Downregulation sidekudoksen kasvutekijä estää niiden kasvun ja invaasion mahasyövän solujen ja vaimentaa vatsakalvon levitys

Downregulation sidekudoksen kasvutekijä estää niiden kasvun ja invaasion mahasyövän solujen ja vaimentaa vatsakalvon levittämistä
Abstract
tausta
Sidekudos kasvutekijä (CTGF) on osoitettu olevan osallisena kasvaimen kehittymisen ja etenemisen. Kuitenkin rooli CTGF mahasyövän edelleen suurelta osin tuntemattomia.
Tulokset
Tässä tutkimuksessa osoitimme, että CTGF oli hyvin ilmaistu mahasyövän kudoksissa verrattuna vastaaviin normaaleihin mahalaukun kudoksissa. CTGF ilmentyminen kasvainkudoksessa liittyi histologinen, imusolmuke etäpesäke ja vatsakalvon levittämistä (P < 0,05). Potilaat, joilla on positiivinen CTGF ilme oli huomattavasti pienempi kumulatiivinen postoperatiivinen 5 vuotta eloonjäämisaste kuin ne, joilla on negatiivinen CTGF ilme (22,9% vs. 48,1%, P < 0,001). Olemme osoittaneet, että knockdown CTGF ilmaisun merkittävästi esti solun kasvua mahalaukun syöpäsolujen ja laski sykliini D 1 ilme. Lisäksi knockdown CTGF ilmaisun myös lyhensi merkittävästi muuttoliikkeen ja invaasion mahasyövän solujen ja vähentynyt ilmentyminen matriisimetalloproteinaasi (MMP) -2 ja MMP-9. Eläinkokeet osoittivat, että nude-hiiriä, joihin injektoitiin CTGF pudotus stabiilien solulinjojen esillä pienempi määrä vatsakalvon kylvö kyhmyjä kuin kontrolli solulinjat.
Päätelmät
Nämä tiedot viittaavat siihen, että CTGF: n on tärkeä rooli solun kasvun ja invaasion ihmisen mahasyövän ja se näyttää olevan potentiaalinen prognostinen merkkiaine potilailla mahalaukun syövän.
avainsanat
Sidekudos kasvutekijä Vatsa kasvaimet Solulisääntyminen invasiivisuus Peritoneaalisille levittämistä Johdanto
huolimatta merkittävää edistystä syöpätutkimuksessa, syöpä on edelleen maailmanlaajuinen terveysongelma ja kuolleisuus johtuu syövästä edelleen suuri [1]. Mahalaukun syöpä on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat maailmassa taas näyttää olevan laskeva esiintyminen, erityisesti länsimaissa; se on edelleen yleisesti raportoitu Kiinassa ja Japanissa [2, 3]. Vaikka ennusteen potilaita, joilla on edennyt mahasyöpä näyttää parantuneen seurauksena standardointi kirurgisten tekniikoiden ja viimeaikaiset edistysaskeleet kemoterapiaa, 5 vuoden postoperatiivinen selviytymisen osuus on pieni [4, 5]. Peritoneaalisille etäpesäke on yleisin ja merkittävä kuolinsyy leikkauksen jälkeen mahasyövän [6, 7]. Kuitenkin mekanismit vatsakalvon etäpesäkkeiden ei ole selvästi määritelty.
Sidekudos kasvutekijä (CTGF), joka tunnetaan myös nimellä CCN2, on jäsen CCN perheen, mukaan lukien kysteiiniä runsaasti proteiinia 61 (Cyr61), joka tunnetaan myös CCN1, ja nefroblastooma-over ilmaisi geenin (marraskuu), joka tunnetaan myös nimellä CCN3, sekä Wisp-1 /elm1 (CCN4), Wisp-2 /rcop1 (CCN5) ja Wisp-3 (CCN6) [8, 9]. CTGF uskotaan olevan monitoiminen signalointi modulaattori mukana monenlaisia ​​biologisia tai patologisten prosessien, kuten angiogeneesin, osteogenesis, fibroosia munuaiset ja iho, ja kasvainten kehittymiseen [10-12]. Vaikka rooli CCN2 normaalissa kudosfibroosi on hyvin tutkittu [13], jonka tehtävänä CCN2 syövän ei ole yhtä hyvin ymmärrettävä. Mielenkiintoista, CCN2 on tunnistettu onkogeenin eri syöpätyyppien, mutta sitä pidetään kasvain-vaimennin-geenin muita syövän muotoja [14]. Yliekspressio CTGF löytyy eturauhassyövän [15], gliooma [16], rintasyöpä [17], ja aikuisten akuutti lymfaattinen leukemia [18]. Lisääntynyt CTGF ilme on liittynyt etenemistä kohdunkaulan kasvaimia [19], ja ruokatorven okasolusyöpä [20]. Sitä vastoin keuhkojen adenokarsinoomat [21] ja paksusuolen syövissä [22], yliekspressio CTGF estää eteneminen ja metastaasit syöpäsolujen sekä in vitro että in vivo.
Kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että yli-ilmentyminen CTGF korreloi merkitsevästi imusolmuke etäpesäke ja huonon ennusteen potilailla mahalaukun syöpä [23, 24]. Kuitenkin tarkka rooli CTGF mahasyövän on vielä tuntematon. Tässä tutkimuksessa havaitsimme CTGF ilmentymistä mahasyövässä kudoksissa. Huomasimme, että CTGF yliekspressoitui mahasyövän, ja sen ilmentyminen liittyi aggressiivisen käyttäytymisen mahasyövän. Sitten käytetään siRNA teknologiaa pudotus endogeenisen CTGF ilmentymistä mahalaukun syöpäsoluja. Olemme osoittaneet, että downregulation CTGF esti kasvun ja invaasion mahasyövän in vitro ja heikennettyjä vatsakalvon levittämistä in vivo. Tutkimuksemme vahvasti korostaa merkitystä CTGF kasvun ja invaasion mahasyövän, ja se voi antaa terapeuttisena kohteena mahasyövässä.
Materiaalit ja menetelmät
reagenssit
Dimetyylisulfoksidi (DMSO) ja trypsiini ostettiin Sigma (St. Louis, MO, USA). DMEM, streptomysiini ja muut soluviljelmä tarvikkeita olivat GIBCOBRL (Grand Island, NY, USA). Naudan sikiön seerumia oli Hyclone (Logan, UT, USA). MTT [3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-diphenyltrazolium bromidi] saatiin Fluka (Ronkonkoma, NY, USA). CTGF, sykliini D1, matriksin metalloproteinaasi (MMP) -2, MMP-3, MMP-9 ja GAPDH primaarinen vasta-aine, sekä toisen vasta-aineen rodamiini (TRITC) konjugoitua AffiniPure vuohen anti-hiiri-IgG saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). CTGF ELISA kit ostettiin R &D (Minneapolis, MN, USA). Trizol ja Lipofectamine 2000 ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). SYBR @ Primescript ™ RT-PCR kit oli Takara Biotechnology, Japani.
Tissue näytteet ja immunohistokemiallisella värjäyksellä
Kasvaimen näytteitä saatiin 110 potilasta, joilla mahalaukun syövän, jotka tehtiin leikkaus laitoksella Surgical Oncology, First Affiliated Hospital of China Medical University vuosina 2003-2005. Kaikki potilaat kävivät gastrctomy, ja niiden kliiniset ja patologiset tiedot olivat saatavilla. Normaali vatsa kudokset otettiin sovitetun distaalisesta resektoitiin marginaali mahasyövän näytteitä. Kaikki kirurgiset näytteet tutkittiin kokenut patologien ja distaalisen resektoitiin marginaali oli kasvaimettomina. Tuoreet kudokset leikattiin pieniksi paloiksi, snap-jäädytettiin nestetypessä välittömästi ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes proteiinia uuttamalla. Tutkimuksen protokolla tarkasteli ja hyväksynyt eettinen komitea China Medical University.
Varten immunohistokemiallisella värjäyksellä, 4 um: histologiset leikkeet parafiini ksyleenillä ja nesteytyksestä luokiteltujen sarjojen läpi alkoholia. Sitten leikkeitä keitettiin 10 min 0,01 M sitraattipuskurissa ja endogeeninen peroksidaasi estettiin inkuboimalla 0,3% H 2 O 2 metanolissa 30 min. Epäspesifinen sitoutuminen estettiin inkuboimalla liukuu normaalia vuohen seerumia 30 min huoneen lämpötilassa. Leikkeitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa 1:50 CTGF: n primaarisen vasta-aineen. Leikkeet altistettiin biotiini-leimattua sekundaarista vasta-ainetta 1 tunnin ajan, ja streptavidiini-peroksidaasia reaktiojärjestelmään, ja kehitettiin sitten DAB- H 2 O 2. Värjäytyminen pisteytettiin asteikolla: 0, ei värjäystä; 1+, minimaalinen värjäys; 2+, kohtuullisesta voimakkaaseen värjäytymistä vähintään 20%: ssa soluista; 3+, voimakas värjäytyminen vähintään 50%: ssa soluista. Tapaukset 0 tai 1+ värjäys luokiteltiin negatiiviseksi, ja tapaukset, joissa 2+ tai 3+ värjäys luokiteltiin positiivisiksi.
Cell Culture
Ihmisen mahalaukun syövän solulinjat, MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 ja MGC803 saatiin Department of Cell Biology, Kiina Medical University, Kiina. Ne viljeltiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO 2. Solut irrotetaan käyttämällä 0,25% trypsiiniä ja 0,02 mol /l EDTA PBS: alakulttuuria.
Rakentaminen CTGF Knockdown stabiileja solulinjoja
Kaksi Sirna (siRNA) oligonukleotidit syntetisoitiin kohdistaa kaksi eri alueiden CTGF cDNA: GTGCATCCGTACTCCCAAA (PSC1) ja GCTAAATTCTGTGGAGTAT (PSC2). Ne kloonattiin siRNA ekspressiovektoriin pGCsilencer ™ U6.Neo.GFP. Epäspesifinen siRNA käytettiin negatiivisena kontrollina (PSNC). SiRNA ekspressioplasmidit transfektoitiin SGC7901 soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 solut seulottiin G418 (800 ug /ml), ja pesäkkeitä poimittiin jälkeen 3 viikkoa, määritettiin RT-QPCR ja Western blot. Transfektoitujen solujen PSC1, PSC2 tai PSNC nimettiin PSC1 soluja, PSC2 soluja tai PSNC soluissa, vastaavasti.
Real-Time Kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (RT-QPCR) B Kokonais-RNA eristettiin solupelleteistä käyttämällä Trizol-reagenssia. Kokonais-RNA (1 ug) muutettiin cDNA käyttäen RT (käänteistranskriptaasi) reaktio kit. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen Mx3000P reaaliaikainen PCR mukainen valmistajan ohjeiden ja SYBR ® Esisekoite ExTaq kuin DNA-spesifisten fluoresoivaa väriainetta. PCR suoritettiin 40 sykliä 95 ° C: ssa 5 s ja 60 ° C: ssa 40 s. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa 1. kynnysarvon (Ct) saatiin ja suhteelliset määrät määritettiin kullekin näytteelle normalisoitu GAPDH. Expressions mRNA laskettiin ΔΔCt menetelmää [25] .table 1 PCR Primer Jaksot
Gene
alukesekvensseissä (5'-3 ') eteen- ja taaksepäin

Product (bp)

CTGF
CTTGCGAAGCTGACCTGGAA
AAAGCTCAAACTTGATAGGCTTGGA
90
MMP-2
ATGACATCAAGGGCATTCAGGAG
TCTGAGCGATGCCATCAAATACA
135
MMP-3
GGGTGAGGACACCAGCATGA
CAGAGTGTCGGAGTCCAGCTTC
178
MMP-9
TCCCAGACCTGGGCAGATTC
GCAAAGGCGTCGTCAATCAC
124
Cyclin D1
GATGCCAACCTCCTCAACGAC
CTCCTCGCACTTCTGTTCCTC
171
GAPDH
GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
TGGTGAAGACGCCAGTGGA
138
Western blot-analyysi
Kudokset tai solut hajotettiin RIPA-puskuri, johon on lisätty proteaasi-inhibiittorin seosta 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Solulysaatit sonikoitiin sitten lyhyesti ja sentrifugoitiin (14000 g, 4 ° C) 15 minuutin ajan liukenemattoman materiaalin poistamiseksi. Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa, ja sitten inkuboitiin ensimmäisen vasta-aineen, jota seurasi piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta. Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin ECL chemiluminescence menetelmällä.
Immunofluoresenssi ja konfokaali kuvantamisen
solujen Lab-Tek kudosviljelmässä kammion Leikkeitä kiinnitettiin kylmässä 100% metanolia 10 minuutin ajan, ja sitten estettiin normaalia vuohen seerumia 30 min . Soluja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen yön yli 4 ° C: ssa, pestiin 3 kertaa PBT (PBS, 1 ‰ Triton X-100), ja sitten inkuboitiin toisen vasta-aineen konjugoitu rodamiini. DNA väriaine DAPI käytettiin värjää DNA. Solut kuvattiin Leica SP2AOBS -konfokaalimikroskoopilla.
Vakioitu alusta (CM) kerääminen ja Enzyme-linked immunoassay (ELISA) B 3 x 10 5-solut ympättiin 100 mm: n kudosviljelymaljaa DMEM, joka sisälsi 10 % naudan sikiön seerumia, 2 päivää. Sitten solut pestiin kahdesti PBS: llä ja inkuboitiin 5 ml: ssa seerumitonta DMEM: ää. 48 h myöhemmin, väliaine kerättiin ja sentrifugoitiin 2000 g: ssä 5 min, johdetaan suodattimien läpi (huokoskoko 0,45 um) ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti.
Tasot CTGF ilmastoituna median mahasyöpä solulinjoja mitattiin käyttämällä ihmisen Quantikine ELISA-pakkausta seuraten valmistajan ohjeita.
MTT runsaudenmäärityksessä
kyky soluproliferaatiota arvioitiin käyttäen MTT [3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2 , 5-diphenyltrazolium bromidi] määrityksessä. Noin 5 x 10 3-solut ympättiin 96-kuoppaisille viljelylevyille ja viljeltiin seerumivapaassa DMEM: ssa 24, 48, 72, ja 96 h, vastaavasti. Sitten soluja inkuboitiin 20 ui MTT: tä (10 mg /ml) 4 tunnin ajan 37 ° Cand 200 ui DMSO: ta pipetoitiin liuottamaan formatsaani 20 min huoneen lämpötilassa. Optinen tiheys (OD) määritettiin käyttämällä spektrofotometriä (Bio-Rad), aallonpituudella 570 nm.
Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä
5 x 10 2-solujen suspendoitiin 2 ml: aan 0,3%: isessa DMEM- joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia maljattiin 6-kuoppaisille levyille päälle nykyisten 0,6% pohja agaroosista samaa alustaa. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO 2-inkubaattorissa. Kolmen viikon kuluttua solupesäkkeet > 0,1 mm halkaisijaltaan laskettiin alle mikroskooppinen kenttä.
Cell invaasiomääritys
invaasio määritettiin hyökkäystä kammio määritystä. -Soluja (2 x 10 4) ympättiin ylä- kammion 24-kuoppaisen matrigeeliä päällystetty mikrohuokoinen kalvo suodattimen 8 um huokosia ja alaosaan täytettiin 0,5 ml: lla DMEM: ää, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia kemoatrak-. Kun oli inkuboitu 24 tuntia, ei-tunkeutuvat soluihin (ylempi kamari) hellävaraisesti poistaa käyttämällä pumpulipuikolla moppi ja tunkeutuvat soluihin (alempi kammio) kiinteään käyttäen metanolia ja värjättiin trypaanisinisellä. Invasiivisen kyky määritettiin useissa läpäisemään soluja mikroskoopilla 200-kertainen suurennus 10 satunnainen kenttiä kussakin kaivossa.
Jaosto migraatiokokeessa
menetelmä in vitro migraatiokokeessa käytti kuin Matrigel-pinnoitettu 24 kuopan Boyden kammio (8 um, Millipore). -Soluja (2 x 10 4) ympättiin inserttejä suspendoitiin 0,2 ml: aan seerumitonta DMEM-alustassa. Ei-siirtyvät solut poistettiin yläkammion suodattimen jälkeen, kun oli inkuboitu 24 tuntia. Siirtyneet solut värjättiin ja niiden määrä perustuu menettelyyn, kuten aiemmin on kuvattu. Kolmena kappaleena määritykset suoritettiin kunkin ryhmän solujen invaasion ja muuttoliike määrityksissä ja tulokset ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD.
Gelatiinitsymografialla
MMP-2 ja MMP-9-aktiivisuus määritettiin gelatiinitsymografialla kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],26]. Lyhyesti, sentrifugoinnin jälkeen supernatantti erotettiin ja proteiinipitoisuus määritettiin; yhtä suuret määrät proteiinia, lisätty näytepuskuria (Tris-HCI 1 M, pH 6,8, natriumdodekyylisulfaatti (SDS) 2%, glyseroli 10%) laitettiin 7,5% SDS-polyakryyliamidigeelillä, joka sisälsi 1 mg /ml gelatiinia. Elektroforeesin jälkeen SDS poistettiin geelistä pesemällä kahdesti 2,5% Triton X-100: ssa 1 tunti. Kun lyhyt huuhtelu, geeliä inkuboitiin 37 ° C: ssa 18 h, pH 7,6, joka sisälsi 100 mM Tris-HCI: ää, 10 mM CaCl 2, 20 mM NaCl. Geeli värjättiin with1% Coomassie Brilliant Blue R250: ssa 2 tuntia ja sitten käsiteltiin värinpoistoliuos (40% metanolia, 10% etikkahappoa, 50% tislattua vettä). Proteolyyttisen aktiivisuuden havaittiin yhtä selkeä bändejä taustaa vasten tahra pilkkoutumattomiin alustan geelin.
Eläinten tutkimus vatsakalvon istutuksen
koe suoritettiin noudattaen Annettu valtion Food and Drug Administration (SFDA Kiinan ). Eläimiä pidettiin ja hoidetaan mukaisesti vahvistamien suuntaviivojen National Science neuvoston tasavallan Kiinassa.
BALB /c-nude-hiiriin, 35-40 päivää vanhoja ja painavat 20-22 g, toimitti Shanghai SLAC Laboratory animal Limited Company. Hiiret pidettiin steriileissä olosuhteissa ja ruokitaan steriloitu hiiri ruokavalion ja vettä. Eläimet nukutettiin kautta hengittämällä isoflurance. PSC1, PSC2, PSNC ja SGC7901 soluja (1 x 10 7 solua) suspendoitiin 0,5 ml: aan DMEM: ää, ja ympättiin vatsaonteloon testi hiirillä. Hiiret lopetettiin kuusi viikkoa myöhemmin, ja kaikki levitetään kyhmyt läsnä suoliliepeen ja pallean arvioitiin.
Tilastollinen analyysi
Kaikki arvot tekstissä ja luvut esitetään keskiarvona ± SD. Kaiken eloonjäämisluvut määritettiin käyttäen Kaplan-Meier estimaattori, tapahtuman ollessa määritetty kuoleman syövän korreloivat syy. Log-rank-testi käytettiin tunnistamaan eroja eloonjäämiskäyrien eri potilasryhmiä. Vuonna univariate analyysi, 2-tailed χ 2 testit kategorinen muuttujien ja 2-tailed t-testiä jatkuvien muuttujien käytettiin tilastollisessa vertailussa. Arvot p
< 0,05 vietiin osoittanut merkittävää eroa keinoin.
Tulokset
CTGF yliekspressoituu syöpien ja korreloivat kliinis-mahasyövän potilaiden
Selvitimme CTGF ilmentymistä mahasyövässä kudoksissa ja sovitettu distaalisesti normaaleissa kudoksissa . Kuva 1A esitetty CTGF ilmaisun viidellä sattumanvaraisesti potilasta. Kohonneita CTGF-proteiinin havaittiin ihmisen mahasyövän kudoksiin verrattuna pariksi normaaleissa kudoksissa potilailta. Tämä vahvisti myös immunohistokemiallisella värjäyksellä (kuvio 1 B). Lisäksi jotta tutkimiseksi edelleen korrelaation ilmaisun CTGF ja kliinis-, 110 näytettä käytettiin tutkimusta immunohistokemiallisella värjäyksellä. Tilastollinen analyysi paljasti positiivisen CTGF ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä histologinen, imusolmuke etäpesäke ja vatsakalvon levittämiseen verrattuna potilailla, joilla on negatiivinen CTGF ilme (taulukko 2). Positiivinen CTGF ilmentyminen useammin havaittiin tapauksissa imusolmukkeiden etäpesäkkeiden (P = 0,012). Tasot CTGF ilmaisun nosti merkittävästi eriytymättömissä mahasyövistä verrattuna eriytetty syöpien (P = 0,039). Ja ilmaisu CTGF-proteiinin korreloi merkitsevästi kehittämiseen vatsakalvon levittäminen mahasyövän (P = 0,011). Laskeminen selviytymisen kesto 110 mukana potilaita Kaplan-Meier menetelmä paljasti, että potilaat, jotka esillä CTGF-positiivisia kasvaimia osoitti lyhyempää selviytymisen verrattuna ne potilaat, jotka kärsivät CTGF-syöpäkasvain (kuvio 1 C, P < 0,001 ). Kuva 1 yliekspressio CTGF mahasyövän kanssa huonompi ennuste. A. Western blot-analyysi osoitti CTGF ilmentymistä mahasyövässä kudoksissa ja sovitettu distaalisesti normaaleissa kudoksissa viidestä satunnaisesti valitusta mahasyöpäpotilaista. B. immunohistokemia tulokset CTGF ilmentymisen pariksi mahasyövässä kudosnäytteitä. C. Kaplen-Meir eloonjäämiskäyriä 110 potilailla, joilla on mahalaukun syövän, ryhmitelty CTGF ilmaisua.
Taulukko 2 välisestä assosiaatiosta CTGF ilmaisun ja ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia potilaalla on mahasyöpä (n = 110) B
CTGF ilmaisu


Negative
Positiivinen
P-arvo

Sukupuoli
Mies
33
34
0,779
Nainen
20
23
Ikä (vuotta) B ≤ 65
35
40
0,642
> 65
18
17
Tuumorin koko (cm) B < 5
26
25
0,585
≥ 5
27
32
Kasvain sijainti
Ala
42
37
0,413
Lähi
5
8
Upper
3
6
Koko
3
6
histologinen
Differentiated
26
17
0,039 *
eriyttämätön
27
40
Lauren grade
Suoliston
28
21
0,108
Diffuusi
25
36
Imuneste etäpesäke
Negative
23
12
0,012 *
Positiivinen
30
45
TNM
I
11
8
0,080
II
15
9
III
20
22
IV
7
18
Maksan etäpesäkkeiden
negatiivinen
50
55
0,588
Positive
3
2
Peritoneaalisille levittäminen
negatiivinen
50
44
0,011 *
positiivinen
3
13
* P < 0,05; CTGF, sidekudoksen kasvutekijä.
Ilmentäminen CTGF ihmisen mahasyövän solulinjoissa ja siRNA-välitteinen hiljaisuus
Ensin tarkastelimme CTGF ilmaisun kuudessa mahasyövässä solulinjoissa (MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 ja MGC803) Western blot. CTGF havaittiin kaikissa solulinjoissa, arvioidaan, ja SGC7901 soluissa, jotka ilmentävät korkeimmalla tasolla (kuvio 2A). Näin ollen, SGC7901 solut valittiin mallin myöhempää toimintahäiriöt. Koska biologisesti aktiivinen CTGF on sekä secreted ja ilmaisi solulimassa [8, 27], myös mitattuna tason erittyvän CTGF ilmastoituna median näiden mahasyövän solulinjoissa ELISA, joka oli samaan aikaan taso CTGF sytoplasmassa kunkin solulinjan (kuvio 2B). Kuva 2 ilmentäminen CTGF mahasyövän solulinjoissa ja knockdown CTGF siRNA. A. Western blot, joka osoittaa ekspression CTGF 6 mahasyövässä solulinjoissa. GAPDH toimi Proteiinilisäyksen ohjaus. B. CTGF in elatusaineen 6 mahasyövän solulinjojen ja vakaa transfektoiduissa soluissa analysoitiin ELISA. Tulokset ilmaistaan ​​pg /ml /1 x 106 solua (keskiarvo ± SD, n = 4). C. Western blot-analyysi CTGF-proteiinin ilmentymisen SGC7901, PSNC ja CTGF knockdown vakaa solulinjojen (PSC1 ja PSC2). D. Immunofluoresenssianalyysi CTGF ilmaisua. E. RT-QPCR osoittaa CTGF mRNA tasot SGC7901, PSNC ja CTGF knockdown vakaa solulinjojen (PSC1 ja PSC2). Data on ilmaistu kertainen muutos suhteessa kontrolliin (kontrolli on SGC7901). Arvot ilmoitetaan keskiarvona ± SD kolmesta kokeesta. * P < 0,05 kontrolliin verrattuna.
Tutkimiseksi toimintaa CTGF on SGC7901 soluissa, CTGF pudotus stabiileja solulinjoja käytettiin analysoimaan äänenvaimennusvaikutus. Kuten on esitetty kuviossa 2B, taso erittyy CTGF on käytetty elatusaine oli merkittävästi vähentynyt siRNA-vakaa transfektoiduissa soluissa verrattuna kontrolliin. Western blot ja immunofluoresenssivärjäyksen osoittivat, että ilmentyminen CTGF-proteiinin sytoplasmassa väheni merkittävästi CTGF pudotus vakaa solulinjojen (kuvio 2C, D). Lisäksi ilmaisu CTGF mRNA oli myös merkitsevästi vähentynyt CTGF pudotus stabiilien solulinjojen (kuvio 2E).
Pudotus CTGF: n ilmentymisen estää niiden kasvun mahasyövän solujen
pesäkkeiden muodostumisen määritystä käytettiin arvioimaan kasvun solujen, joissa CTGF hiljennettiin. Kuten kuviossa 3A on esitetty, CTGF pudotus vakaa soluja (PSC1 ja PSC2), joka muodostuu merkittävästi vähemmän pesäkkeitä pehmeässä agarissa verrattuna SGC7901 ja PSNC soluja (83 ± 10, 90 ± 15 versus 30 ± 7 ja 20 ± 5, vastaavasti). Edelleen testata negatiivinen vaikutus CTGF Knockdown mahalaukun syöpäsolujen kasvua, MTT-määritys suoritettiin ja kasvun dikäyrät (kuvio 3B). Kuten on esitetty käyrät, sekä PSC1 ja PSC2 solut lisääntyivät hitaammin PSNC solut ja SGC7901 solujen ensimmäisen 96 tunnin jälkeen solut maljattiin. Jyrkän vähenemisen pesäkkeiden muodostumisen ja kasvun CTGF vaiennettu solujen ehdotti CTGF tukahduttaminen voi säädellä negatiivisesti mahalaukun syöpäsolujen kasvua. RT-QPCR osoitti, että mRNA-tasot solukierron related protein sykliini D1 oli alaspäin säännelty kaksi CTGF pudotus stabiileja solulinjoja verrattuna PSNC ja SGC7901 (kuvio 3C). Tämän mukaisesti tuloksena havaitsimme vähentynyt selvästi sykliini D1-proteiinin ilmentymistä CTGF Knockdown soluissa PSC1 ja PSC2 (kuvio 3D). Mielenkiintoista on, että hoito kasvualusta on SGC7901, joka erittää suuria määriä CTGF kykeni pelastamaan sykliini D1 downregulation ja palauttaa solujen proliferaatiota CTGF pudotus stabiili soluissa. Nämä tulokset osoittivat, että CTGF tukahduttaminen voi säädellä negatiivisesti mahasyövässä solujen kasvua ja pienentää sykliini D1 ilme. Kuvio 3 Knockdown CTGF ilmaisun estää niiden kasvun mahalaukun syöpäsoluja. A. Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä. B. MTT lisääntymisen määritys. C. Knockdown CTGF säädeltiin mRNA tasoa sykliini D1. D. Knockdown CTGF säädeltiin proteiinin taso sykliini D1. PSC1 /PSC2 + CM SGC7901: PSC1 tai PSC2 soluja inkuboitiin kunnostetun alustan (CM) ja SGC7901. Kaikki tulokset olivat toistettavissa kolmessa riippumattomassa kokeessa. * P < 0,05 kontrolliin verrattuna (kontrolli on SGC7901).
Knockdovvn CTGF ilmaisun estää migraation ja invaasion mahalaukun syöpäsolujen
Cell muuttoliikettä ja invaasiota ovat kriittisiä prosesseja tuumorimetastaasissa. Olemme tutkineet solumigraation ei-Matrigel pinnoitettu Boyden kammion ja solujen invaasio Matrigel kuorrutettu invaasio kammio määrityksissä, vastaavasti. Maahanmuuttoprosessissa määrityksissä (kuvio 4A), siirtymänopeuksien on PSC1 ja PSC2 solut merkittävästi vähentynyt verrattuna kontrolliin (P < 0,05). Kuten on esitetty kuviossa 4B, CTGF pudotus myös merkittävästi vähentää solujen invaasiota ominaisuudet verrattuna kontrolliin. Soluinvaasiota hinnat PSC1 ja PSC2 solut laski 61,4% ja 55,8%, tässä järjestyksessä. RT-QPCR ja Western blot osoitti, että MMP-2 ja MMP-9 oli säädeltiin kahdessa stabiilien kloonien verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 4C, D). Sen sijaan, MMP-3 ei muuttanut merkittävästi sekä mRNA: ta ja proteiinia tasolla. Lisäksi tsymografialla analyysi osoitti toimintaa sekä MMP-2 ja MMP-9: n siRNA-vakaa transfektoidut solut olivat merkittävästi alhaisemmat kuin kontrollisoluissa (kuvio 4E). Mielenkiintoista, hoito kasvualusta on SGC7901 joka erittyy suuria määriä CTGF aiheuttama uudelleen MMP-2 ja MMP-9 ja palautti migraation ja invaasion CTGF knockdown vakaa soluja. Nämä tulokset viittaavat siihen, knockdown CTGF ilmaisun vähensi muuttoliikettä ja invaasion mahasyövän solujen ja vähensi MMP-2 ja MMP-9. Kuva 4 Knockdown CTGF ilmaisun estää migraation ja invaasion mahalaukun syöpäsoluja. A. Cell migraatiokokeessa. B. Solujen invaasiomääritys. Muuttoliike ja hyökkäys solut kiinnitettiin ja värjättiin, ja edustava kentät valokuvattiin. Kvantifiointiin, solut laskettiin 10 satunnaisessa aloilla valomikroskoopilla (x 200). Kolmena kappaleena määritykset suoritettiin kullekin ryhmälle solujen invaasion ja muuttoliike määrityksiä, ja tulokset ilmoitetaan keskiarvoina ± SD. C. RT-QPCR tehtiin analyysi mRNA MMP-2, MMP-3 ja MMP-9: n CTGF: n pudotus stabiilien solulinjojen ja kontrollisoluja. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta kokeesta. D. Proteiini MMP-2, MMP-3 ja MMP-9 havaittiin Western blot. GAPDH toimi Proteiinilisäyksen ohjaus. E. gelatiinitsymografialla analyysi toiminnan MMP-2 ja MMP-9. PSC1 /PSC2 + CM SGC7901: PSC1 tai PSC2 soluja inkuboitiin kunnostetun alustan (CM) ja SGC7901. * P < 0,05 kontrolliin verrattuna (kontrolli on SGC7901).
Alassäätely CTGF estää vatsakalvon levittämistä mahasyövän in vivo
Tutkitaan vaikutuksia CTGF on vatsakalvon levittämistä mahasyövän solujen in vivo, meidän ympättiin eri solujen nude-hiirissä. SGC7901 soluja, ohjaus vakaa solulinja (PSNC), ja CTGF knockdown vakaa soluja (PSC1 ja PSC2) injektoitiin neljään erilliseen ryhmään nude-hiirten. Koska seurauksena tällaista hoitoa, mitattavissa tukahduttaminen vatsakalvon levittämisen hiirillä ruiskutetaan CTGF pudotus vakaa soluissa verrattuna ruiskutetaan SGC7901 soluja tai PSNC solut merkittiin (kuvio 5A). Määrällisesti 117 ± 20 levitetään kyhmyt huomattiin koehiirien ympätty SGC7901 solujen ja 137 ± 26 levitetään kyhmyt havaittiin hiiriä ympätty PSNC soluihin. Sen sijaan merkittävä vähemmän levitetään kyhmyt pystyivät noudatettava hiiriä injektoitiin CTGF pudotus vakaa soluja (kuvio 5B). Kuva 5 Knockdown CTGF estää mahasyövän SGC7901 ksenografti- vatsakalvon levittämiseen. SGC7901, PSNC ja CTGF knockdown vakaa solulinjojen (PSC1 ja PSC2) ruiskutettiin intraperitoneaalisesti kuten kohdassa "Materiaalit ja menetelmät". 6 viikkoa myöhemmin hiiret tapettiin, valokuvattiin, leikattiin ja kaikki levitetään kyhmyt läsnä suoliliepeen ja pallean laskettiin. A. valokuva nude-hiirten vatsakalvon levittäminen kustakin ryhmästä. B. levitetään kyhmyt arvioitiin. Kukin pylväs edustaa keskiarvoa ± SD (n = 5 kussakin ryhmässä). * P < 0,05 kontrolliin verrattuna (kontrolli on SGC7901).
Keskustelu
Laajin kirjallisuutta tasalla koskevat CTGF määrittelee sen roolista haavan paranemista ja fibroositaudin. Viime aikoina useat tutkimukset sekaantumaan CTGF kasvaimen kehitystä ja kasvainsolun eloonjäämistä [28-30]. Kuitenkin tarkka rooli CTGF kasvaimen etenemistä ei ole varmaa, ja toiminta CTGF tuumorisolun biologiassa mahasyövän ei ole tutkittu perusteellisesti. Näiden ongelmien ratkaisemiseksi, arvioimme CTGF ilmaisun osalta mahdollista suoraa korrelaatiota solujen kasvua ja invaasiota mahalaukun syöpäsoluja. Lisäksi olemme edelleen tutkineet vaikutuksia CTGF peritoneaalidialyysia levittämisestä mahasyövän solujen in vivo.
Tässä tutkimuksessa tuloksemme osoittivat, että CTGF oli hyvin ilmaistu mahasyövän kudoksissa verrattuna vastaaviin normaaleihin mahalaukun kudoksissa. Ilmaisu CTGF eriytymättömissä mahasyövässä oli merkittävästi suurempi kuin eriytetty mahasyövässä. CTGF ilmentyminen kasvainkudoksessa liittyi imusolmuke etäpesäke ja vatsakalvon levittämiseen. Lisäksi potilailla, joilla on positiivinen CTGF ilme oli huomattavasti pienempi kumulatiivinen postoperatiivinen 5 vuotta eloonjäämisaste (22,9%) kuin ne, joilla on negatiivinen CTGF ilme (48,1%, kuvio 1C). Nämä tulokset viittaavat siihen, CTGF saattaa olla mukana etenemistä ja etäpesäkkeiden mahasyövän. Lisäksi CTGF saattaisi olla hyödyllinen prognostinen markkeri.
Useat viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että CTGF: n säätelevät solujen kasvua ruokatorven syövän solujen ja haimasyövän soluja [20, 30]. Kuitenkin tiedetään vähän vaikutusta CTGF ilmentymisen solun kasvuun mahalaukun syöpäsoluja. Tuloksemme osoittivat, että CTGF aleneminen aiheutti soluproliferaation inhibointi ja klonogeeniset kasvua. Muutokset solujen kasvua saattaa olla avaintekijöitä säätelyssä syövän etenemisessä [31].

• Suurempi määrä Helicobacter pylori CagA EPIYA C fosforylaatiokohdat lisää mahalaukun syövän riski, mutta ei pohjukaissuolen ulcer
• DNA kopioluku profiileja mahasyövän esiasteleesioita