Подавление фактора роста ткани соединительной препятствует росту и инвазии клеток рака желудка и затухает перитонеальный распространение

Подавление фактора роста тканей соединительнотканной препятствует росту и инвазии клеток рака желудка и затухает перитонеальный распространение
Аннотация
фон
фактор роста соединительной ткани (CTGF) было показано, что они причастны к развитию опухоли и прогрессии. Тем не менее, роль CTGF при раке желудка остается в значительной степени неизвестны.

Результаты В этом исследовании мы показали, что CTGF была высоко выражена в желудочном раковых тканях по сравнению с нормальными совпавших желудочных тканей. Выражение CTGF в опухолевой ткани была связана с гистологической класса, метастазов в лимфатических узлах и перитонеального распространения (P < 0,05). Пациенты с положительным выражением CTGF имели значительно более низкую кумулятивная послеоперационную 5 летняя выживаемость, чем те, с отрицательным выражением CTGF (22,9% против 48,1%, P < 0,001). Мы показали, что нокдаун экспрессии CTGF роста значительно заторможенном клеток клеток рака желудка и снижение циклин D <суб> 1 выражение. Более того, нокдаун экспрессии CTGF также заметно снизило миграцию и инвазию клеток рака желудка и снижение экспрессии матричных металлопротеиназ (MMP) -2 и MMP-9. Исследования на животных показали, что голых мышей инъецируют ФРСТ нокдаун стабильные клеточные линии признакам меньшее количество перитонеальных узелков высева, чем линии контрольных клеток.
Выводы
Эти данные свидетельствуют о том, что CTGF, играет важную роль в росте клеток и инвазии в рак желудка человека и, как представляется, является потенциальным прогностическим маркером для пациентов с раком желудка.
Ключевые слова
рост тканей пролиферации Connective фактор Желудок новообразования сотовый распространения Инвазивность перитонеального Введение
Несмотря на значительные успехи в исследовании рака, рак остается во всем мире проблемы со здоровьем и смертность от рака остается на высоком уровне [1]. Рак желудка является второй ведущей причиной рака, связанных смерти в мире в то время, как представляется, тенденция к снижению появления, особенно в западных странах; она по-прежнему широко сообщалось в Китае и Японии [2, 3]. Даже при том, что прогноз у пациентов с распространенным раком желудка, кажется, улучшились в результате стандартизации хирургических методов и последних достижений в области химиотерапии, 5-летняя выживаемость послеоперационная остается низкой [4, 5]. Перитонеальный метастаз является наиболее распространенной и значимой причиной смертности после операции по поводу рака желудка [6, 7]. Тем не менее, механизмы перитонеального метастазирования не были четко определены.
Фактор роста соединительной ткани (CTGF), также известный как CCN2, является членом семейства CCN, в том числе богатых цистеином белок 61 (Cyr61), также известный как CCN1, и нефробластома-над выраженным геном (ноябрь), также известный как CCN3, а также WISP-1 /elm1 (CCN4), WISP-2 /rcop1 (CCN5) и WISP-3 (CCN6) [8, 9]. ФРСТ, как полагают, является многофункциональным сигнализации модулятор участвуют в самых разнообразных биологических или патологических процессов, таких как ангиогенез, остеогенез, фиброза в почках и коже, а также развитие опухолей [10-12]. Хотя роль CCN2 в нормальном фиброзом тканей была хорошо изученной [13], функция CCN2 при раке не так хорошо изучены. Интересно отметить, что CCN2 был идентифицирован как онкоген в различных типах рака, но считается ген опухолевого супрессора в других формах рака [14]. Сверхэкспрессия CTGF встречается при раке предстательной железы [15], глиомы [16], рак молочной железы [17], а также взрослых острый лимфобластный лейкоз [18]. Повышенная экспрессия CTGF была связана с развитием рака шейки матки, [19], и пищевода плоскоклеточного рака [20]. С другой стороны, в аденокарциномы легких [21] и рака толстой кишки [22], избыточная экспрессия CTGF ингибирует инвазию и метастазирование раковых клеток в пробирке и в естественных условиях.
Клинические исследования показали, что избыточная экспрессия CTGF была достоверно коррелирует с лимфатического узла метастаз и плохой прогноз у больных раком желудка [23, 24]. Однако точная роль CTGF при раке желудка до сих пор неизвестна. В этом исследовании мы обнаружили экспрессию CTGF в желудочном раковых тканей. Мы обнаружили, что CTGF был избыточно экспрессируется при раке желудка, и его экспрессия была связана с агрессивным поведением рака желудка. Затем мы использовали технологию миРНК в нокдаун эндогенной экспрессии CTGF в клетках рака желудка. Мы показали, что подавление CTGF ингибирует рост и инвазии рака желудка в пробирке и ослабляется перитонеальный распространение в естественных условиях. Наше исследование решительно подчеркивает значение CTGF в росте и инвазии рака желудка, а также может обеспечить терапевтическую мишень в раке желудка.
Материалы и методы
реактивы
диметилсульфоксиде (ДМСО) и трипсин были приобретены у Sigma (Сент-Луис, штат Миссури, США). DMEM, стрептомицин и другие расходные материалы для культивирования клеток были из GibcoBRL (Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США). Эмбриональная бычья сыворотка была от Hyclone (Logan, UT, USA). МТТ [3- (4, 5-диметилтиазол-2-ил) -2, 5-diphenyltrazolium бромид] был получен из фирмы Fluka (Ронконкома, Нью-Йорк, США). ФРСТ, циклин D1, матриксной металлопротеиназы (ММР) -2, ММР-3, ММР-9 и GAPDH, первичное антитело, а также второе антитело родамина (TRITC) -conjugated affinipure козы против мышиного IgG, были получены от Santa Cruz Biotechnology (Santa Круз, Калифорния, США). ФРСТ ELISA набор был приобретен у R &Amp; D (Миннеаполис, штат Миннесота, США). Trizol и Липофектамин 2000 были приобретены у Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США). SYBR @ Primescript ™ RT-PCR набор был от Takara Biotechnology, Япония.
Образцы тканей и иммуногистохимического окрашивания
образцов опухоли были получены из 110 больных раком желудка, перенесших операцию в отделении хирургической онкологии, First Аффилированные больницы Китайского медицинского университета в период 2003-2005 годов. Все пациенты прошли gastrctomy, и их клинические и патологические данные были доступны. Нормальные ткани желудка были взяты из согласованного дистальный резекцию края образцов желудочного рака. Все хирургические образцы были исследованы опытными патологи и дистальная резекция маржа была без опухоли. Свежие ткани разрезают на мелкие кусочки, быстро замораживали в жидком азоте немедленно, и хранили при -80 ° С до экстракции белка. Протокол исследования был рассмотрен и одобрен Комитетом по этике Китайского медицинского университета им.
Для иммуногистохимического окрашивания, 4 мкм гистологические срезы депарафинировали с ксилолом и регидратации через градуированных серии спирта. Срезы затем кипятят в течение 10 мин в 0,01 М цитратном буфере и эндогенные пероксидазы блокировали путем инкубации в 0,3% Н <суб> 2 O <суб> 2 в метаноле в течение 30 мин. Неспецифическое связывание блокировали инкубированием слайды с нормальной козьей сывороткой в ​​течение 30 мин при комнатной температуре. Срезы инкубировали в течение ночи при 4 ° С с 1:50 разбавлением CTGF первичного антитела. Срезы подвергали воздействию меченного биотином вторичными антителами в течение 1 ч, к реакционной системе стрептавидин-пероксидаза, а затем разработана с DAB- H <суб> 2 O <суб> 2. Окрашивание был забит по следующей шкале: 0, отсутствие окрашивания; 1+, минимальное окрашивание; 2+, от умеренной до сильной окраски в по меньшей мере 20% клеток; 3+, сильное окрашивание, по меньшей мере 50% клеток. Случаи с 0 или 1+ окрашивания были классифицированы как отрицательные, а также случаи с 2+ или 3+ окрашивания были классифицированы как положительные.
Клеточной культуре
желудка человека линии клеток рака, MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 и MGC803 были получены из Департамента клеточной биологии, Китайского медицинского университета, Китай. Они культивировали в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ед /мл пенициллина, 100 мкг /мл стрептомицина при 37 ° С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO <югу> 2. Клетки были вытеснены с использованием 0,25% трипсина и 0,02 моль /л EDTA в PBS для субкультуры.
Конструирование CTGF нокдаун стабильных клеточных линий
Две малые интерферирующие РНК (миРНК) олигонуклеотиды были синтезированы целевой двух различных регионах в CTGF кДНК: GTGCATCCGTACTCCCAAA (PSC1) и GCTAAATTCTGTGGAGTAT (PSC2). Они были клонированы в экспрессирующий вектор миРНК pGCsilencer ™ U6.Neo.GFP. Неспецифический миРНК был использован в качестве отрицательного контроля (PSNC). Плазмиды экспрессии миРНК были трансфицированы в клетки с использованием SGC7901 липофектамин 2000. Клетки подвергали скринингу с использованием G418 (800 мкг /мл), а колонии отбирали через 3 недели, определяемых с помощью ОТ-QPCR и Вестерн-блоттинга. Клетки, трансфицированные PSC1, PSC2 или PSNC были назначены PSC1 клетки, PSC2 клетки или клетки PSNC соответственно.
В реальном времени количественной полимеразной цепной реакции (ОТ-КПЦР)
Общую РНК выделяли из клеточных гранул с использованием реагента тризола. Суммарную РНК (1 мкг) превращали в кДНК с использованием RT (с использованием обратной транскриптазы) реакции комплект. ПЦР в реальном времени проводили с использованием Mx3000P в режиме реального времени система PCR в соответствии с инструкцией изготовителя и SYBR ® Премикс ExTaq в качестве ДНК-специфического флуоресцентного красителя. ПЦР проводили в течение 40 циклов при 95 ° С в течение 5 с и 60 ° С в течение 40 сек. Последовательности праймеров приведены в таблице 1. Пороговое значение цикла (Ct) был получен и относительные количества были определены для каждого образца, нормированное к GAPDH. Выражения мРНК были рассчитаны с использованием метода ΔΔCt [25] .table 1 ПЦР-праймеров
Gene

праймера (5'-3 ') вперед и назад

продукта (bp)

CTGF
CTTGCGAAGCTGACCTGGAA
AAAGCTCAAACTTGATAGGCTTGGA
90
MMP-2
ATGACATCAAGGGCATTCAGGAG
TCTGAGCGATGCCATCAAATACA
135
MMP-3
GGGTGAGGACACCAGCATGA
CAGAGTGTCGGAGTCCAGCTTC
178
MMP-9
TCCCAGACCTGGGCAGATTC
GCAAAGGCGTCGTCAATCAC
124
Cyclin D1
GATGCCAACCTCCTCAACGAC
CTCCTCGCACTTCTGTTCCTC
171
GAPDH
GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
TGGTGAAGACGCCAGTGGA
138
Вестерн-блот-анализ
ткани или клетки лизируют в RIPA буфера с добавлением ингибитора протеазы смесь в течение 30 мин при 4 ° C. Клеточные лизаты затем обрабатывали ультразвуком и центрифугировали на короткое время (14 000 г при температуре 4 ° С) в течение 15 мин для удаления нерастворимых материалов. Равные количества белка разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на PVDF мембрану. Мембраны блокировали 5% обезжиренным сухим молоком, а затем инкубировали с первым антителом, с последующим конъюгированного с пероксидазой хрена вторичного антитела. Белковые полосы визуализировали методом хемилюминесценции ECL.
Иммунофлуоресценции и конфокальной изображений
Клетки лабораторному-TEK для культивирования тканей камеры слайдов фиксируют в холодном 100% метанолом в течение 10 мин, а затем блокировали нормальной козьей сывороткой в ​​течение 30 мин , Клетки инкубировали с первичным антителом в течение ночи при 4 ° C, промывали 3 раза в PBT (PBS с 1 ‰ Тритон Х-100), а затем инкубируют с вторым антителом, конъюгированным с родамина. DAPI краситель ДНК использовали для окрашивания ДНК. Клетки были обследованы на Leica SP2AOBS конфокальной микроскопии.
Кондиционированную среду (CM) сбор и иммуноферментный анализ (ИФА)
3 × 10 5 клеток были высеяны в 100 мм блюдо культуры ткани с DMEM, содержащей 10 % фетальной бычьей сыворотки в течение 2-х дней. Затем клетки дважды промывали PBS и инкубировали с 5 мл DMEM без сыворотки. 48 ч позже, кондиционированную среду собирали и центрифугировали при 2000 г в течение 5 мин, пропускают через фильтры (размер пор 0,45 мкм,) и хранили при -80 ° С до использования.
Уровни CTGF в кондиционированной среде от желудка линий раковых клеток измеряли с использованием человеческого набора Quantikine ELISA в соответствии с инструкциями изготовителя.
анализ пролиферации МТТ
способность клеточной пролиферации оценивали с помощью МТТ [3- (4, 5-диметилтиазол-2-ил) -2 , бромид 5-diphenyltrazolium] анализа. Приблизительно 5 × 10 3 клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты и культивировали в среде DMEM, содержащей сыворотку в течение 24, 48, 72 и 96 ч, соответственно. Затем клетки инкубировали с 20 мкл МТТ (10 мг /мл) в течение 4 часов при 37 ° 200 мкл канд ДМСО пипеткой для солюбилизации формазана продукт в течение 20 мин при комнатной температуре. Оптическая плотность (ОП) определяли с помощью спектрофотометра (Bio-Rad) на длине волны 570 нм.
Колонии формирования анализа
5 × 10 2 клеток, суспендированных в 2 мл 0,3% агарозы среде ДМЕМ содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, высевали в 6-луночные планшеты на верхней части существующих 0,6% агарозы дно с той же средой. Чашки инкубировали при 37 ° С в 5% CO <суб> 2 инкубаторе. Через три недели, клеточных колоний > 0,1 мм в диаметре подсчитывали под поле зрения микроскопа.
Инвазии клеток Анализ
Вторжение определяли с помощью анализа вторжения камеры. Клетки (2 × 10 4) были высеяны на верхнюю камеру мембранного фильтра с микропорами с матригелем 24-луночного с 8 мкм порами, а нижняя камера была заполнена 0,5 мл DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки в качестве хемоаттрактантной. После инкубации в течение 24 ч, не-вторгаются клетки (верхняя палата) были аккуратно удалены с помощью ватным тампоном и вторгаются клетки (нижняя палата) были зафиксированы с использованием метанола и окрашивали трипановым синим. Инвазивная способность определялась по количеству проникающих клеток под микроскопом при 200-кратном увеличении на 10 случайных полей в каждую лунку.
Анализа миграции палаты
Метод экстракорпорального анализа миграции использует не-матригелем 24-хорошо Бойден камеры (8 мкм, Millipore). Клетки (2 × 10 4) были высеяны на вставках суспендируют в 0,2 мл бессывороточной DMEM среде. Немигрирующим клетки были удалены из верхней камеры фильтра после инкубации в течение 24 ч. Перенесенные клетки окрашивали и подсчитаны на основе процедуры, как описано ранее. Три параллельные пробы анализы проводили для каждой группы клеток, в инвазии и миграции анализы, и результаты выражали в виде средних значений ± SD.
Желатин зимографии
ММР-2 и ММР-9 активность определяли с помощью желатина зимографии, как описано ранее [ ,,,0],26]. Вкратце, после центрифугирования супернатант отделяли и концентрацию белка определяли; равные количества белка, добавленные образца буфера (Трис-HCl, 1 М, рН 6,8, натрия додецилсульфат (SDS) 2%, глицерол 10%) наносили на 7,5% SDS-полиакриламидном геле, содержащем 1 мг /мл желатина. После электрофореза ДДС удал ли из геля дважды промывку с использованием 2,5% Тритон Х-100 в течение 1 ч. После краткого полоскание, гель инкубировали при 37 ° С в течение 18 часов в буфере, рН 7,6, содержащего 100 мМ Трис-HCl, 10 мМ CaCl <суб> 2, 20 мМ NaCl. Гель окрашивали с1% кумасси бриллиантовым голубым R250 в течение 2 ч, а затем обрабатывают раствором Обесцвечивание (40% метанола, 10% уксусной кислоты, 50% дистиллированной воды). Протеолитическая активность была обнаружена в виде прозрачных полос на фоне пятна непереваренной субстрата в геле.
Исследование на животных перитонеального имплантации
Этот эксперимент был проведен в соответствии с директивой, выданного Государственным пищевых продуктов и медикаментов (SFDA Китая ). Животных содержали и уход в соответствии с руководящими принципами, установленными Национальным Научным Советом Республики Китай.
Женский BALB /C голых мышей, 35-40 дней и весом 20-22 г, были предоставлены лабораторией Shanghai SLAC животных с ограниченной ответственностью. Мышей содержали в стерильных условиях и кормили стерилизованный диету мыши и воду. Животных анестезировали с помощью ингаляции isoflurance. PSC1, PSC2, PSNC и SGC7901 клетки (1 × 10 7 клеток) суспендировали в 0,5 мл DMEM и прививали в брюшную полость подопытных мышей. Мышей умерщвляли через шесть недель спустя, и любые распространяемые узелки, присутствующие на брыжейки и диафрагмы были оценены.
Статистический анализ
Все значения в тексте и цифры представлены в виде среднего значения ± SD. В целом показатели выживаемости были определены с использованием Каплана-Мейера оценщик, событие определяется как смерть для рака коррелируют причины. Тест журнала ранга был использован для определения различий между кривыми выживаемости разных групп пациентов. В одномерном анализе, 2 хвостами χ 2 тесты для категориальных переменных и 2-белохвоста испытаний Т для непрерывных переменных были использованы для статистических сравнений. Значения р
&ЛТ; 0,05 были приняты, чтобы показать существенную разницу между средствами.
Результаты
CTGF избыточно экспрессируется в рака желудка и коррелирует с клинико-патологическими особенностями рака желудка у пациентов
Мы определили экспрессию CTGF в желудочном раковых тканей и соответствует дистальных нормальных тканей , Фигура 1А иллюстрирует экспрессию CTGF в пяти произвольно выбранных пациентов. Повышенные уровни белка CTGF были обнаружены в человеческих тканях желудка железы по сравнению с парными нормальными тканями от пациентов. Это было также подтверждено иммуногистохимического окрашивания (рис 1B). Кроме того, в целях дальнейшего изучения корреляции между экспрессией CTGF и клинико-патологическими особенностями, 110 образцов были использованы для исследования с иммуногистохимического окрашивания. Статистический анализ показал положительный выражение ФРСТ было в значительной степени связано с гистологической класса, метастазов в лимфатических узлах и перитонеальный распространение по сравнению с теми пациентами с отрицательным выражением CTGF (таблица 2). Положительная экспрессия CTGF была чаще обнаруживается в тех случаях, лимфатических узлов метастазирования (Р = 0,012). Уровни экспрессии CTGF были значительно увеличены в недифференцированных рака желудка по сравнению с дифференцированными рака желудка (P = 0,039). И экспрессия белка CTGF была достоверно коррелирует с развитием перитонеального распространения рака желудка (Р = 0,011). Расчет продолжительности выживаемости 110 участвующих пациентов по методу Каплана-Мейера показал, что пациенты, которые признакам CTGF-позитивных опухолей продемонстрировали меньшую выживаемость по сравнению с теми пациентами, которые страдали от CTGF-негативных опухолей (рис 1C, P < 0,001 ). Рисунок 1 оверэкспрессия CTGF при раке желудка с плохим прогнозом. А. Вестерн-блот-анализ показал, экспрессию CTGF в желудочном раковых тканей и совпадающим дистальных нормальных тканей от пяти произвольно отобранных больных раком желудка. B. Иммуногистохимия результаты экспрессии CTGF в парных образцах ткани желудка рака. Кривые выживаемости С.-Меир каплен, волокно пропиленовое для 110 пациентов с раком желудка, сгруппированных в соответствии с выражением CTGF.
Таблица 2 Связь между выражением CTGF и клиникопатологическими характеристики больных раком желудка (n = 110)
<й>
выражение CTGF

<й>
<й>
Негативный

Положительный

значение P


ГЕНДЕРНЫЙ Мужской
33
34
0.779
Женский
20
23
возраст (лет)
≤ 65
35
40
0,642
> 65
18
17
Опухоль размер (см)
&л; 5
26
25
0,585
≥ 5
27
32
Опухоль расположение

42 Уменьшите величину
37
0,413
Средний страница 5 из 8
Верхняя страница 3 из 6
Вся страница 3 из 6
Гистологическое комплектация
Дифференцированный
26
17
0,039 *
недифференцированных
27
40
Lauren комплектация
Кишечные
28
21
0,108
Диффузный
25
36 узел метастаз
лимфа
Негативный
23
12
0,012 *
позитиве
30
45
TNM этап
I
11
8
0,080
II
15
9
III
20
22
IV
7
18
печени метастазирование
Отрицательное
50
55
0,588
позитиве
3 страница 2 перитонеальный распространение
Негативный
50
44
0,011 *
Положительная страница 3 из 13
* P &л; 0,05; CTGF, фактор роста соединительной ткани.
Экспрессия CTGF в желудочном линиях раковых клеток человека и миРНК опосредованного молчания
Во-первых, мы исследовали экспрессию CTGF в шести желудочных линий раковых клеток (MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 и MGC803) с помощью Вестерн-блоттинга. ФРСТ был обнаружен во всех клеточных линиях, оцененных, и с SGC7901 клетки, экспрессирующие на самом высоком уровне (фиг.2А). Поэтому SGC7901 клетки были выбраны в качестве модели для последующих исследований функций. Поскольку биологически активные ФРСТ является как секретируемый и выражается в цитоплазме [8, 27], мы также измеряли уровень секретируемого CTGF в кондиционированной среде этих желудочных линий раковых клеток с помощью ELISA, который был совпадал с уровнем CTGF в цитоплазме каждой линии клеток (Фигура 2В). Рисунок 2. Экспрессия CTGF в желудочном линиях раковых клеток и нокдаун CTGF по миРНК. А. Вестерн-блот, показывающий экспрессию CTGF в 6 желудочных линиях раковых клеток. GAPDH служил в качестве контроля белка нагрузки. Б. ФРСТ в кондиционированной среды 6 желудочных линий раковых клеток и устойчивых трансфицированных клеток анализировали с помощью ELISA. Результаты выражали в виде пг /мл /1 × 106cells (среднее ± стандартное отклонение, n = 4). С. Вестерн-блот-анализ экспрессии белка CTGF в SGC7901, PSNC и CTGF нокдаун стабильные клеточные линии (PSC1 и PSC2). D. Иммунофлуоресценции анализ экспрессии CTGF. E. RT-КПЦР показывающий уровни мРНК CTGF в SGC7901, PSNC и CTGF нокдаун стабильные клеточные линии (PSC1 и PSC2). Данные выражены как кратное изменение по сравнению с контролем (контроль SGC7901). Значения приведены в виде среднего значения ± SD из трех экспериментов. * P &л; 0,05 по сравнению с контролем.
Для изучения функции CTGF в клетках SGC7901, то ФРСТ нокдаун стабильные клеточные линии были использованы для анализа эффекта глушения. Как показано на фигуре 2В, уровень секретируемого CTGF в кондиционированной среде была значительно уменьшилось в киРНК-стабильной трансфекции клеток по сравнению с контролем. Вестерн-блот и иммунофлюоресценции окрашивание показало, что экспрессия белка CTGF в цитоплазме заметно уменьшилась в CTGF нокдаун стабильных клеточных линий (фиг.2с, D). Кроме того, экспрессия мРНК CTGF также значительно уменьшилась в CTGF нокдаун стабильные клеточные линии (рис 2E).
Нокдаун экспрессии CTGF ингибирует рост клеток рака желудка
Анализ образования колоний использовали для оценки роста из клеток, в которых ФРСТ притихли. Как показано на фигуре 3А, CTGF нокдаун стабильные клетки (PSC1 и PSC2) образуется значительно меньшее количество колоний на мягком агаре по сравнению с SGC7901 и PSNC клеток (83 ± 10, 90 ± 15 против 30 ± 7 и 20 ± 5 соответственно). Для дальнейшего тестирования негативного эффекта CTGF нокдаун на желудочную роста раковых клеток, MTT анализ проводили и кривые роста были получены (фигура 3В). Как показано с помощью кривых, оба PSC1 и PSC2 клетки пролиферируют медленнее, чем клетки PSNC и SGC7901 клеток в течение первых 96 ч после того, как клетки высевали. Резкое снижение образования колоний и роста ФРСТ молчащих клеток предложил подавление CTGF может отрицательно регулировать желудка рост раковых клеток. RT-КПЦР показали, что уровни мРНК, связанных с клеточного цикла белка циклин D1 были вниз регулируется в двух CTGF нокдаун стабильных клеточных линий по сравнению с PSNC и SGC7901 (рис 3C). В соответствии с этим результатом, мы наблюдали заметное снижение экспрессии белка циклина D1 в CTGF нокдаун клеток PSC1 и PSC2 (Рисунок 3D). Интересно отметить, что лечение с помощью кондиционированной среды SGC7901 которая секретируется большое количество CTGF смог спасти циклин D1 и понижающей регуляции восстановить клеточную пролиферацию в CTGF нокдаун стабильные клетки. Эти данные свидетельствуют о том, что подавление ФРСТ может негативно регулировать желудочный рост раковых клеток и уменьшения экспрессии D1 циклин. Рисунок 3 нокдаун экспрессии CTGF ингибирует рост клеток рака желудка. A. Colony образование анализа. B. Анализ пролиферации МТТ. C. Нокдаун CTGF вниз регулирует уровень мРНК циклина D1. D. Нокдаун CTGF вниз регулирует уровень белка циклина D1. PSC1 /PSC2 + СМ SGC7901: PSC1 или PSC2 клетки инкубировали с кондиционированной среды (см) SGC7901. Все результаты были воспроизводимыми в трех независимых экспериментах. * P &л; 0,05 по сравнению с контролем (контроль SGC7901).
Нокдаун экспрессии CTGF ингибирует миграцию и инвазии клеток рака желудка
Миграция клеток и инвазии критические процессы в метастазировании опухолей. Мы исследовали клеточную миграцию не-Матригель покрытием Бойденом камеры и инвазии клеток путем матригелем нашествие камеры анализов, соответственно. В миграционных анализах (фиг.4А), показатели миграция PSC1 и клетки PSC2 были значительно уменьшились по сравнению с контролем (Р &ЛТ; 0,05). Как показано на фиг.4В, ФРСТ нокдаун также заметно снижается свойства проникновению клеток по сравнению с контролем. ставки клеток вторжения в PSC1 и PSC2 клеток были снижены на 61,4% и 55,8%, соответственно. RT-КПЦР и Вестерн-блот показал, что ММР-2 и ММР-9 были вниз регулируется в двух стабильных клонов по сравнению с контрольными клетками (фиг.4С; D). В противоположность этому, ММР-3 существенно не изменилось, как в мРНК и белка уровнях. Кроме того, анализ показал, зимографии деятельность как ММР-2 и ММР-9 в киРНК-стабильной трансфекции клеток были значительно ниже, чем в контрольных клетках (рис 4д). Интересно отметить, что лечение с помощью кондиционированной среды SGC7901 которая секретируется большое количество CTGF индуцируется повторной экспрессии ММР-2 и ММР-9 и восстановили миграцию и вторжение в CTGF нокдаун стабильные клетки. Эти результаты свидетельствуют о том, что нокдаун экспрессии CTGF уменьшил миграцию и инвазии клеток рака желудка и снижение экспрессии ММР-2 и ММР-9. Рисунок 4 нокдаун экспрессии CTGF ингибирует миграцию и инвазии клеток рака желудка. А. Анализ Миграцию клеток. B. инвазии клеток для анализа. Миграция и инвазия клетки фиксировали и окрашивали, и представительные поля были сфотографированы. Для количественной оценки, клетки подсчитывали в 10 случайных полей под световым микроскопом (× 200). Три параллельные пробы анализы проводили для каждой группы клеток, в инвазии и миграции анализы, и результаты выражают в виде среднего ± SD. С. РТ-КПЦР было сделано для анализа экспрессию мРНК ММР-2, ММР-3 и ММР-9 в CTGF нокдаун устойчивые клеточные линии и контрольные клетки. Бары представляют собой среднее ± SD из трех экспериментов. D. Уровни белка ММР-2, ММР-3 и ММР-9 были обнаружены с помощью Вестерн-блоттинга. GAPDH служил в качестве контроля белка нагрузки. Анализ зимографии E. Желатин для деятельности ММР-2 и ММР-9. PSC1 /PSC2 + СМ SGC7901: PSC1 или PSC2 клетки инкубировали с кондиционированной среды (см) SGC7901 * Р &л;. 0,05 по сравнению с контролем (контроль SGC7901).
Подавление CTGF ингибирует перитонеальный распространение рака желудка в естественных условиях
Чтобы исследовать эффекты CTGF на брюшную распространение клеток рака желудка в естественных условиях, мы прививали различные клетки в голых мышей. SGC7901 клетки, контролировать стабильную клеточную линию (PSNC), и CTGF нокдаун стабильные клетки (PSC1 и PSC2) вводили в четыре отдельные группы голых мышей. Как следствие такого лечения, измеримой подавления перитонеального распространения у мышей, которым вводили CTGF нокдаун устойчивыми клетками по сравнению с теми, инъецируют SGC7901 клетки или клетки PSNC было отмечено (рис 5А). Количественно, 117 ± 20 вкрапленные узелки были отмечены для тест-мышей, привитых SGC7901 клеток и 137 ± 26 вкрапленных узелков были отмечены у мышей, инокулированных клетками PSNC. В отличие от этого, значительные меньше вкрапленные узелки удалось наблюдать у мышей, которым вводили CTGF нокдаун стабильные клетки (рис 5б). Рисунок 5 Нокдаун CTGF подавляет рак желудка SGC7901 ксенотрансплантата перитонеальный распространение. SGC7901, PSNC и CTGF нокдаун стабильные клеточные линии (PSC1 и PSC2) вводили внутрибрюшинно, как описано в разделе "Материалы и методы". 6 недель спустя, мыши были пожертвованы, фотографировали, рассекали и любые распространяемые узелки, присутствующие на брыжейки и диафрагмы подсчитывались. A. На фотографии голых мышей с перитонеальной диссеминации из каждой группы. B. Распространяемые узелки были оценены. Каждый столбик представляет собой среднее ± стандартное отклонение (n = 5 для каждой группы). * P &л; 0,05 по сравнению с контролем (контроль SGC7901).
Обсуждение
Самая обширная литература на сегодняшний день в отношении CTGF определяет свою роль в заживления ран и фиброзной болезни. В последнее время ряд исследований, вовлекают CTGF в развитии опухоли и выживаемости опухолевых клеток [28-30]. Тем не менее, точная роль CTGF в прогрессии опухоли не является определенной, а функция CTGF в клеточной биологии опухолей рака желудка не был тщательно исследован. Для решения этих вопросов, мы оценили экспрессию CTGF в отношении возможных прямых корреляций с ростом клеток и инвазии клеток рака желудка. Кроме того, мы также исследовали влияние CTGF на брюшную распространение клеток рака желудка в естественных условиях.
В этом исследовании наши результаты показали, что CTGF была высоко выражена в желудочном раковых тканях по сравнению с нормальными совпавших желудочных тканей. Экспрессия CTGF в недифференцированном раке желудка была значительно выше, чем те, в дифференцированном раке желудка. Выражение CTGF в опухолевой ткани была связана с метастазов в лимфатических узлах и перитонеального распространения. Кроме того, пациенты с положительным выражением CTGF имели значительно более низкую кумулятивная послеоперационную 5 летняя выживаемость (22,9%), чем те, с отрицательным выражением CTGF (48,1%, рис 1C). Эти результаты свидетельствуют о том, что CTGF, могут быть вовлечены в прогрессии и метастазирования рака желудка. Кроме того, CTGF может быть полезным прогностическим маркером.
Несколько недавних исследований показали, что CTGF регулируют рост клеток в раковых клетках пищевода и поджелудочной раковых клеток [20, 30]. Тем не менее, очень мало известно о влиянии экспрессии CTGF на рост клеток рака желудка клеток. Наши результаты показали, что подавление ФРСТ приводило к ингибированию пролиферации клеток и клоногенном роста. Изменения в росте клеток могут быть ключевыми факторами в регуляции прогрессии рака [31].

• Большее количество сайтов фосфорилирования хеликобактер пилори CagA EPIYA C повышает риск развития рака желудка,…
• номер копии ДНК профили желудка предшественника рака lesions