Regulação negativa do factor de crescimento do tecido conjuntivo inibe o crescimento e invasão de células cancerosas gástricas e atenua difusão peritoneal

Regulação negativa do factor de crescimento do tecido conjuntivo inibe o crescimento e invasão de células cancerosas gástricas e atenua difusão peritoneal
Resumo
fundo
factor de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF) tem sido mostrado a ser implicada no desenvolvimento e progressão do tumor. No entanto, o papel de CTGF em cancro gástrico permanece em grande parte desconhecida.

Resultados Neste estudo, mostrou que o CTGF estava altamente expresso em tecidos de cancro gástrico em comparação com os tecidos normais correspondentes gástricas. A expressão CTGF no tecido tumoral foi associada com grau histológico, metástase em linfonodo e disseminação peritoneal (P < 0,05). Os pacientes com expressão positiva de CTGF tiveram significativamente inferior no pós-operatório acumulada taxa de sobrevivência de cinco anos do que aqueles com expressão negativa de CTGF (22,9% versus 48,1%, P < 0,001). Nós demonstramos que knockdown de expressão CTGF crescimento celular inibiu significativamente das células cancerosas gástricas e diminuição da ciclina D 1 expressão. Além disso, CTGF knockdown de expressão também reduziu acentuadamente a migração e a invasão de células de cancro gástrico e diminuiu a expressão de metaloproteinase da matriz (MMP) -2 e MMP-9. Estudos com animais revelaram que ratinhos nus injectados com o CTGF knockdown linhas celulares estáveis ​​apresentava um número menor de nódulos de semeadura peritoneais do que as linhas de células de controlo.

Conclusões Estes dados sugerem que o CTGF desempenha um papel importante no crescimento celular e na invasão câncer gástrico humano e que parece ser um potencial marcador de prognóstico para pacientes com câncer gástrico.
Palavras-chave
conjuntivo crescimento do tecido proliferação neoplasias fator de estômago celular Invasividade peritoneal divulgação Introdução
Apesar dos avanços significativos na pesquisa de cancro, o cancro continua a ser uma problema de saúde mundial e mortalidade por câncer permanece elevada [1]. O câncer gástrico é a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer no mundo, enquanto parece haver uma tendência decrescente na ocorrência, nomeadamente nos países ocidentais; ele ainda é comumente relatada na China e no Japão [2, 3]. Mesmo que o prognóstico de pacientes com câncer gástrico avançado parece ter melhorado como resultado da padronização de técnicas cirúrgicas e os recentes avanços na quimioterapia, a taxa de sobrevivência pós-operatória de 5 anos permanece baixa [4, 5]. metástase peritoneal é a causa mais comum e significativa da mortalidade após a cirurgia para câncer gástrico [6, 7]. No entanto, os mecanismos de metástase peritoneal não foram claramente definidas.
Factor de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF), também conhecido como CCN2, é um membro da família CCN, incluindo a proteína rica em cisteína 61 (Cyr61), também conhecido como CCN1, e nefroblastoma-over gene expresso (Nov), também conhecido como CCN3, bem como Wisp-1 /elm1 (CCN4), Wisp-2 /rcop1 (CCN5) e Wisp-3 (CCN6) [8, 9]. CTGF acredita-se ser um modulador multifuncional envolvida na sinalização de uma grande variedade de processos biológicos ou patológicos, tais como angiogénese, a osteogénese, a fibrose em rins e da pele, e o desenvolvimento do tumor [10-12]. Embora o papel da fibrose CCN2 em tecido normal tem sido bem estudado [13], a função de CCN2 no cancro não é bem compreendido. Curiosamente, CCN2 tem sido identificada como um oncogene em uma variedade de tipos de cancro, mas é considerado um gene supressor de tumor em outras formas de cancro [14]. Superexpressão de CTGF é encontrado no câncer de próstata [15], gliomas [16], o cancro da mama [17], e do adulto leucemia linfoblástica aguda [18]. A expressão aumentada de CTGF tem sido associada com a progressão de tumores cervicais [19], e carcinoma de célula escamosa esofágica [20]. Por outro lado, em adenocarcinomas do pulmão [21], e os cancros do cólon [22], a sobre-expressão de CTGF inibe a invasão e metástases de células cancerosas in vitro e in vivo.
Estudos clínicos demonstraram que a sobre-expressão de CTGF estava significativamente correlacionada com linfonodo metástases e mau prognóstico em pacientes com câncer gástrico [23, 24]. No entanto, o papel exacto de CTGF no cancro gástrico é ainda desconhecido. Neste estudo, nós detectamos a expressão de CTGF em tecidos com câncer gástrico. Verificou-se que o CTGF foi sobre-expresso em cancro gástrico, e a sua expressão foi associada a comportamento agressivo de cancro gástrico. Em seguida, usamos a tecnologia siRNA para knockdown expressão CTGF endógeno em células cancerosas gástricas. Foi demonstrado que a regulação negativa de CTGF inibiu o crescimento e invasão de cancro gástrico in vitro e atenuado peritoneal difusão in vivo. O nosso estudo destaca fortemente o significado de CTGF no crescimento e invasão de cancro gástrico, e pode proporcionar um alvo terapêutico no cancro gástrico.
Materiais e métodos Reagentes

Dimetil sulfóxido (DMSO) e foram adquiridos da tripsina Sigma (St. Louis, MO, EUA). DMEM, estreptomicina e outros suprimentos de cultura de células foram de GIBCOBRL (Grand Island, NY, EUA). de soro bovino fetal era de Hyclone (Logan, UT, EUA). MTT [brometo de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-diphenyltrazolium brometo] foi obtido de Fluka (Ronkonkoma, NY, EUA). CTGF, ciclina D1, da metaloproteinase de matriz (MMP) -2, MMP-3, MMP-9, e o anticorpo primário GAPDH, bem como segundo anticorpo rodamina (TRITC) -conjugated AffiniPure de cabra anti-IgG de rato foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). kit de ELISA de CTGF foi adquirido a R & D (Minneapolis, MN, EUA). Trizol e Lipofectamine 2000 foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). kit SYBR @ Primescript ™ RT-PCR foi de Takara Biotecnologia, Japão. As amostras de tecido
e coloração imuno-histoquímica
amostras de tumor foram obtidas a partir de 110 pacientes com câncer gástrico submetidos à cirurgia no Departamento de Oncologia Cirúrgica, First filiado Hospital da China Medical University, durante o período 2003-2005. Todos os pacientes foram submetidos a gastrctomy, cujos dados clínicos e patológicos estavam disponíveis. tecidos normais do estômago foram tomadas a partir da margem distai ressecado combinado de amostras de cancro gástrico. Todos os espécimes cirúrgicos foram examinados por patologistas experientes e a margem de ressecção distal era livre de tumor. Os tecidos frescos foram cortados em pequenos pedaços, congelados instantaneamente em azoto líquido imediatamente e armazenado a -80 ° C até à extracção de proteínas. O protocolo do estudo foi revisto e aprovado pelo Comitê da China Medical University de Ética. Compra de coloração imuno-histoquímica, 4 mm cortes histológicos foram desparafinados com xileno e reidratadas através de uma série graduada de álcool. As secções foram então fervidas durante 10 minutos em tampão de citrato 0,01 M e a peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação em 0,3% H 2 O 2 em metanol durante 30 min. A ligação não específica foi bloqueada através da incubação as lâminas com soro de cabra normal durante 30 minutos à temperatura ambiente. As secções foram incubadas durante a noite a 4 ° C com diluição 1:50 do anticorpo primário CTGF. As secções foram expostas ao anticorpo secundário marcado com biotina, durante 1 h, a um sistema de reacção estreptavidina-peroxidase, e, em seguida, desenvolvida com DAB- H 2 O 2. A coloração foi marcado na seguinte escala: 0, sem coloração; 1+, coloração mínima; 2+, moderada a forte coloração em pelo menos 20% das células; 3+, coloração forte em, pelo menos, 50% das células. Casos com 0 ou 1+ coloração foram classificadas como negativas, e casos com 2+ ou 3+ coloração foram classificados como positivos.
Celular Cultura
linhas celulares de cancro gástrico humano, MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 e MGC803 foram obtidos do Departamento de Biologia celular, China Medical University, China. Elas foram cultivadas em DMEM contendo 10% de soro fetal de bovino, 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2. As células foram desalojadas utilizando 0,25% de tripsina e 0,02 mol /L de EDTA em PBS para subcultura.
Construção de CTGF knockdown linhas celulares
Dois pequenos ARN interferente (siRNA) oligonucleótidos estáveis ​​foram sintetizados para segmentar duas regiões diferentes do CTGF ADNc: GTGCATCCGTACTCCCAAA (PSC 1) e GCTAAATTCTGTGGAGTAT (PSC2). Eles foram clonados no vector de expressão de siRNA pGCsilencer ™ U6.Neo.GFP. O siARN inespecífica foi utilizado como um controlo negativo (CPNF). Os plasmídeos de expressão de ARNip foram transfectados para células utilizando SGC7901 Lipofectamine 2000. As células foram rastreadas com G418 (800 ug /ml), e as colónias foram colhidos após 3 semanas, determinados por RT-QPCR e Western blot. As células transfectadas com PSC1, PSC2 ou CPNF foram designados células pSC1 PSC2, células ou células CPNF, respectivamente.
Em tempo real quantitativa de Reacção em Cadeia da Polimerase (RT-QPCR)
O ARN total foi isolado a partir dos sedimentos celulares usando reagente Trizol. O ARN total (1 ug) foi convertido em cDNA usando um RT (transcriptase reversa) kit de reacção. PCR em tempo real foi realizado utilizando Mx3000P-PCR em tempo real do sistema de acordo com as instruções do fabricante e SYBR ® Premix ExTaq como um corante fluorescente específico de ADN. A PCR foi realizada durante 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s e 60 ° C durante 40 s. As sequências dos iniciadores são apresentadas na tabela 1. O ciclo limiar (Ct) foi obtido e quantidades relativas foram determinadas para cada uma das amostras normalizadas para GAPDH. Expressões de mRNA foram calculados utilizando o método ΔΔCt [25] .table 1 PCR Primer Sequências
Gene
Primer Sequências (5'-3 ') frente e reverso
Produto (bp)

CTGF
CTTGCGAAGCTGACCTGGAA
AAAGCTCAAACTTGATAGGCTTGGA
90
MMP-2
ATGACATCAAGGGCATTCAGGAG
TCTGAGCGATGCCATCAAATACA
135
MMP-3
GGGTGAGGACACCAGCATGA
CAGAGTGTCGGAGTCCAGCTTC
178
MMP-9
TCCCAGACCTGGGCAGATTC
GCAAAGGCGTCGTCAATCAC
124
Cyclin D1
GATGCCAACCTCCTCAACGAC
CTCCTCGCACTTCTGTTCCTC
171
GAPDH
GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
TGGTGAAGACGCCAGTGGA
138
A análise Western blot
Os tecidos ou células foram lisadas em tampão RIPA suplementado com uma mistura de inibidor de protease, durante 30 min a 4 ° C. Os lisados ​​celulares foram então sonicadas brevemente e centrifugou-se (14.000 g, a 4 ° C) durante 15 min para remover os materiais insolúveis. Quantidades iguais de proteína foram separadas por SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de PVDF. As membranas foram bloqueadas com leite seco sem gordura 5% e, em seguida, incubadas com o primeiro anticorpo, seguido de anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano. As bandas de proteína foram visualizadas por ECL método de quimioluminescência.
imagiologia confocal de imunofluorescência e
As células em lâminas de câmara de cultura de tecido Lab-Tek foram fixadas em metanol frio a 100% durante 10 minutos, e, em seguida, bloqueadas com soro de cabra normal durante 30 min . As células foram incubadas com o anticorpo primário durante a noite a 4 ° C, lavadas 3 vezes em PBT (PBS com 1 ‰ de Triton X-100), e, em seguida, incubadas com segundo anticorpo conjugado com rodamina. O corante de ADN DAPI foi utilizado para corar o ADN. As células foram fotografadas em uma Leica SP2AOBS microscópio confocal.
O meio condicionado (CM) coleta e ensaio imunoenzimático (ELISA) Sims 3 × 10 5 células foram semeadas em 100 milímetros prato de cultura de tecidos com DMEM contendo 10 % de soro fetal bovino durante 2 dias. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS e incubadas com 5 ml de DMEM isento de soro. 48 h mais tarde, o meio condicionado foi recolhido e centrifugado a 2000 g durante 5 min, passados ​​através de filtros (tamanho de poro, 0,45 um) e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Os níveis de
CTGF nos meios condicionados a partir de linhas celulares de cancro gástrico foram medidos utilizando um kit Quantikine humano ELISA, seguindo as instruções do fabricante.
ensaio de proliferação MTT
a capacidade de proliferação celular foi avaliada utilizando MTT [brometo de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2 , brometo de 5-diphenyltrazolium] ensaio. Aproximadamente 5 x 10 3 células foram semeadas em placas de cultura de 96 poços e cultivadas em DMEM isento de soro durante 24, 48, 72, e 96 h, respectivamente. Em seguida, as células foram incubadas com 20 uL de MTT (10 mg /ml) durante 4 h a 37 ° Cand 200 ul de DMSO foram pipetados para solubilizar o produto formazan durante 20 min à temperatura ambiente. A densidade óptica (OD) foi determinada utilizando um espectrofotómetro (Bio-Rad) a um comprimento de onda de 570 nm.
Ensaio de formação de colónias
5 × 10 2 células em suspensão em 2 ml de 0,3% de agarose meio DMEM contendo soro de bovino fetal a 10% foram plaqueados em placas de 6 poços na parte superior da parte inferior existente 0,6% de agarose com o mesmo meio. As placas foram incubadas a 37 ° C em 5% de CO 2 incubadora. Depois de três semanas, as colónias celulares > 0,1 mm de diâmetro foram contados sob um campo microscópico. Ensaio
celular invasão
A invasão foi determinada por um ensaio de câmara de invasão. As células (2 x 10 4) foram semeadas sobre a câmara de topo de um filtro de membrana microporoso revestidas com matrigel 24 poços com 8 um poros e a câmara inferior foi preenchida com 0,5 mL de DMEM com soro de bovino fetal a 10% como um quimioatrativo. Após incubação durante 24 h, as células não invasoras (câmara superior) foram suavemente removidos utilizando um cotonete e invadir as células (câmara inferior) foram corrigidos usando-se metanol e coradas com azul de tripano. A capacidade invasiva foi determinado pelo número de células que penetram sob um microscópio de ampliação a 200 x durante 10 campos aleatórios em cada.
Ensaio de migração bem Secção
O método de ensaio de migração foi vitro usando um não-revestido com matrigel de 24 poços de câmara de Boyden (8 um, Millipore). As células (2 x 10 4) foram semeadas sobre as inserções em suspensão em 0,2 ml de meio DMEM isento de soro. As células não-migração foram removidos da câmara superior do filtro, após incubação durante 24 h. células migradas foram coradas e quantificada com base no procedimento como descrito anteriormente. Os ensaios foram realizados em triplicado para cada grupo de células em ensaios de invasão e de migração, e os resultados são expressos como médias ± DP.
Gelatina zimografia
MMP-2 e actividade de MMP-9 foi determinada por zimografia em gelatina, como descrito anteriormente [ ,,,0],26]. Em resumo, após a centrifugação o sobrenadante foi separado e a concentração de proteína foi determinada; quantidades iguais de proteína, adicionados por tampão de amostra (Tris-HCl a 1 M, pH 6,8, dodecil sulfato de sódio (SDS) a 2%, glicerol a 10%) foram aplicados a 7,5% de gel de SDS-poliacrilamida contendo 1 mg /ml de gelatina. Após a electroforese, o SDS foi removido a partir do gel, por lavagem duas vezes com 2,5% de Triton X-100 durante 1 h. Após uma breve lavagem, o gel foi incubado a 37 ° C durante 18 h em tampão, pH 7,6, contendo Tris-HCl a 100, 10 mM de CaCl 2, 20 mM de NaCl. O gel foi corado with1% Azul Brilhante de Coomassie R250, durante 2 h e depois tratou-se com solução de descoloração (40% de metanol, 10% de ácido acético, 50% de água destilada). actividade proteolítica foi detectada como bandas claras contra a mancha do substrato não digerida no gel de fundo.
estudo animal do implante peritoneal
Este experimento foi conduzido de acordo com a orientação emitida pelo Estado Food and Drug Administration (SFDA da China ). Os animais foram alojados e tratados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Conselho Nacional de Ciência da República da China ratinhos nus BALB /c.
, 35-40 dias de idade e pesando 20-22 g, foram fornecidos pelo Laboratório Shanghai SLAC animal Company Limited. Os ratinhos foram mantidos sob condições estéreis e alimentados com uma dieta de rato e água esterilizada. Os animais foram anestesiados através de inalação de isoflurance. PSC1, PSC2, CPNF e SGC7901 células (1 × 10 7 células) foram suspensas em 0,5 ml de DMEM e inoculado na cavidade abdominal de ratinhos de teste. Os ratinhos foram sacrificados seis semanas mais tarde, e quaisquer nódulos disseminados presentes no mesentério e diafragma foram avaliados. A análise estatística

Todos os valores no texto e figuras são apresentados como média ± DP. taxas de sobrevida global foram determinadas usando Kaplan-Meier, um evento que está sendo definida como morte por câncer correlacionados causa. O teste de log-rank foi utilizado para identificar diferenças entre as curvas de sobrevivência de grupos diferentes de pacientes. Na análise univariada, 2 caudas χ 2 testes para variáveis ​​categóricas e teste t 2 caudas para variáveis ​​contínuas foram utilizados para comparações estatísticas. Os valores de p
< 0,05 foram tomadas para mostrar uma diferença significativa entre as médias.
Resultados
CTGF é sobre-expresso em cancros gástricos e correlacionados com as características clínico-patológicas do câncer gástrico pacientes
Nós determinamos a expressão de CTGF em tecidos com câncer gástrico e combinados tecidos normais distais . Figura 1A ilustra a expressão de CTGF em cinco pacientes escolhidos aleatoriamente. Os níveis elevados de proteína de CTGF foram encontradas em tecidos de cancro gástrico humano em comparação com os tecidos normais emparelhadas dos pacientes. Isto também foi confirmado por coloração imuno-histoquímica (Figura 1B). Além disso, a fim de investigar adicionalmente a correlação entre a expressão de CTGF e características clinicopatológicas, 110 amostras foram utilizadas para exame com coloração imuno-histoquímica. A análise estatística revelou expressão CTGF positiva foi significativamente associada com grau histológico, metástase em linfonodo e disseminação peritoneal em comparação com aqueles pacientes com expressão CTGF negativo (Tabela 2). expressão CTGF positiva foi mais frequentemente detectada em casos de nódulos linfáticos metástase (P = 0,012). Níveis de expressão de CTGF foram aumentadas significativamente em cancros gástricos indiferenciadas em comparação com cancros gástricos diferenciados (p = 0,039). E a expressão da proteína de CTGF estava significativamente correlacionada com o desenvolvimento de disseminação peritoneal do cancro gástrico (P = 0,011). Cálculo da duração da sobrevida dos 110 pacientes envolvidos pelo método de Kaplan-Meier revelou que os pacientes que destaque tumores CTGF-positivas demonstraram uma menor sobrevida, quando comparado com aqueles pacientes que sofriam de tumores CTGF-negativos (Figura 1C, a P < 0,001 ). Figura 1 sobre-expressão de CTGF em câncer gástrico com pior prognóstico. análise de Western blot A. demonstrou a expressão de CTGF em tecidos com câncer gástrico e combinados tecidos normais distais de cinco pacientes com câncer gástrico selecionados aleatoriamente. resultados B. Imuno-histoquímica de expressão CTGF em amostras de tecido de câncer gástrico emparelhados. curvas de sobrevida C. Kaplen-Meir para 110 pacientes com câncer gástrico, agrupados de acordo com a expressão de CTGF.
Tabela 2 Associação entre a expressão de CTGF e as características clínico-patológicas de pacientes com câncer gástrico (n = 110)

expressão CTGF


negativo
positiva
valor
P
Sexo Masculino

33
34
0,779
fêmeas
20
23
Idade (anos)
≤ 65
35
40
0,642 Art > 65
18
17
tamanho do tumor (cm) Art < 5
26
25
0,585
≥ 5
27
32
localização do tumor
Lower
42
37
0,413
Médio
5
8
superior Sims 3
6
Entire Sims 3
6
grau histológico
Diferenciada
26
17
0,039 *
indiferenciado
27
40
Lauren grau
intestinal
28
21
0,108
difusa
25
36
metástase linfática
negativo
23
12
0,012 *
30
45
positiva
estágio TNM
I
11
8
0,080
II
15
9
III
20
22
IV
7
18
hepático metástases
negativo
50
55
0,588
positivo 3 Página 2
disseminação peritoneal
negativo
50
44
0,011 *

positivo 3
13
* P < 0,05; CTGF, factor de crescimento do tecido conjuntivo.
Expressão de CTGF em linhas celulares de cancro gástrico humano e silêncio siRNA mediada
Primeiramente, examinámos a expressão de CTGF em seis linhas celulares de cancro gástrico (MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 e MGC803) por Western blot. O CTGF foi detectado em todas as linhas celulares avaliadas, e com SGC7901 células que expressam o nível mais alto (Figura 2A). Portanto, as células foram SGC7901 seleccionado como o modelo para os estudos subsequentes de função. Uma vez que o CTGF biologicamente activo é tanto segregada e expressa no citoplasma [8, 27], também medido o nível de CTGF segregado no meio condicionado destas linhas de células de cancro gástrico, por ELISA, que foi coincidiu com o nível de CTGF no citoplasma de cada linha celular (Figura 2B). Figura 2 Expressão de CTGF em linhas celulares de cancro gástrico e knockdown de CTGF por siRNA. Western blot que mostra a expressão A. de CTGF em 6 linhas de células de cancro gástrico. GAPDH serviu como controle de carga de proteína. B. CTGF em meios condicionados de 6 linhas celulares de cancro gástrico e células transfectadas estáveis ​​foram analisados ​​por ELISA. Os resultados são expressos como /ml /1 × 106cells pg (média ± DP, n = 4). análise de mancha C. ocidental da expressão da proteína CTGF em SGC7901, PSNC e CTGF linhas de células knockdown estáveis ​​(PSC 1 e PSC2). D. Análise de imunofluorescência da expressão de CTGF. E. RT-QPCR mostrando os níveis de mRNA CTGF em SGC7901, PSNC e CTGF linhas de células knockdown estáveis ​​(PSC 1 e PSC2). Os dados são expressos como uma alteração de vezes relativamente ao controlo (controlo é SGC7901). Os valores são apresentados como média ± DP de três experiências. * P < 0,05 como comparado com o controlo.
Para estudar a função de CTGF em SGC7901 células, o CTGF knockdown linhas celulares estáveis ​​foram utilizados para analisar o efeito de silenciamento. Tal como mostrado na Figura 2B, o nível de CTGF segregado no meio condicionado foi significativamente diminuída nas células transfectadas de siRNA-estável em comparação com o controlo. Western blot e imunofluorescência mostrou que a expressão da proteína de CTGF no citoplasma diminuiu marcadamente nas CTGF knockdown linhas celulares estáveis ​​(Figura 2C, D). Além disso, a expressão de ARNm de CTGF foi também diminuiu significativamente na CTGF linhas celulares estáveis ​​knockdown (Figura 2E).
Knockdown de expressão de CTGF inibe o crescimento de células de cancro gástrico
O ensaio de formação de colónias foi utilizado para avaliar o crescimento das células em que o CTGF foi silenciada. Como mostrado na Figura 3A, as células de CTGF knockdown estáveis ​​(PSC1 e PSC2) formadas significativamente menos colónias em agar mole em comparação com células SGC7901 e CPNF (83 ± 10, 90 ± 15 versus 30 ± 7 e 20 ± 5, respectivamente). Para testar adicionalmente o efeito negativo de CTGF knockdown sobre o crescimento de células de cancro gástrico, ensaio de MTT foi realizado e as curvas de crescimento foram gerados (Figura 3B). Como mostrado pelas curvas, ambas as células PSC1 e PSC2 proliferaram mais lento do que as células CPNF e SGC7901 células durante o primeiro 96 h após as células foram plaqueadas. A redução drástica da formação de colónias e ao crescimento de células de CTGF silenciados sugerido supressão de CTGF pode regular negativamente o crescimento de células de cancro gástrico. RT-QPCR mostrou que os níveis de mRNA de ciclina de proteínas do ciclo celular relacionados com D1 foram reguladas para baixo nas duas linhas celulares estáveis ​​de CTGF knockdown em comparação com CPNF e SGC7901 (Figura 3C). Consistente com esse resultado, observou-se uma redução acentuada da expressão da proteína ciclina D1 em células knockdown CTGF PSC 1 e PSC2 (Figura 3D). Curiosamente, o tratamento com o meio condicionado de SGC7901 que secretada uma grande quantidade de CTGF foi capaz de salvar a ciclina D1 regulação baixa e restaurar a proliferação celular em células de CTGF knockdown estáveis. Estes dados indicam que a supressão de CTGF pode regular negativamente o crescimento de células de cancro gástrico e diminuir a expressão de ciclina D1. Figura 3 knockdown de expressão de CTGF inibe o crescimento de células de cancro gástrico. ensaio de formação A. Colony. B. Ensaio MTT proliferação. C. Knockdown de CTGF regulada negativamente o nível de mRNA de ciclina D1. D. Knockdown de CTGF para baixo regulamentou o nível de proteína de ciclina D1. PSC1 /PSC2 CM + de SGC7901: células pSC1 ou PSC2 foram incubadas com meio condicionado (CM) de SGC7901. Todos os resultados foram reprodutíveis em três experiências independentes. * P < 0,05 em relação ao controle (controle é SGC7901).
Knockdown de expressão CTGF inibe a migração e invasão das células cancerosas gástricas
migração e invasão celular são processos críticos em metástase de tumor. Foi investigada a migração celular por não-revestidos com Matrigel câmara de Boyden e invasão celular por ensaios de invasão da câmara revestida de matrigel, respectivamente. Nos ensaios de migração (Figura 4A), as taxas de migração da PSC1 e PSC2 células foram significativamente diminuídos quando comparados com o controlo (P < 0,05). Como mostrado na Figura 4B, o CTGF knockdown também reduziu marcadamente as propriedades de invasão de células, quando comparado com o controlo. taxas celular invasão de células PSC 1 e PSC2 foram reduzidos em 61,4% e 55,8%, respectivamente. RT-QPCR e Western blot mostrou que a MMP-2 e MMP-9 foram regulados negativamente nos dois clones estáveis ​​em comparação com células de controlo (Figura 4C; D). Em contraste, a MMP-3 não alterou significativamente, tanto em ARNm e os níveis de proteína. Além disso, a análise mostrou zimografia as actividades de ambas as MMP-2 e MMP-9 em células transfectadas estáveis ​​foram siRNA significativamente mais baixas do que as células de controlo (Figura 4E). Curiosamente, o tratamento com o meio condicionado de SGC7901 que secretada uma grande quantidade de CTGF induzido a re-expressão de MMP-2 e MMP-9 e restaurada a migração e invasão do CTGF knockdown células estáveis. Estes resultados sugerem que o knockdown de expressão de CTGF reduziu a migração e a invasão de células de cancro gástrico e diminuiu a expressão de MMP-2 e MMP-9. Figura 4 knockdown de expressão de CTGF inibe a migração e a invasão de células de cancro gástrico. ensaio de migração celular A.. B. Ensaio celular invasão. células migração e invasão foram fixados e corados e campos representativos foram fotografados. Para quantificação, as células foram contadas em 10 campos aleatórios sob um microscópio de luz (200 ×). Os ensaios foram realizados em triplicado para cada grupo de células em ensaios de invasão e de migração, e os resultados são expressos como médias ± DP. C. RT-QPCR foi feito para análise da expressão de ARNm de MMP-2, MMP-3 e MMP-9 na CTGF knockdown linhas celulares estáveis ​​e células de controlo. Barras representam a média ± DP de três experiências. D. Os níveis de proteína de MMP-2, MMP-3, MMP-9 e foram detectadas por Western Blot. GAPDH serviu como controle de carga de proteína. análise zimografia E. Gelatina para as atividades de MMP-2 e MMP-9. PSC1 /PSC2 CM + de SGC7901: células pSC1 ou PSC2 foram incubadas com meio condicionado (CM) de SGC7901 * P <. 0,05 em relação ao controle (controle é SGC7901).
Regulação negativa do CTGF inibe a disseminação peritoneal do cancro gástrico in vivo
Para explorar os efeitos de CTGF na disseminação peritoneal de células de câncer gástrico in vivo, nós inoculadas células diferentes em ratinhos nus. células SGC7901, controle de linha celular estável (PSNC), e CTGF células knockdown estáveis ​​(PSC 1 e PSC2) foram injetados em quatro grupos distintos de ratos nus. Como consequência de tal tratamento, a supressão da difusão mensurável peritoneal em ratinhos injectados com células estáveis ​​de CTGF knockdown, em comparação com os injectados com células ou células SGC7901 CPNF foi observado (Figura 5A). Quantitativamente, 117 ± 20 nódulos disseminados foram observados para os ratos de teste inoculados com SGC7901 células e 137 ± 26 nódulos disseminados foram observados para camundongos inoculados com células PSNC. Em contraste, menos significativos nódulos disseminados puderam ser observados para os ratos injectados com células estáveis ​​de CTGF knockdown (Figura 5B). Figura 5 Knockdown de CTGF inibe câncer gástrico SGC7901 xenotransplante disseminação peritoneal. SGC7901, PSNC e CTGF linhas de células knockdown estáveis ​​(PSC 1 e PSC2) foram injectados por via intraperitoneal como descrito em "Material e Métodos". 6 semanas mais tarde, os ratinhos foram sacrificados, fotografado, dissecados e quaisquer nódulos disseminados presentes no mesentério e diafragma foram contadas. A. A fotografia de ratinhos nus com disseminação peritoneal de cada grupo. Foram avaliados B. Os nódulos disseminados. Cada barra representa a média ± SD (n = 5 para cada grupo). * P < 0,05 em relação ao controle (controle é SGC7901).
Discussão
A mais extensa literatura até o momento sobre CTGF define seu papel na cicatrização de feridas e doença fibrótica. Recentemente, vários estudos implicam CTGF no desenvolvimento do tumor e sobrevivência das células tumorais [28-30]. No entanto, o papel exacto do CTGF na progressão do tumor não é definida, e a função de CTGF na biologia de células de tumor de cancro gástrico não foi completamente investigada. Para resolver estas questões, nós avaliamos a expressão de CTGF em relação a possíveis correlações diretas com o crescimento celular e invasão das células cancerosas gástricas. Além disso, investigou ainda mais os efeitos de CTGF na disseminação peritoneal de células de cancro gástrico in vivo.
Neste estudo, os nossos resultados mostraram que o CTGF estava altamente expresso em tecidos de cancro gástrico em comparação com os tecidos normais correspondentes gástricas. A expressão de CTGF no câncer gástrico indiferenciada foi significativamente maior do que aqueles em câncer gástrico diferenciado. A expressão CTGF no tecido tumoral foi associado a metástases em linfonodos e disseminação peritoneal. Além disso, os pacientes com expressão positiva de CTGF tiveram significativamente inferior no pós-operatório acumulada taxa de sobrevivência de 5 anos (22,9%) do que aqueles com expressão de CTGF negativa (48,1%, Figura 1C). Estes resultados sugerem que o CTGF podem estar envolvidos na progressão e metástase do cancro gástrico. Além disso, CTGF pode ser um marcador de prognóstico útil.
Vários estudos recentes têm revelado que o CTGF regular o crescimento celular em células cancerosas esofágicas e células de cancro do pâncreas [20, 30]. No entanto, pouco se sabe sobre o efeito da expressão de CTGF no crescimento celular de células de cancro gástrico. Os nossos resultados mostraram que a supressão de CTGF resultaram na inibição da proliferação celular e o crescimento clonogénico. Alterações no crescimento celular pode ser fatores-chave na regulação da progressão do câncer [31].

• Maior número de sítios de fosforilação Helicobacter pylori CagA Epiya C aumenta o risco de câncer gástrico, mas não ulcer
• perfis no número de cópias de DNA do precursor câncer gástrico lesions