Regulacija veznog faktora rasta tkiva koči rast i invaziju želučanih stanica raka i slabi peritonejsku dissemination

regulacija vezivnog faktora rasta tkiva koči rast i invaziju želučanih stanica raka i slabi peritonealnoj širenje pregled apstraktne pregled pozadini pregled vezivnog faktor rasta vezivnog tkiva (CTGF), pokazano je da se medjusobno u razvoju tumora i napredovanja. Međutim, uloga CTGF kod raka želuca ostaje nepoznanica. | Rezultati
U ovom istraživanju, pokazali smo da CTGF je vrlo izražena u želučanom tkivu raka u usporedbi s podudarnim normalnim želučanog tkiva. Izraz CTGF u tumorskom tkivu bio povezan s histološki stupanj, limfnih čvorova metastaza i peritonejsku širenje (P < 0,05). Bolesnici s pozitivnim CTGF izražavanja imali su značajno niži kumulativna postoperativne 5 godina stopa preživljavanja od onih s negativnim izrazom CTGF (22,9% u odnosu na 48,1%, p 0,001). Pokazali smo da je obaranje CTGF izražavanja značajno inhibira rast stanica želučane stanica raka i smanjuje ciklin D 1 izraz. Štoviše, obaranje CTGF ekspresije također značajno smanjuje migraciju i invaziju stanica raka želučanog i smanjio ekspresiju metaloproteinaza matriksa (MMP) -2 i MMP-9. Studije na životinjama otkrila da je goli miševi ubrizgava s CTGF obaranje stabilne stanične linije sadržanu manji broj peritonealnom sijanje kvržica u odnosu na stanične linije kontrole. pregled Zaključci
Ovi podaci ukazuju na to da CTGF igra važnu ulogu u rastu stanica i invazije humanog karcinoma želuca i čini se da potencijalni prognostički marker za pacijente s rakom želuca. pregled Ključne riječi pregled vezivno rast tkiva proliferacija faktor želudac neoplazme invazivnosti stanica Peritonejska širenje Uvod pregled Unatoč značajnom napretku u istraživanju raka, rak ostaje svjetski zdravstveni problem, a smrtnost zbog raka i dalje je visoka [1]. Rak želuca je drugi vodeći uzrok raka povezanih smrti u svijetu, a čini se da je trend smanjenja pojave, osobito u zapadnim zemljama; to je još uvijek najčešće izvijestio je u Kini i Japanu [2, 3]. Iako je prognoza bolesnika s uznapredovalim rakom želuca čini se da su poboljšani kao rezultat standardizacije kirurških tehnika i najnovijim dostignućima u kemoterapiji, 5-godišnje postoperativna stopa preživljavanja i dalje nizak [4, 5]. Peritonejska metastaza je najčešći i značajan uzrok smrtnosti nakon operacije želuca rak [6, 7]. Međutim, mehanizmi peritonejsku metastaze nisu jasno definirani. Pregled, faktor rasta vezivnog tkiva (CTGF), također poznat kao CCN2 je član obitelji CCN, uključujući i cistein bogate proteinima 61 (Cyr61), također poznat kao CCN1 i nefroblastom-over izražen gen (studeni), također poznat kao CCN3, kao i Pramen-1 /elm1 (CCN4), Pramen-2 /rcop1 (CCN5) i Pramen-3 (CCN6) [8, 9]. CTGF Vjeruje se da je višenamjenski modulator signaliziranje koji su uključeni u raznim biološkim, ili patoloških procesa, kao što su angiogeneza, osteogeneze, fibroza u bubrezima i kožu, i razvoja tumora [10-12]. Iako je uloga CCN2 u normalnoj fibroze tkiva je dobro proučeni [13], funkcija CCN2 u rak nije tako dobro razumije. Zanimljivo, CCN2 je identificiran kao onkogena u različitim vrstama raka, ali se smatra gen tumor-supresorski u drugim oblicima raka [14]. Prekomjerna ekspresija CTGF pronađena kod raka prostate [15], glioma [16], raka dojke [17] i odraslih akutna limfoblastična leukemija [18]. Povećana ekspresija CTGF je povezana s progresijom tumora cerviksa [19], te karcinoma skvamoznih stanica jednjaka [20]. Suprotno tome, u plućima adenokarcinoma [21] i rak debelog crijeva [22], pretjerana ekspresija CTGF inhibira invaziju i metastaziranje stanica raka, kako in vitro i in vivo.
Kliničke studije pokazale su da prekomjerno eksprimiraju CTGF bio je značajno koreliraju s limfnog čvora metastaze i loša prognoza u bolesnika s rakom želuca [23, 24]. Međutim, precizna uloga CTGF u karcinoma želuca je još uvijek nepoznat. U ovom istraživanju, otkrio je izraz CTGF u želučanog tkiva raka. otkrili smo da CTGF je povećana kod raka želuca, a ekspresija je povezana s agresivnim ponašanjem raka želuca. Mi smo tada koristili siRNA tehnologiju za obaranje endogenog CTGF izraz u želučanih stanica raka. Pokazali smo da se podreguliranje CTGF inhibirali su rast i invaziju raka želuca in vitro i oslabljena peritonealnoj distribuciju in vivo. Naša studija snažno naglašava značaj CTGF u rastu i invaziju raka želuca, te da ima terapijski cilj u želuca.
Materijali i metode pregled reagensi pregled dimetil sulfoksid (DMSO) i tripsina su kupljene od Sigma (St. Louis, MO, USA). DMEM, streptomicin i drugi potrošni materijal stanične kulture su od GibcoBRL (Grand Island, NY, USA). Fetalnog goveđeg seruma bila Hvclone (Logan, UT, USA). MTT [3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-diphenyltrazolium bromid] je dobiven od Fluka (Ronkonkoma, NY, USA). CTGF, ciklin D1, matričnih metaloproteinaza (MMP) -2, MMP-3, MMP-9 i GAPDH primarnog antitijela, kao i druga antitijela Rhodamine (TRITC) konjugirano affinipure kozji anti-mišji IgG su dobiveni od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). CTGF ELISA kit je kupljen od tvrtke R &D (Minneapolis, MN, USA). Trizol i Lipofektaminje 2000 su kupljeni od Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). SYBR @ Primescript ™ RT-PCR je od Takara-biotehnološki Japanu.
Tkiva primjerci i imunohistokemijska bojanja pregled tumorskih uzoraka dobiveni su od 110 pacijenata s rakom želuca koji je operiran u Klinici za kirurgiju onkologiju, prvo povezana bolnice Kine Medicinski fakultet Sveučilišta u razdoblju 2003-2005. Svi pacijenti podvrgnuti gastrctomy, a njihovi klinički i patološki podaci bili dostupni. Normalni želudac tkiva uzeti su iz odgovarao distalno resected maržu od uzoraka s rakom želuca. Svi kirurški Uzorci su ispitani od strane iskusnih patologa i distalni resected marža bila bez tumora. Svježe tkiva se izreže u male komadiće, trenutno zamrznuta u tekućem dušiku odmah i pohranjeni na -80 ° C do ekstrakcije proteina. Protokol istraživanja je pregledan i odobren od strane Etičkog povjerenstva Kine Medicinskom fakultetu Sveučilišta.
Za imunohistokemijsku bojenja, 4 um histološke sekcije su deparafmizirane s ksilena i rehidrira kroz vrhunske zbirke alkohola. Uzorci su potom kuha se 10 minuta u 0.01 M citratnom puferu i endogene peroksidaze je blokirana inkubacijom u 0.3% H 2 O 2 u metanolu tijekom 30 min. Nespecifično vezanje blokirano je inkubacijom slajdove s normalnim kozjim serumom tijekom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Sekcije su inkubirane preko noći na 4 ° C s 1:50 razrjeđenju CTGF primarnim antitijelima. Sekcije su izložene biotin-obilježenog sekundarnim protutijelom tijekom 1 sata, u reakcijski sustav streptavidin-peroksidaza, a nakon toga razvijen DAB- H 2 O 2. Bojenje je zabio na sljedećoj skali: 0, bez mrlja; 1+, minimalno bojenje; 2+, umjereno do jako obojenja u najmanje 20% stanica; 3+, intenzivno obojenje u najmanje 50% stanica. Slučajevi s 0 ili 1+ mrlja su klasificirani kao negativno, a slučajevi s 2+ ili 3+ mrlja su klasificirani kao pozitivni. Pregled, kulturi stanica pregled ljudskog želučanog raka stanične linije, MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 i MGC803 dobiveni su iz Odjela za staničnu biologiju, China Medical University, Kina. Su u DMEM koji sadrži 10% fetalnog telećeg seruma, 100 U /ml penicilina, 100 ug /ml streptomicina, na 37 ° C u vlažnoj atmosferi 5% CO 2. Stanice su se pomaknu pomoću 0,25% tripsina i 0.02 mol /l EDTA u PBS subkulture. Pregled Izgradnja CTGF obaranje stabilne stanične linije
Dva mala smetaju RNA (siRNA) nukleotida sintetizirani su za cilj dvije različite regije u CTGF cDNA: GTGCATCCGTACTCCCAAA (PSC1) i GCTAAATTCTGTGGAGTAT (PSC2). Klonirani su u ekspresijski vektor siRNA pGCsilencer ™ U6.Neo.GFP. Nespecifični siRNA se koristi kao negativna kontrola (PSNC). SiRNA ekspresijski plazmidi su transfektirani u stanice pomoću Lipofectamin SGC7901 2000. a stanice su testirane s G418 (800 ug /ml), a kolonije se sakupe nakon 3 tjedna, određeni su pomoću RT-qPCR i Western blot. Stanice transfektirane s PSC1, PSC2 ili PSNC su označeni PSC1 stanice PSC2 stanice ili PSNC stanica. Pregled Real-Time Kvantitativna lančana reakcija polimeraze (RT-qPCR) pregled Ukupna RNA je izolirana iz staničnih peleta pomoću Trizol reagensa. Ukupna RNA (1 ug), preobraćen je u cDNA pomoću RT (reverzna transkripcija) reakcija kit. Real-time PCR je izvedena pomoću Mx3000P real-time PCR sustava u skladu s uputama proizvođača i SYBR ® premiks ExTaq kao specifičnog fluorescentnom bojom DNA. PCR je izvršena na 40 ciklusa 95 ° C u trajanju od 5 sekundi i 60 ° C tijekom 40 sekundi. Nizovi primera su prikazani u tablici 1. prag ciklusa (Ct) dobije se i relativna količina određeni su za svaki uzorak je normalizirana na GAPDH. Iskazi mRNA izračunate su pomoću ΔΔCt metode [25] .table 1 PCR Nizovi pregled Gene
sekvencijama (5'-3 ') prema naprijed i natrag
pregled proizvoda (bp)

CTGF
CTTGCGAAGCTGACCTGGAA
AAAGCTCAAACTTGATAGGCTTGGA
90
MMP-2
ATGACATCAAGGGCATTCAGGAG
TCTGAGCGATGCCATCAAATACA
135
MMP-3
GGGTGAGGACACCAGCATGA
CAGAGTGTCGGAGTCCAGCTTC
178
MMP-9
TCCCAGACCTGGGCAGATTC
GCAAAGGCGTCGTCAATCAC
124
Cyclin D1
GATGCCAACCTCCTCAACGAC
CTCCTCGCACTTCTGTTCCTC
171
GAPDH
GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
TGGTGAAGACGCCAGTGGA
138
Western blot analiza pregled tkiva ili stanice su lizirane u RIPA puferom, uz dodatak inhibitora proteaza smjesu se 30 minuta na 4 ° C. Stanični lizati su potom kratko i centrifugira (14.000 g na 4 ° C) tretiran u ultrazvučnoj kupelji tijekom 15 min da se ukloni netopljiva tvar. Jednake količine proteina su razdvojeni pomoću SDS-PAGE i prenesen na PVDF membrani. Membrane su blokirane s 5% nemasnim suhim mlijekom i potom inkubiraju s prvim antitijelom, nakon čega slijedi peršin peroksidazu- konjugiranih sekundarnih antitijela. Proteinske vrpce su vizualizirani ECL postupkom kemiluminescencije. Pregled imunofluorescencije Confocal slike pregled stanice na Lab-Tek komorama za kulturu tkiva stakalca su fiksirani u hladnom 100% metanola za 10 minuta, i zatim su blokirane s normalnim kozjim serumom tijekom 30 minuta , Stanice se inkubiraju s primarnim antitijelom preko noći na 4 ° C, isprane 3 puta u PBT (PBS s 1 ‰ Triton X-100), i zatim inkubirane s drugim protutijelom konjugiranim s rodaminom. DNA boja DAPI se koristi za bojenje DNK. Stanice su prikazani na Leica SP2AOBS konfokalnog mikroskopa.
Kondicionirani medij (CM) prikupljanje i enzimskim imunoesejom (ELISA) pregled 3 × 10 5 stanice su posađene na posudu za kulturu tkiva 100 mm, sa DMEM koji je sadržavao 10 % fetalnog goveđeg seruma tijekom 2 dana. Zatim su stanice dva puta isprane s PBS-om i inkubirane s 5 ml DMEM bez seruma. 48 sati kasnije, kondicionirani medij se sakupi i centrifugira pri 2000 g tijekom 5 minuta, propusti kroz filtere (veličina pora 0,45 um) i pohranjena na -80 ° C do upotrebe.
Razine CTGF u kondicioniranom mediju iz želučani stanične linije raka su mjereni pomoću humanog Quantikine ELISA prema uputama proizvođača. pregled iSPITIVANJE MTT pROLIFERACIJE pregled sposobnošću proliferacije stanica je ispitana primjenom MTT [3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2 5-diphenyltrazolium bromid] analizi. Približno 5 × 10 3 stanice su posađene na ploču za kulturu pločama s 96 jažica i uzgajane u DMEM bez seruma tijekom 24, 48, 72 i 96 h, respektivno. Zatim su stanice inkubirane s 20 ul MTT-a (10 mg /ml) tijekom 4 sata na 37 ° Cand 200 ul DMSO pipetirano za otapanje formazana proizvoda za 20 min na sobnoj temperaturi. Optička gustoća (OD) je određena upotrebom spektrofotometra (Bio-Rad) na valnoj duljini od 570 nm. Pregled Colony formiranje Test pregled 5 × 10 2 stanice su suspendirane u 2 ml 0,3% agaroznom DMEM mediju sadržava 10% fetalnog goveđeg seruma su nasađene u ploče sa 6 jažica na vrhu postojećih 0,6% agaroznom dno s istom mediju. Ploče se inkubiraju na 37 ° C u CO s 5% 2 inkubator. Nakon tri tjedna, staničnih kolonija > 0,1 mm u promjeru izbrojene pod mikroskopskom polju. Test pregled Cell invazija pregled Invazija je određena ispitivanjem invazija komore. Stanice (2 x 10 4) nasađeno je na gornju komoru membranskog filtera sa mikroporama u Matrigel obložene 24 jažica s 8 um pore i donja komora ispunjena 0,5 ml DMEM sa 10% fetalnog goveđeg seruma kao kemoatraktant. Nakon inkubacije tijekom 24 sata, ne-invaziju stanica (gornje komore) lagano se uklone pomoću štapića pamuk vrhom i invaziju stanica (niži komore) su utvrđeni upotrebom metanola i obojeni trypan blue. Invazivni sposobnost određena je brojem prodiru stanica pod mikroskopom na 200 × uvećanjem za 10 slučajnih polja u svakoj dobro. Pregled testu komorni migracije
postupku in vitro migracija je korištenjem ne-Matrigel-obložene 24-te Boyden komora (8 pm, Millipore). Stanice (2 x 10 4) nasađeno je na pločice koje su suspendirane u 0,2 ml medija DMEM bez seruma. Ne-migrirajućeg stanice se uklanjaju iz gornje komore filtera nakon inkubacije kroz 24 sata. Premješten stanice su obojene i kvantificirana na temelju postupka kako je opisano ranije. Trostruki testovi su izvedeni za svaku skupinu stanica invazije i migraciju testovima, a rezultati su izraženi kao prosjek ± SD. Pregled želatinske zimografije pregled MMP-2 i MMP-9 aktivnost je određena pomoću želatinske zimografije kao što je prethodno opisano [ ,,,0],26]. Ukratko, nakon centrifugiranja, matičnica je odvojena i koncentracija proteina određena; Jednake količine proteina, dodaju uzorku pufera (Tris-HCl 1M, pH 6.8, natrij dodecil sulfat (SDS) 2%, glicerol 10%) se primjenjuju na 7.5% SDS-poliakrilamidni gel koji sadrži 1 mg /ml želatine. Nakon elektroforeze, SDS se ukloni iz gela ispiranjem dva puta s 2,5% TritonX-100 tijekom 1 sata. Nakon kratkog ispiranja, gel se inkubira na 37 ° C tijekom 18 sati u puferu, pH 7.6, koji sadrži 100 mM Tris-HCl, 10 mM CaClz 2, 20 mM NaCl. Gel je zamrljana with1% Coomassie brilliant blue R250 za 2 sata, a zatim se pomiješa s otopinom destaining (40% metanol, 10% octene kiseline, 50% destilirane vode). Proteolitičke aktivnosti detektiran kao jasne bendova na pozadini mrlje neprobavljene supstrata u gelu.
Životinja studiju peritonejsku implantacije pregled Ovaj eksperiment je proveden u skladu sa smjernicom koju izdaje Državni Food and Drug Administration (SFDA Kine ). Životinje su smještene i zbrinut je u skladu sa smjernicama utvrđenim od strane Nacionalnog vijeća za znanost Republike Kine. Pregled Ženski BALB /c golim miševima, 35-40 dana stari i težine 20-22 g, su dobili od Shanghai SLAC Laboratory Animal Limited Company. Miševi su držani u sterilnim uvjetima te hranjeni steriliziranu miša prehranu i vodu. Životinje su anestezirane inhalacijom isoflurance. PSC1, PSC2, PSNC i SGC7901 stanice (1 × 10 7 stanica) su suspendirani u 0.5 ml seruma i inokulira u trbušnu šupljinu ispitnih miševa. Miševi su žrtvovani šest tjedana kasnije, a procijenjeni su sve diseminirane čvorići prisutni na mezenterija i dijafragmu.
Statistička analiza pregled svih vrijednosti u tekstu i podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD. Ukupni stope preživljavanja su određena pomoću Kaplan-Meier procjenitelja, manifestacija koja se definira kao smrt od karcinoma povezana uzroka. Test log-rank se koristi za prepoznavanje razlike između krivulja preživljavanja različitih skupina bolesnika. U univarijatne analize, 2-tailed χ korištene su 2 testovi za kategoričke varijable i dva repa t testom za kontinuirane varijable za statističke usporedbe. Vrijednosti p Netlogu < 0.05 su uzeti pokazati značajnu razliku između sredstava. Pregled Rezultati
CTGF je izraženo u želučanog karcinoma i korelira s kliničkopatološkim obilježja karcinoma želuca bolesnika
Odredili smo izražaj CTGF u želučanog tkiva raka i uskladiti distalni normalna tkiva , Slika 1A je prikazano izraz CTGF u pet nasumično ubranih pacijenata. Povišene razine CTGF proteina se nalaze u ljudskim tkivima s rakom želuca u usporedbi s uparenim normalnim tkivima bolesnika. To je također potvrđeno imunohistokemijsko bojanje (Slika 1B). Osim toga, kako bi se dodatno ispitao korelaciju između ekspresije CTGF i klinikopatološkim značajke, 110 uzorci koriste za pregled s imunokemijska ispitivanja. Statistička analiza pokazala pozitivne CTGF izražavanje bilo značajno povezano s histološki stupanj, limfnih čvorova metastaza i peritonejsku širenja u usporedbi s onim pacijentima s negativnim izrazom CTGF (tablica 2). Pozitivna CTGF ekspresija je češće detektirana u slučajevima limfnih čvorova metastaza (P = 0,012). Razine CTGF izražavanja znatno su povećane u nediferenciranih želučanog karcinoma u usporedbi s diferenciranim želučanog karcinoma (P = 0,039). A izraz CTGF proteina značajno povezana s razvojem peritonejsku širenje karcinoma želuca (P = 0,011). Izračun trajanja preživljavanja 110 uključenih pacijenata po Kaplan-Meier metodi pokazala je da pacijenti koji su istaknuta CTGF-pozitivnih tumora pokazalo kraći preživljavanje u usporedbi s onim pacijentima koji su patili od CTGF negativnim tumorima (Slika 1C, P < 0.001 ). Slika 1. Prekomjerna ekspresija CTGF u raka želuca s lošijim prognozama. A. Western blot analiza pokazala izraz CTGF u želučanog tkiva raka i odgovarajuće distalnim normalnog tkiva iz pet slučajno odabranih pacijenata s rakom želuca. B. imunohistokemijski rezultati od CTGF izražavanja u uparenih uzoraka želučane rak tkiva. C. Kaplen-Meir krivulje preživljavanja za 110 pacijenata s rakom želuca, grupirane prema CTGF izražavanja. Pregled Tablica 2. Povezanost između ekspresije CTGF i kliničko obilježja bolesnika s karcinomom želuca (n = 110) pregled pregled CTGF izražavanja
pregled pregled Negativna
pozitivan
vrijednost P

Spol pregled muški pregled, 33 pregled, 34 pregled 0,779 pregled ženskih pregled 20
23
Dob (godine) pregled ≤ 65 pregled, 35 pregled, 40 pregled 0,642 izvoznici > 65 pregled, 18 pregled, 17 pregled, tumor veličine (cm) izvoznici < 5. pregled 26 pregled, 25 pregled 0,585 pregled ≥ 5
27 pregled, 32 pregled lokacija tumora pregled donjem pregled, 42 pregled, 37 pregled 0.413 Netlogu Srednji pregled 5
8
Gornja pregled 3
6 pregled Cijeli pregled 3
6
Histološka ocjena pregled diferenciranog pregled 26 pregled, 17 pregled 0.039 * pregled nediferencirane pregled, 27 pregled, 40 pregled, Lauren razred pregled crijeva pregled 28 pregled, 21 pregled 0,108 pregled difuznu pregled 25
36 pregled limfnih čvorova metastaze pregled Negativna pregled 23 pregled, 12 pregled 0,012 * pregled pozitivnih pregled, 30 pregled, 45 pregled TNM stadij pregled sam
11
8 pregled 0,080 pregled II
15 pregled, 9 pregled III
20 pregled, 22 pregled IV pregled 7 pregled 18
jetre metastaze pregled negativna pregled 50 pregled, 55 pregled 0,588 pregled pozitivnog Netlogu 3 pregled 2 pregled Peritonejska širenje pregled negativna pregled 50
44 Netlogu 0.011 *
Pozitivan pregled 3
13 pregled * P < 0,05; CTGF, vezivno tkivo faktora rasta. Pregled Ekspresija CTGF u ljudskim staničnim linijama karcinoma želuca i siRNA posredovanog tišine
Prvo, ispitali smo ekspresiju CTGF šest staničnih linija raka želuca (MKN-45, MKN-1 AGS, SGC7901, BGC823 i MGC803) Western blot. CTGF otkriven je u svim staničnim linijama vrednovani i sa SGC7901 stanice izražavaju na najvišoj razini (slika 2a). Dakle, SGC7901 stanice su izabrani kao model za naknadne funkcija studija. Jer biološki aktivni CTGF se i izlučuje i izražen u citoplazmi [8, 27], također mjeriti razinu izlučenog CTGF u kondicioniranom mediju ovih želučanih staničnim linijama raka pomoću ELISA, koji se podudara s razinom CTGF u citoplazmi svakog stanične linije (Slika 2B). Slika 2 ekspresiju CTGF u staničnim linijama raka želuca i obaranje CTGF po siRNA. A. Western blot prikazuje ekspresiju CTGF u 6 želučanim staničnim linijama raka. GAPDH služio kao kontrola protein punjenja. B. CTGF u kondicioniranom mediju 6 želučanih staničnih linija raka i stabilne transficirane stanice analizirana je ELISA-om. Rezultati su izraženi kao pg /ml /1 × 106cells (srednja vrijednost ± SD, n = 4). C. Western blot analiza od CTGF ekspresije proteina u SGC7901, PSNC i CTGF obaranje stabilne stanične linije (PSC1 i PSC2). D. Imunofluorescencija analiza CTGF izražavanja. E. RT-qPCR pokazuje razinu CTGF mRNA u SGC7901, PSNC i CTGF obaranje stabilne stanične linije (PSC1 i PSC2). Podaci su izraženi kao mnogostrukost promjene u odnosu na kontrolu (kontrola SGC7901). Vrijednosti su dane kao prosjek ± SD tri pokusa. * P < 0,05 u odnosu na kontrolu.
Za proučavanje funkcije CTGF u SGC7901 stanicama, CTGF obaranje stabilne stanične linije korištene za analizu utišavanje učinak. Kao što je prikazano na Slici 2B, razina izlučenog CTGF u kondicioniranom mediju bio je značajno smanjena u transficiranih stanica siRNA stabilan u usporedbi s kontrolom. Western blot i imunofluorescencija bojenje je pokazalo da je ekspresija CTGF protein u citoplazmi značajno smanjio u CTGF obaranje stabilnih staničnih linija (Slika 2C, D). Nadalje, izraz CTGF mRNA je također značajno smanjio u CTGF obaranje stabilne stanične linije (Slika 2E). Pregled obaranje CTGF izražavanja inhibira rast stanica želuca raka
Test na koloniziranje je korišten za procjenu rasta stanica u kojima su utihnuli CTGF. Kao što je prikazano na slici 3A, CTGF obaranje stabilne stanice (PSC1 i PSC2) oblikovan znatno manje kolonije na mekanom agaru u odnosu na SGC7901 i PSNC stanica (83 ± 10 90 ± 15 naspram 30 ± 7 i 20 ± 5, respektivno). Kako bi se dodatno testirati negativan učinak CTGF obaranje na rast želučane stanice raka, MTT test je izveden i krivulje rasta su generirani (slika 3B). Kao što je prikazano krivulja, i PSC1 i PSC2 stanice proliferiraju sporije PSNC stanica i SGC7901 stanica u prvom 96 sati nakon stavljanja stanica na ploču. Dramatično smanjenje formiranja kolonija i rast CTGF prigušivačem stanica predložio CTGF potiskivanje moglo negativno reguliraju želučanu rast stanica raka. RT-qPCR pokazali da su razine mRNA za stanični ciklus povezan s protein-ciklina D1 je podregulirana u dva CTGF obaranje stabilnih staničnih linija u usporedbi sa PSNC i SGC7901 (Slika 3C). U skladu s tim rezultatom, gledali smo značajno smanjenje ekspresije ciklina D1 proteina u CTGF obaranje stanice PSC1 i PSC2 (Slika 3D). Zanimljivo je da tretman s uvjetovanim medij SGC7901 koje luče veliku količinu CTGF bio u mogućnosti spasiti ciklin D1 downregulation i vratiti proliferaciju stanica u CTGF obaranje stabilne stanice. Ovi podaci pokazuju da CTGF potiskivanje moglo negativno reguliraju želučanu rast stanica raka i smanjiti ciklin izraz D1. Slika 3 obaranje CTGF izražavanja inhibira rast stanica želuca raka. A. kolonija Test formacija. B. ISPITIVANJE MTT PROLIFERACIJE. C. obaranje CTGF se regulira razinu mRNA ciklina D1. D. obaranje CTGF se regulira razinu proteina ciklina D1. PSC1 /PSC2 + CM od SGC7901: PSC1 ili PSC2 stanice se inkubiraju s kondicioniranom mediju (CM) u SGC7901. Svi rezultati su bili reproducibilni u tri neovisna pokusa. * P < 0.05 u odnosu na kontrolu (kontrola SGC7901). Pregled obaranje CTGF izražavanja inhibira migraciju i invaziju želučanih stanica raka pregled migracija stanica i invazije su kritični procesi u metastaza tumora. Istraživali smo migraciju stanica ne-Matrigel obložene Boyden komore i invaziju stanica koje invazija komornih testovima Matrigel premazom, respektivno. Migraciju analiza (Slika 4A), brzine putovanja PSC1 i PSC2 stanice su bile značajno smanjene u usporedbi s kontrolom (p 0,05). Kao što je prikazano na slici 4B, CTGF obaranje također značajno smanjuje stanične invazije svojstva u usporedbi s kontrolom. Invazije stanica stope PSC1 i PSC2 stanica smanjeni su za 61,4% i 55,8%, respektivno. RT-qPCR i Western blot pokazali da MMP-2 i MMP-9 dolje su regulirani u dva stabilna klonova u usporedbi s kontrolnim stanicama (Slika 4C D). Za razliku od toga, MMP-3 nije se značajno promijenila, kako u mRNA i proteina. Nadalje, zimografiia analiza pokazala aktivnosti MMP-2 i MMP-9 u transficiranih stanica siRNA stabilni su bile značajno niže od onih kod kontrolnih stanica (Slika 4E). Zanimljivo, tretman s kondicioniranom mediju SGC7901 koje luče velike količine CTGF inducirane ponovno ekspresiju MMP-2 i MMP-9 i obnovljena migraciju i invaziju CTGF obaranje stabilne stanice. Ovi rezultati sugeriraju da obaranje CTGF ekspresije smanjila migraciju i invaziju stanica raka želučanog i smanjena je ekspresiju MMP-2 i MMP-9. Slika 4 obaranje CTGF izražavanja inhibira migraciju i invaziju želučanih stanica raka. A. migraciju stanica test. B. Cell Test invazije. Migraciju i invaziju stanice su fiksirane i obojene, a reprezentativna polja su fotografirane. Za kvantifikaciju, stanice su izbrojane u 10 slučajnih polja pod svjetlosnim mikroskopom (× 200). Trostruki testovi su izvedeni za svaku skupinu stanica invazije i migraciju testovima, a rezultati su izraženi kao prosjek ± SD. C. RT-qPCR je učinjeno za analizu mRNA ekspresiju MMP-2, MMP-3 i MMP-9 u CTGF obaranje stabilnih staničnih linija i kontrolnih stanica. Trake predstavljaju prosjek ± SD od tri pokusa. D. razina proteina od MMP-2, MMP-3 i MMP-9 su detektirani Western blot. GAPDH služio kao kontrola protein punjenja. E. Želatina analiza zimografiia za aktivnosti MMP-2 i MMP-9. PSC1 /PSC2 + CM od SGC7901: PSC1 ili PSC2 stanice se inkubiraju s kondicioniranom mediju (CM) u SGC7901 * P '. 0.05 u odnosu na kontrolu (kontrola SGC7901). Pregled silazni CTGF inhibira peritonealnoj širenje raka želuca in vivo pregled Kako bi istražili učinke CTGF na peritonealnoj širenje želuca stanica raka in vivo, inokulirane smo različite stanice u golim miševima. SGC7901 stanice kontroliraju stanična linija (PSNC) i CTGF obaranje stabilne stanice (PSC1 i PSC2) se injektira u četiri odvojene skupine miševa. Kao posljedica takvog liječenja, mjerljive suzbijanje peritonealnu širenje u miševa kojima je injektiran CTGF obaranje stabilnih stanica u usporedbi s onima koji su injicirani s SGC7901 stanice ili PSNC stanica primijećeno je (Slika 5A). Kvantitativno, 117 ± 20 diseminirani čvorići su poznati po ispitnim miševa kojima SGC7901 stanica i 137 ± 26 rasprostranjenih kvržica su poznati po miševa kojima PSNC stanica. Za razliku od toga, značajna manje diseminirani čvorovi bili u mogućnosti promatrati za miševe kojima je ubrizgan CTGF obaranje stabilnim stanica (Slika 5b). Slika 5 obaranje CTGF inhibira rak želuca SGC7901 ksenografta peritonealnoj širenje. SGC7901, PSNC and CTGF obaranje stabilne stanične linije (PSC1 i PSC2) su intraperitonealno kao što je opisano pod "Materijali i metode". 6 tjedana kasnije, miševi su žrtvovani, fotografiranja izrezana i bilo diseminirane čvorići prisutni na mezenterija i dijafragme su izbrojene. A. fotografija golih miševa s peritonejskom širenje iz svake skupine. Procijenjeni su B. diseminirani čvorići. Svaki stupić predstavlja srednju vrijednost ± SD (n = 5 za svaku skupinu). * P < 0.05 kao pregled, u odnosu na kontrolu (kontrola SGC7901). Rasprava pregled Najopsežniji literaturi do sada u vezi CTGF definira svoju ulogu u ozdravljenju rane i fibroznog bolesti. Nedavno je nekoliko studija ukazuju CTGF u razvoju tumora i preživljavanje tumorskih stanica [28-30]. Međutim, točna uloga CTGF u napredovanja tumora nije određen, a funkcija CTGF u tumorske stanične biologije raka želuca nije temeljito istražene. Za rješavanje tih pitanja, istražili smo ekspresiju CTGF s obzirom na moguće izravne povezanosti s rastom stanica i invazije želučanih stanica raka. Osim toga, mi dodatno istražiti učinke CTGF na peritonealnoj širenje želuca stanica raka in vivo.
U ovoj studiji, naši rezultati pokazuju da CTGF je vrlo izražena u želučanom tkivu raka u usporedbi s podudarnim normalnim želučanog tkiva. Ekspresija CTGF u nediferencirani karcinom želuca bio je značajno viši od onih u diferenciranim raka želuca. Izraz CTGF u tumorskom tkivu bio povezan s limfni čvor metastazama i peritonealnoj širenje. Nadalje, bolesnici s pozitivnim CTGF izražavanja imali su značajno niži kumulativna postoperativne 5 godina stopa preživljavanja (22.9%) od onih s negativnim izrazom CTGF (48,1%, Slika 1C). Ovi rezultati sugeriraju da CTGF mogli biti uključeni u napredovanje i metastaziranja raka želuca. Štoviše, CTGF može biti koristan prognostički marker.
Nekoliko nedavnih istraživanja su otkrila da CTGF regulirati rast stanica u jednjaku stanica raka i stanica raka gušterače [20, 30]. Međutim, malo je poznato o utjecaju CTGF izrazom na rast stanica želučane stanice raka. Naši rezultati pokazuju da CTGF potiskivanje rezultiralo inhibiciju stanične proliferacije i klonogene rasta.

• Veći broj Helicobacter pylori CagA EPIYA C fosforilacije mjestima povećava rizik od raka želuca, ali ne i na dvanaesniku
• broj DNK kopija profili želučane preteča raka lesions