Downregulation vezivnega rastnega faktorja tkivo zavira rast in invazijo želodčnih rakavih celic in zmanjša peritonealno razširjanje

Downregulation vezivnega rastnega faktorja tkivo zavira rast in invazijo želodčnih rakavih celic in zmanjša peritonealno razširjanje
Abstract
ozadju
rastnega faktorja veznega tkiva (CTGF) Dokazano je, da se vpleteni v razvoj in napredovanje tumorjev. Vendar pa je vloga CTGF z rakom želodca v veliki meri ostaja neznana.
Rezultati
V tej študiji smo pokazali, da je bila CTGF zelo izražena v želodčnih tkivih raka v primerjavi z ujemanjem običajnimi želodčnih tkiva. Izraz CTGF v tumorskem tkivu je bila povezana s histološko razred, bezgavkah metastaze in peritonealno razširjanje (P < 0,05). Bolniki s pozitivnim izražanja CTGF imela bistveno manjše kumulativni pooperativno 5 letno stopnjo preživetja kot tisti z negativnim CTGF izražanja (22,9% proti 48,1%, P < 0,001). Dokazali smo, da je rasklapanje za CTGF izražanja rasti bistveno blokiranem celic želodca rakavih celic in zmanjšala ciklin D 1 izraz. Poleg tega je rasklapanje od CTGF izražanja tudi občutno zmanjšali migracije in vdor želodčnih rakavih celic in zmanjšano izražanje matriks metaloproteinaze (MMP) -2 in MMP-9. Študije na živalih so pokazale, da golih miši vbrizga z CTGF rasklapanje stabilne celične linije pokaže manjše število peritonealno pečk gomoljev kot v celičnih linijah nadzora.
Sklepi
Ti podatki kažejo, da ima CTGF pomembno vlogo pri rasti celic in invazije v rak človeška želodca in se zdi, da je potencialni prognostični marker za bolnike z rakom želodca.
Ključne besede
rastnega faktorja veznega tkiva želodcem novotvorbe Cell širjenje invazivnost peritonealni razširjanje Uvod
Kljub pomembnega napredka na področju raziskav raka, raka ostaja svetovni zdravstveni problem in umrljivost zaradi raka še vedno visoka [1]. želodčni rak je drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka na svetu, medtem ko se zdi, da je trend v primeru, predvsem v zahodnih državah; je še vedno pogosto poročali iz Kitajske in Japonske [2, 3]. Čeprav se zdi, da prognoza bolnikov z napredovalim rakom želodca, da se je izboljšala zaradi standardizacije kirurških tehnik in nedavni napredek v kemoterapiji, 5-letno postoperativni preživetje ostaja nizka [4, 5]. Peritonealno metastaze je najbolj pogosta in pomemben vzrok umrljivosti po operaciji za rakom želodca [6, 7]. Vendar pa mehanizmi peritonealne metastaze niso jasno definirani.
Rastnega faktorja veznega tkiva (CTGF), znan tudi kot CCN2 je član družine CCN, vključno cisteinskega bogat proteina 61 (Cyr61), znan tudi kot CCN1 in nefroblastom-over izraženega gena (november), znan tudi kot CCN3, kot tudi šop-1 /elm1 (CCN4), WISP-2 /rcop1 (CCN5) in WISP-3 (CCN6) [8, 9]. CTGF se domneva, da je večnamenski signalizacijo modulator vključeni v različnih bioloških ali patoloških procesov, kot angiogenezo, osteogeneze, fibroze ledvic in kože, in razvoj tumorjev [10-12]. Čeprav je bila vloga CCN2 v normalnem tkiva fibroze dobro raziskana [13], funkcija CCN2 pri raku ni tako dobro razumel,. Zanimivo je, da CCN2 je bilo ugotovljeno, da onkogen pri različnih vrstah raka, vendar se šteje za tumor, dušenje gena v drugih oblikah raka [14]. Čezmerno CTGF najdemo pri raku prostate [15], gliomi [16], rak dojke [17], in odraslih akutno limfoblastno levkemijo [18]. Povečano izražanje CTGF je bila povezana z napredovanjem materničnega vratu tumorjev [19], in požiralnika ploščatocelični karcinom [20]. Nasprotno, v pljučih adenokarcinomov [21] in debelega črevesa raka [22], čezmernim CTGF zavira invazijo in metastaze rakavih celic tako in vitro kot in vivo.
Klinične študije so pokazale, da čezmerno CTGF je pomembno povezana z bezgavke metastaze in slabo prognozo pri bolnikih z rakom želodca [23, 24]. Vendar pa je natančno vlogo CTGF pri raku želodca še ni znan. V tej študiji smo odkrili CTGF izraz v želodcu tkivih raka. Ugotovili smo, da je CTGF prekomerno raka želodca, in njegova ekspresija je bila povezana z agresivnim obnašanjem raka želodca. Nato smo uporabili siRNA tehnologijo rasklapanje endogenega CTGF izraz v želodcu rakavih celic. Pokazali smo, da downregulation od CTGF zaviral rast in invazijo raka želodca in vitro in oslabljen peritonealno razširjanje in vivo. Naša raziskava močno poudarja pomen CTGF pri rasti in invazije na raka želodca, in lahko zagotovi terapevtski cilj pri raku želodca.
Materiali in metode
so reagenti
Dimetilsulfoksid (DMSO) in tripsin, kupljene od Sigma (St. Louis, MO, ZDA). DMEM, streptomicin in druge potrebščine na celičnih kulturah je bilo iz GIBCOBRL (Grand Island, NY, ZDA). Fetalni goveji serum je Hycolne (Logan, UT, ZDA). MTT [3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-diphenyltrazolium bromid] smo dobili iz Fluka (Ronkonkoma, NY, ZDA). CTGF, ciklin D1, matriksne metaloproteinaze (MMP) -2, MMP-3, MMP-9 in GAPDH primarno protitelo, kot tudi drugo protitelo rodamin (TRITC) označenih s affinipure kozjega proti-miš IgG so bili pridobljeni iz Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, ZDA). CTGF ELISA kit je bila kupljena iz R & D (Minneapolis, MN, ZDA). Trizol in Lipofectamine 2000 smo nabavili pri Invitrogen (Carlsbad, CA, ZDA). Komplet SYBR @ Primescript ™ RT-PCR je bil iz Takara biotehnologijo, Japonska.
vzorci tkiva in Imunohistokemijsko
tumor vzorcev smo pridobili od 110 bolnikov z rakom želodca, ki so bili operirani na oddelku za kirurške onkologije, First povezan Hospital China Medical University v obdobju 2003-2005. Vsi bolniki doživel gastrctomy, in so na voljo njihove klinične in patološke podatkov. Normalno želodec tkiva so bili odvzeti iz izravnane distalni odstranjenimi robu vzorcev z rakom želodca. Vse kirurški osebki so bile pregledane izkušeni patologov in distalni resekcija marža je tumor brez. Sveže tkiva smo razrezali na majhne koščke, snap-zamrznemo v tekočem dušiku takoj in shranimo pri -80 ° C, dokler ekstrakcijo proteinov. Protokol študije je bil pregledan in Odbor za etiko Kitajske Medical University odobril.
Za imunohistokemičnim barvanjem, 4 pm histološke sekcije so deparaffinized z ksilena in hidracijo skozi stopenjski seriji alkohola. Oddelki so bili nato kuhamo 10 minut v 0,01 M citratnega pufra in endogene peroksidaze je blokirana z inkubacijo pri 0,3% H 2 O 2 v metanolu za 30 minut. Nespecifično vezavo smo blokirali z inkubacijo stekelca z običajnim kozjim serumu 30 minut pri sobni temperaturi. Odseki inkubiramo preko noči pri 4 ° C z 1:50 redčenjem CTGF primarnega protitelesa. Oddelki bili izpostavljeni-biotina označeni sekundarnih protiteles 1 h, s streptavidinom-peroksidazo reakcijskega sistema, ter nato razvila DAB- H 2 O 2. Obarvanje je dosegel na naslednji lestvici: 0, brez kamna; 1+, minimalno barvanje; 2+, zmerno do močno obarvanje v vsaj 20% celic; 3+, močno obarvanje v vsaj 50% celic. Primeri z 0 ali 1+ barvanjem so razvrščene kot negativna, in primeri z 2+ ali 3+ barvanjem so razvrščene kot pozitivne.
Celični kulturi
človeške želodčne raka celičnih linij, MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 in MGC803 smo pridobili iz oddelka za biologijo celice, China Medical University, Kitajska. So bili kultivirali v DMEM, ki vsebuje 10% fetalni goveji serum, 100 U /ml penicilina, 100 ug /ml streptomicina pri 37 ° C v navlaženi atmosferi 5% CO 2. Celice so se odstranijo s pomočjo 0.25% tripsin in 0,02 mol /L EDTA v PBS za subkulturo.
Gradnja CTGF rasklapanje so stabilne celične linije
Dva majhna moteče RNA (siRNA) oligonukleotidi sintetizirali ciljnih dveh različnih regij v CTGF cDNA: GTGCATCCGTACTCCCAAA (PSC 1) in GCTAAATTCTGTGGAGTAT (PSC2). So bili kloniran v ekspresijski vektor siRNA pGCsilencer ™ U6.Neo.GFP. Nespecifično siRNA je bila uporabljena kot negativna kontrola (PSNC). Izraz plazmide je siRNA smo transfektirali v SGC7901 celice uporabljajo Lipofectamine 2000. Celice smo presejali z G418 (800 ug /ml) in so kolonije smo pobrali po 3 tedne, z RT-qPCR in Western blot določeni. Transfektiranih s PSC 1, PSC2 ali PSNC bili imenovani PSC 1 celice, PSC2 celice ali PSNC celic oz.
Real-Time Kvantitativna verižno reakcijo s polimerazo (RT-qPCR)
Total RNA smo izolirali iz celične pelete uporabljajo TRIzola reagenta. Skupno RNA (1 ug) smo pretvorili v cDNA z uporabo RT (reverzne transkriptaze) reakcija kit. PCR v realnem času smo izvedli z uporabo Mx3000P PCR v realnem času sistem v skladu z navodili proizvajalca in SYBR ® premiks ExTaq kot DNK posebne fluorescentnim barvilom. PCR smo izvedli pri 40 ciklov 95 ° C za 5 sekund in 60 ° C za 40 sekund. Primer zaporedja so prikazani v tabeli 1. Prag cikel (Ct) je bila pridobljena in relativne količine so bile določene za vsak vzorec normalizirane na GAPDH. Izrazi mRNA smo izračunali po metodi ΔΔCt [25] .table 1 PCR Primer Zaporedja
Gene
Primer zaporedja (5'-3 ') vrtenje naprej in nazaj

izdelka (bp)

CTGF
CTTGCGAAGCTGACCTGGAA
AAAGCTCAAACTTGATAGGCTTGGA
90
MMP-2
ATGACATCAAGGGCATTCAGGAG
TCTGAGCGATGCCATCAAATACA
135
MMP-3
GGGTGAGGACACCAGCATGA
CAGAGTGTCGGAGTCCAGCTTC
178
MMP-9
TCCCAGACCTGGGCAGATTC
GCAAAGGCGTCGTCAATCAC
124
Cyclin D1
GATGCCAACCTCCTCAACGAC
CTCCTCGCACTTCTGTTCCTC
171
GAPDH
GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
TGGTGAAGACGCCAGTGGA
138
Western analizo blot
tkiv ali celic smo lizirali v RIPA pufrom dopolnjen z zmesjo zaviralca proteaz 30 minut pri 4 ° C. Celične lizate smo nato sonicirali kratko in centrifugiramo (14.000 g pri 4 ° C) za 15 minut, da odstranimo netopne snovi. Enake količine proteina smo ločili s SDS-PAGE in prenesli na PVDF membrano. Membrane smo blokirali s 5% nemastno mleko v prahu in nato inkubiramo s prvim protitelesom, ki mu sledi hrenovo peroksidazo konjugiranih sekundarnega protitelesa. Proteinski trakovi smo vizualizirali z ECL metodo kemiluminiscentnim.
Imunofluoroscenca in Konfokalni slikanje
celic na Lab-Tek komornih stekelc tkivne kulture so bile določene v hladni 100% metanola 10 minut, nato blokirali z normalnim kozji serum 30 min . Celice inkubiramo s primarnim protitelesom preko noči pri 4 ° C, speremo 3-krat v PBT (PBS z 1 ‰ Triton X-100), ter nato inkubiramo z drugim protitelesom konjugirano s Rodamina. DAPI DNA barvilo smo uporabili madež DNK. Celice so posneli na Leica SP2AOBS konfokalnim mikroskopom.
Kondicioniranega medija (CM) zbiranje in encimskim (ELISA)
3 x 10 5 celice smo zasejali v 100 mm tkivnih kultur jed z DMEM, ki vsebuje 10 % fetalni goveji serum za 2 dni. Nato smo celice dvakrat izprali s PBS in inkubiramo s 5 ml seruma prosti DMEM. 48 ur kasneje smo pogojena medij zbrali in centrifugirali pri 2000 g 5 min, spustili skozi filtre (velikost por, 0,45 um) in shranimo pri -80 ° C do uporabe.
Raven CTGF v kondicioniranem mediju iz želodčni rak celične linije so bile izmerjene z uporabo kompleta človeškega Quantikine ELISA po navodilih proizvajalca.
MTT testom proliferacije
zmožnostjo celične proliferacije bila ocenjena z uporabo MTT [3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2 , 5-diphenyltrazolium bromid] test. Približno 5 x 10 3 Celice smo zasejali v kulturi plošč 96 vdolbinicami in kultiviramo v serumu prostem DMEM 24, 48, 72 in 96 ur oz. Nato smo celice inkubirali z 20 ul MTT (10 mg /ml) 4 ure pri 37 ° cand 200 ul DMSO pipetiramo za solubilizacijo formazana 20 minut pri sobni temperaturi. Optična gostota (OD) smo določili s pomočjo spektrofotometra (Bio-Rad) pri valovni dolžini 570 nm.
Kolonija tvorba vsebnosti
5 x 10 2 celice suspendirane v 2 ml 0,3% agaroze DMEM medija ki vsebuje 10% fetalnega govejega seruma smo nanesli na 6 vdolbinami na zgornji strani obstoječih 0,6% dno agarozni pri istem mediju. Plošče smo inkubirali pri 37 ° C v 5% CO 2 inkubatorja. Po treh tednih, celičnih kolonij > 0,1 mm v premeru preštejemo pod mikroskopskem polju.
Celic invazija vsebnosti
invazije je bila določena z invazijo komorna testom izvedeni. Celice (2 x 10 4) smo zasejali v zgornji komori-Matrigel obloženih membranski filter mikropor 24 jamicami z 8 um pore in spodnjo komoro smo napolnili z 0,5 ml DMEM z 10% fetalnega govejega seruma kot chemoattractant. Po inkubaciji 24 ur, so nenamenski preplavljajo celice (zgornji dom) previdno odstranimo z uporabo vatirano palčko in preplavljajo celice (spodnji dom) so fiksne uporabo metanola in obarvane z trypan modro. Invazivnega Sposobnost bila določena s številom prodirajo celic pod mikroskopom pri 200-kratni povečavi 10 naključnih polj v vsakem dobro.
Senat migracijske testu
Metoda in vitro migracijske testu je bila ob uporabi ne-Matrigel prevleko 24-dobro Boyden komoro (8 um, Millipore). Celice (2 x 10 4) smo zasejali vložkov, suspendiranih v 0,2 ml seruma DMEM mediju. Nenamenski prehajajo celice so bile odstranjene iz zgornje komore filtra po inkubaciji 24 ur. Prehajali celice smo obarvali in kvantificirati na podlagi postopka, kot je opisano zgoraj. Trojne teste smo izvedli za vsako skupino celic v invazijo in migracijskih testih, rezultati pa so izraženi kot sredstvo ± SD.
Želatina cimografijo
MMP-2 in MMP-9 aktivnosti določimo z želatinsko cimografijo kot je opisano predhodno [ ,,,0],26]. Na kratko, potem ko je centrifugiranje supernatant ločili in določimo koncentracijo proteina; enake količine beljakovin, ki jih dodajo vzorcu pufra (Tris-HCI 1 M, pH 6,8, natrijev dodecil sulfat (SDS) 2%, glicerol 10%) so bili uporabljeni za 7,5% SDS-poliakrilamidnem gelu, ki vsebuje 1 mg /ml želatine. Po elektroforezi smo SDS odstrani iz gela z dvakratno spiranje z 2,5% TritonX-100 1 h. Po kratkem izpiranju smo gel inkubirana pri 37 ° C za 18 h v pufru, pH 7,6, ki vsebuje 100 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl 2, 20 mM NaCl. Gel smo obarvali with1% Coomassie Brilliant Blue R250 2 h in nato obdelamo z raztopino za razbarvanje (40% metanola, 10% ocetne kisline, 50% destilirana voda). Proteolytic dejavnost je bila odkrita jasna pasovih proti ozadju madeža neprebavljena substrata v gelu.
Študij na živalih za peritonealno implantacijo
je ta eksperiment izvedli v skladu s smernicami, ki jih je država Food and Drug Administration (SFDA Kitajske izdala ). Živali so bile nastanjene in skrbeli v skladu s smernicami, ki jih je National Science sveta republike Kitajske.
Moški BALB /c golih miših, starih 35-40 dni in tehta 20-22 g, so jih laboratorij Shanghai SLAC Animal Company Limited. Miši smo držali pod sterilnimi pogoji in hranili sterilizirane dieto miške in vodo. Živali smo anestezirali z vdihavanjem isoflurance. PSC 1, PSC2, PSNC in SGC7901 celice (1 x 10 7 celic) smo suspendirali v 0,5 ml DMEM in vcepimo v trebušno votlino testnih miših. Miši so žrtvovali šest tednov kasneje, in so bile ocenjene vse razširjajo grude prisotni na mezenterij in trebušno prepono.
Statistična analiza
Vse vrednosti v besedilo in podatki so prikazani kot povprečje ± SD. Splošne stopnje preživetja so bile določene z uporabo Kaplan-Meier cenilec, dogodek, definiran kot smrt zaradi raka povezana vzrok. Preskus log-rank je bila uporabljena za ugotavljanje razlike med krivuljama preživetja skupin različnih bolnikov. V univariantne analizi, 2-tailed χ 2 testa za kategorične spremenljivke in 2-tailed t test za zveznih spremenljivk so bili uporabljeni za statistične primerjave. Vrednosti p
< 0.05 so bili sprejeti, da kažejo pomembne razlike med sredstvi.
Rezultati
CTGF se prekomerno v želodcu raka in povezana z clinicopathological značilnosti raka želodca pri bolnikih
Ugotovili smo izraz CTGF v želodcu tkiva raka poveže in distalni normalnega tkiva . Slika 1A prikazano CTGF izraza v petih naključno nabranih bolnikov. Povišani nivoji CTGF proteina smo našli v človeških tkivih želodčnih raka v primerjavi z običajnimi parnih tkiv bolnika. To je bilo potrjeno tudi z imunohistokemijskim barvanjem (slika 1B). Poleg tega, da bi se še dodatno raziskati povezavo med izražanjem CTGF in clinicopathological funkcij smo uporabili 110 vzorcev za pregled s imunohistokemičnim barvanjem. Statistična analiza je pokazala pozitiven CTGF izražanje je bistveno povezan s histološko razred, bezgavkah metastaze in peritonealno razširjanje v primerjavi s tistimi bolnikih z negativno CTGF izražanja (tabela 2). Pozitivna CTGF izraz je pogosteje odkrita v primerih bezgavkah metastaze (P = 0,012). Ravni CTGF izražanja so v nediferenciranih želodčnih raka znatno povečal v primerjavi z diferenciranimi želodca raka (P = 0,039). In izraz CTGF beljakovin je pomembno povezana z razvojem peritonealne širjenje raka želodca (P = 0,011). Izračun trajanja preživetja 110 vključenih bolnikov po metodi Kaplan-Meier je pokazala, da so bolniki, ki pokaže CTGF-pozitivnih tumorjev pokazala krajši preživetje v primerjavi z bolniki, ki so utrpeli od CTGF negativnimi tumorji (slika 1C, P < 0,001 ). Slika 1 čezmernim CTGF pri raku želodca s slabšo prognozo. A. Western analiza blot dokazala izraz CTGF v želodcu tkivih rakom in izravnanih distalnih normalnih tkiv petih naključno izbranih bolnikih z rakom želodca. Rezultati B. Imunohistokemija za CTGF izražanja v parih želodca vzorcih raka tkiva. C. Kaplen-Meir krivulji preživetja za 110 bolnikov z rakom želodca, razvrščeni glede na CTGF izražanja.
Tabela 2 zveza med CTGF izražanja in clinicopathologic značilnosti bolnikov z rakom želodca (n = 110)

CTGF izražanja


Negativno
pozitivno
vrednost P

spolov
moški
33
34
0.779
ženska
20
23
Starost (leta)
≤ 65
35
40
0,642
> 65
18
17
velikost tumorja (cm)
< 5
26
25
0.585
≥ 5
27
32
Tumor lokacija
nižja
42
37
0,413
Bližnji
5
8
Zgornja
3
6
Celotna
3
6
histološke razred
diferencirana
26
17
0,039 *
nediferencirani
27
40
Lauren razred
Črevesne
28
21
0,108
razpršenih
25
36
limfnega vozla metastaze
Negative
23
12
0,012 *
pozitivno
30
45
oder TNM
sem
11
8
0.080
II
15
9
III
20
22
IV
7
18
jeter metastaze
Negativno
50
55
0.588
Pozitivni
3
2
peritonealni razširjanje
negativen
50
44
0,011 *
pozitivna
3
13
* P < 0,05; CTGF, rastnega faktorja veznega tkiva.
Izražanje CTGF v človeške želodčne raka celičnih linij in siRNA posredovano tišini
Najprej smo pregledali CTGF izraza v šestih želodčnih raka celičnih linijah (podjetja MKN-45, podjetja MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 in MGC803), ki ga zahodni blot. CTGF je bila odkrita v vseh celičnih linijah ocenjenih in z SGC7901 celice izražajo najvišje ravni (slika 2a). Zato so bili SGC7901 celice izbran kot model za nadaljnjih študij funkcije. Ker je biološko aktivna CTGF tako izloča izražena v citoplazmi [8, 27], smo izmerili tudi raven izločajo CTGF v kondicioniranem mediju iz teh želodčnih linij rakavih celic ELISA, ki je bila sovpadajo z stopnjo CTGF v citoplazmi vsake celične linije (slika 2B). Slika 2 Podajanje CTGF v želodcu raka celičnih linijah in rasklapanje za CTGF s siRNA. A. Western blot prikazuje izražanje CTGF v 6 želodčnih raka celičnih linij. GAPDH bil nadzor protein nakladanje. B. CTGF v pripravljenih medijev 6 želodčnega raka celičnih linij in stabilnih transfekciji celic smo analizirali z ELISA. Rezultati so izraženi kot pg /ml /1 x 106cells (povprečje ± SD, n = 4). C. Western analiza blot za CTGF beljakovin izražanja v SGC7901, PSNC in CTGF rasklapanje stabilne celične linije (PSC 1 in PSC2). D. Imunofluorescenca analiza CTGF izražanja. E. RT-qPCR, ki prikazuje ravni CTGF mRNK v SGC7901, PSNC in CTGF rasklapanje stabilne celične linije (PSC 1 in PSC2). Podatki so izraženi kot kratno glede sprememb za nadzor (kontrola je SGC7901). Vrednosti so podane kot povprečje ± SD treh poskusih. * P < 0,05 v primerjavi s kontrolo.
Za študij funkcijo CTGF v SGC7901 celicah je CTGF rasklapanje so bili uporabljeni stabilne celične linije analizirati učinek za dušenje zvoka. Kot je prikazano na sliki 2B, je bila stopnja izločajo CTGF v klimatiziranem mediju bistveno zmanjšal v transfektiranih celicah siRNA stabilen v primerjavi s kontrolo. Western blot in imunofluorescenco pokazali, da ekspresija CTGF proteina v citoplazmi izrazito znižala v CTGF rasklapanje stabilnih celičnih linij (slika 2C, D). Poleg tega je izraz CTGF mRNA je tudi pomembno v CTGF rasklapanje stabilne celične linije (slika 2E) so se zmanjšale.
Rasklapanje od CTGF izražanja zavira rast rakavih celic želodca
test Nastanek kolonije je bila uporabljena za oceno rasti celic, v kateri je utišanih CTGF. Kot je prikazano na sliki 3A, CTGF rasklapanje stabilni celice (PSC 1 in PSC2) oblikovana bistveno manj kolonije na mehki agar primerjavi SGC7901 in PSNC celic (83 ± 10, 90 ± 15 v primerjavi z 30 ± 7 in 20 ± 5, v tem zaporedju). Da bi še dodatno preizkusiti negativni učinek CTGF rasklapanje na rast želodčni rak celic so MTT test izvedli in krivulje rasti so bile ustvarjene (slika 3B). Kot je razvidno iz krivulje, tako PSC 1 in PSC2 celice proliferated počasneje kot PSNC celic in SGC7901 celic v prvi 96 ur po tem, ko smo nanesli celice. Dramatično zmanjšanje nastajanja kolonije in rasti CTGF utišanih celic predlagal CTGF zatiranje lahko negativno uravnavajo rast želodčni rak celic. RT-qPCR je pokazala, da so bile ravni mRNA v zvezi celični cikel beljakovine ciklin D1 navzdol urejeno v dveh CTGF rasklapanje stabilnih celičnih linij, v primerjavi z PSNC in SGC7901 (slika 3C). V skladu s tem rezultatom, smo opazili izrazito zmanjšanje izražanja ciklin D1 beljakovin v CTGF rasklapanje celic PSC 1 in PSC2 (slika 3D). Zanimivo je, da je bilo zdravljenje z pripravljenih medij SGC7901 ki izloča veliko CTGF mogli rešiti ciklin D1 downregulation in obnoviti razmnoževanje celic v CTGF rasklapanje stabilnih celic. Ti podatki kažejo, da bi lahko CTGF zatiranje negativno uravnavajo rast želodčni rak celic in zmanjša ciklin D1 izraz. Slika 3 rasklapanje od CTGF izražanja zavira rast želodčnih rakavih celic. A. Colony oblikovanje test. B. MTT proliferacije. C. rasklapanje od CTGF navzdol urejeno raven mRNA za ciklin D1. D. rasklapanje od CTGF navzdol urejeno raven beljakovin ciklin D1. PSC 1 /PSC2 + CM od SGC7901: PSC 1 ali PSC2 celice smo inkubirali z pripravljenih mediju (CM) z SGC7901. Vsi rezultati so bili ponoviti v treh neodvisnih poskusih. * P < 0,05, v primerjavi s kontrolo (nadzor je SGC7901).
Rasklapanje od CTGF izražanja zavira migracije in vdor želodčnih rakavih celic
Cell migracije in invazije so kritični postopki v tumorske metastaze. Raziskovali smo migracijo celic, ki jih brez Matrigel obložena Boyden komoro in celično invazijo-Matrigel obložene invazija komornih testih oz. V migracijskih testih (slika 4A), so bile migracijske stopnje v PSC 1 in PSC2 celice znatno zmanjšal v primerjavi s kontrolo (P < 0,05). Kot je prikazano na sliki 4B, CTGF rasklapanje tudi občutno zmanjša invazijo lastnosti celic v primerjavi s kontrolo. Cell invasion stopnje PSC 1 in PSC2 celice so se znižale za 61,4% in 55,8%, oz. RT-qPCR in Western blot so pokazali, da so MMP-2 in MMP-9 navzdol regulirano v dveh stabilnih klonov v primerjavi s kontrolnimi celicami (slika 4C D). V nasprotju s tem, MMP-3 ni bistveno spremenila, tako v mRNA in koncentracije proteina. Poleg tega je analiza pokazala cimografijo aktivnosti tako MMP-2 in MMP-9 v transfektiranih celicah siRNA stabilen bile znatno nižje od tistih v kontrolnih celicah (slika 4e). Zanimivo je, da zdravljenje z pripravljenih medijem SGC7901 ki izločajo velike količine CTGF inducirane ponovno izražanje MMP-2 in MMP-9 in obnovljena migracije in invazijo CTGF razgradljiv stabilnih celic. Ti rezultati kažejo, da rasklapanje od CTGF izražanja zmanjša migracije in vdor želodčnih rakavih celic in zmanjšano ekspresijo MMP-2 in MMP-9. Slika 4 rasklapanje od CTGF izražanja zavira migracije in vdor želodčnih rakavih celic. A. Cell migracije test. B. Cell invazija test. Migracije in invasion celice so bile določene in obarvajo, in reprezentativni polja so fotografirali. Za kvantifikacijo smo celice preštetih 10 naključnih poljih pod svetlobnim mikroskopom (x 200). Trojne teste smo izvedli za vsako skupino celic v invazijo in migracijskih testih, rezultati pa so izraženi kot sredstvo ± SD. C. RT-qPCR je bilo narejeno za analizo mRNA ekspresije MMP-2, MMP-3 in MMP-9 v CTGF razgradljiv stabilnih celičnih linij in kontrolne celice. Stolpci predstavljajo povprečje ± SD treh poskusih. D. vsebnosti beljakovin MMP-2, MMP-3 in MMP-9 so odkrile Western blot. GAPDH bil nadzor protein nakladanje. E. želatina analiza cimografijo za dejavnosti MMP-2 in MMP-9. PSC 1 /PSC2 + CM od SGC7901: PSC 1 ali PSC2 celice smo inkubirali z pripravljenih mediju (CM) z SGC7901 * P <. 0,05, v primerjavi s kontrolo (nadzor je SGC7901).
Downregulation od CTGF zavira peritonealno širjenje raka želodca in vivo
Za raziskovanje učinkov CTGF na peritonealni širjenje želodca rakavih celic in vivo, smo nacepili različne celice v golih miši. SGC7901 celice, nadzor stabilne celične linije (PSNC) in CTGF rasklapanje stabilni celice (PSC 1 in PSC2) smo injicirali v štiri ločene skupine golih miših. Kot posledica tega zdravljenja, merjene zatiranje peritonealno razširjanja pri miših vbrizgali CTGF rasklapanje stabilnih celic v primerjavi s tistimi, vbrizgali SGC7901 celice ali PSNC celice opazili (slika 5A). Kvantitativno so bile opažene 117 ± 20 razširjajo grude za testne miši, cepljenih z SGC7901 celicami in 137 ± 26 razširjajo gomoljev so bile ugotovljene pri miših, cepljenih z PSNC celic. V nasprotju s tem so pomembne manj razširjajo grude mogoče opazovati miših vbrizgali CTGF rasklapanje stabilnih celic (slika 5b). Slika 5 rasklapanje od CTGF zavira želodčni rak SGC7901 ksenotransplantskih peritonealno razširjanje. SGC7901, PSNC and CTGF rasklapanje stabilne celične linije (PSC 1 in PSC2) smo intraperitonealno injicira, kot je opisano v poglavju "Material in metode". 6 tednov kasneje so žrtvovali miši, fotografirali, secirali in so bili prešteti vsi razširjajo grude prisotni na mezenterij in trebušno prepono. A. fotografija golih miškah s peritonealno razširjanja iz vsake skupine. B. razširjajo grude so bile ocenjene. Vsak stolpec predstavlja povprečje ± SD (n = 5 za vsako skupino). * P < 0,05, v primerjavi s kontrolo (nadzor je SGC7901).
Razprava
Najbolj obsežne literature do danes v zvezi z CTGF opredeljuje njegovo vlogo pri celjenju ran in fibroznih bolezni. V zadnjem času so številne študije implicirajo CTGF v razvoj tumorjev in tumorskih celic preživetje [28-30]. Kljub temu, natančna vloga CTGF v napredovanja tumorja ni določen, in funkcija CTGF v tumorskih celic biologije raka želodca ni bilo temeljito raziskati. Za reševanje teh vprašanj, smo ocenili CTGF izraz glede morebitnih neposrednih povezav s celično rast in invazije na želodcu rakavih celic. Poleg tega smo nadalje preučili učinke CTGF na peritonealni širjenje želodčne rakavih celic in vivo.
V tej študiji, naši rezultati kažejo, da je CTGF močno izražena v želodčnih tkivih rakom v primerjavi z običajnimi izravnanih želodčnih tkiva. Izraz CTGF v nediferencirani rakom želodca je bila bistveno višja od tistih v diferenciranim rakom želodca. Izraz CTGF v tumorskem tkivu je bila povezana z bezgavkah metastaz in peritonealno razširjanje. Poleg tega so imeli bolniki s pozitivnim izražanja CTGF bistveno manjši kumulativni pooperativno 5 letno preživetje (22,9%) kot tisti z negativnim CTGF izražanja (48,1%, slika 1C). Ti rezultati kažejo, da bi lahko CTGF sodeluje pri napredovanju in metastaz raka želodca. Poleg tega bi CTGF lahko koristno prognostični označevalec.
Številne nedavne študije so pokazale, da CTGF uravnavajo rast celic v požiralnika rakavih celic in trebušne slinavke rakavih celic [20, 30]. Vendar pa je malo znanega o učinku CTGF izražanja na rast celic želodca rakavih celic. Naši rezultati so pokazali, da CTGF zatiranje povzročilo inhibicijo celične proliferacije in klonogene rasti. Spremembe v rasti celic lahko ključni dejavniki, ki ureja napredovanje raka [31].

• Večje število fosforilacijskih straneh Helicobacter pylori CagA EPIYA C poveča tveganje za raka želodca, vendar ne dvanajstnika ulcer
• Število kopij DNA profili iz želodca predhodnika raka lesions