MMP-9 sono stati regolati verso il basso nei due cloni stabili rispetto alle cellule di controllo (Figura 4C; D). Al contrario, MMP-3 non è cambiata significativamente, sia in mRNA e livelli di proteine. Inoltre, l'analisi zimografia ha mostrato le attività sia di MMP-2 e MMP-9 nelle cellule transfettate siRNA-stabile erano significativamente più bassi di quelli nelle cellule di controllo (Figura 4E). È interessante notare che il trattamento con medium condizionato di SGC7901 che secreto una grande quantità di CTGF indotto la ri-espressione di MMP-2 e MMP-9 e ripristinato la migrazione e l'invasione del CTGF knockdown cellule stabili. Questi risultati suggeriscono che atterramento di espressione CTGF ridotto la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico e diminuito l'espressione di MMP-2 e MMP-9. Figura 4 Knockdown di espressione CTGF inibisce la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico. test di migrazione delle cellule A.. B. test cellulare invasione. cellule migrazione e l'invasione sono state fissate e colorate, e campi di rappresentanza sono stati fotografati. Per la quantificazione, le cellule sono state contate in 10 campi casuali sotto un microscopio ottico (× 200). saggi sono stati eseguiti in triplicato per ogni gruppo di celle in saggi di invasione e migrazione, ed i risultati sono espressi come media ± SD. C. RT-QPCR è stato fatto per l'analisi dell'espressione dell'mRNA di MMP-2, MMP-3 e MMP-9 nel CTGF smontabili linee cellulari stabili e cellule di controllo. Barre rappresentano la media ± SD di tre esperimenti. D. I livelli di proteina di MMP-2, MMP-3 e MMP-9 sono stati rilevati da Western Blot. GAPDH servito come il controllo delle proteine ​​di carico. Analisi zimografia E. gelatina per le attività di MMP-2 e MMP-9. PSC1 /PSC2 + CM di SGC7901: cellule PSC1 o PSC2 sono state incubate con medium condizionato (CM) di SGC7901 * P. ≪ 0,05 rispetto al controllo (controllo è SGC7901).
L'abbassamento di CTGF inibisce la diffusione peritoneale di cancro gastrico in vivo
Per esplorare gli effetti del CTGF sulla diffusione peritoneale di cellule di cancro gastrico in vivo, abbiamo inoculato le cellule differenti in topi nudi. cellule SGC7901, controllano linea cellulare stabile (PSNC), e le cellule CTGF atterramento stabili (PSC1 e PSC2) sono state iniettate in quattro distinti gruppi di topi nudi. Come conseguenza di tale trattamento, la soppressione misurabile di disseminazione peritoneale in topi iniettati con cellule stabili CTGF knockdown rispetto a quelli iniettati con SGC7901 cellule o cellule PSNC stato osservato (Figura 5A). Quantitativamente, 117 ± 20 noduli diffusi sono stati notati per i topi di test inoculati con SGC7901 cellule e 137 ± 26 noduli diffusi sono stati notati per topi inoculati con le cellule PSNC. Al contrario, significative noduli disseminati un minor numero di stati in grado di essere osservato per i topi iniettati con cellule stabili CTGF atterramento (Figura 5B). Figura 5 Knockdown di CTGF inibisce il cancro gastrico SGC7901 xenotrapianto diffusione peritoneale. SGC7901, PSNC e CTGF linee cellulari stabili atterramento (PSC1 e PSC2) sono state iniettate per via intraperitoneale come descritto in "Materiali e Metodi". 6 settimane dopo, i topi sono stati sacrificati, fotografati, sezionati e le eventuali noduli diffusi presenti sul mesentere e il diaframma sono stati contati. A. La fotografia di topi nudi con diffusione peritoneale di ogni gruppo. B. I noduli diffusi sono stati valutati. Ogni barra rappresenta la media ± SD (n = 5 per ciascun gruppo). * P < 0,05 rispetto al controllo (controllo è SGC7901)
. Discussione
la più vasta letteratura fino ad oggi per quanto riguarda CTGF definisce il suo ruolo nella guarigione delle ferite e la malattia fibrotica. Recentemente, diversi studi implicano CTGF nello sviluppo del tumore e la sopravvivenza delle cellule tumorali [28-30]. Tuttavia, il ruolo esatto di CTGF nella progressione tumorale non è preciso, e la funzione di CTGF nella biologia delle cellule tumorali del cancro gastrico non è stata oggetto di studi approfonditi. Per affrontare questi problemi, abbiamo valutato l'espressione CTGF per quanto riguarda le possibili correlazioni dirette con la crescita cellulare e l'invasione delle cellule di cancro gastrico. Inoltre, abbiamo studiato ulteriormente gli effetti di CTGF sulla diffusione peritoneale di cellule di cancro gastrico in vivo.
In questo studio, i nostri risultati hanno dimostrato che CTGF è stato altamente espresso nei tessuti di cancro gastrico rispetto ai tessuti normali gastrici abbinati. L'espressione di CTGF nel carcinoma gastrico indifferenziata era significativamente più alto rispetto a quelli di cancro gastrico differenziato. L'espressione CTGF nel tessuto tumorale è stato associato con metastasi linfonodali e la diffusione peritoneale. Inoltre, i pazienti con espressione CTGF positivo era significativamente inferiore post-operatorio cumulativo tasso di sopravvivenza a 5 anni (22,9%) rispetto a quelli con l'espressione CTGF negativo (48,1%, Figura 1C). Questi risultati suggeriscono che CTGF potrebbe essere coinvolto nella progressione e la metastasi del cancro gastrico. Inoltre, CTGF potrebbe essere un marcatore prognostico utile.
Diversi studi recenti hanno rivelato che CTGF regolano la crescita delle cellule in cellule di cancro esofageo e cellule tumorali pancreatiche [20, 30]. Tuttavia, poco si sa circa l'effetto di espressione CTGF sulla crescita cellulare delle cellule di cancro gastrico. I nostri risultati hanno dimostrato che la soppressione CTGF provocato inibizione della proliferazione cellulare e la crescita clonogenica.

• numero più elevato di siti di fosforilazione Helicobacter pylori CagA Epiya C aumenta il rischio di cancro gastrico, ma non ulcera duodenale
• profili del numero di copie di DNA di lesioni cancro gastrico precursori