Zníženie expresie spojivového tkaniva rastového faktora inhibuje rast a inváziu buniek karcinómu žalúdka a zmierňuje peritoneálnej šírenie

Zníženie expresie spojivového tkaniva rastového faktora inhibuje rast a inváziu buniek karcinómu žalúdka a zmierňuje peritoneálnej šírenie
abstraktné
pozadia
rastového faktora spojivového tkaniva (CTGF), bolo preukázané, že sa podieľajú na vzniku nádoru a progresii. Avšak role CTGF v karcinómu žalúdka je stále do značnej miery neznáma.
Výsledky
V tejto štúdii sme ukázali, že CTGF bol vysoko exprimovaný v žalúdočných rakovinových tkanivách v porovnaní s spárovaných normálnou žalúdočné tkaniva. CTGF expresiu v nádorovom tkanive bola spojená s histologického stupňa, lymfatických uzlín a peritoneálnej šírenie (P menšia ako 0,05). Pacienti s pozitívnym CTGF expresiu mal výrazne nižšiu súhrnnú pooperačné 5 ročné prežitie ako pacienti s negatívnym CTGF expresiu (22,9% oproti 48,1%, p 0,001). Preukázali sme, že vyraďujúce CTGF expresie významne inhibujú rast buniek z buniek karcinómu žalúdka a zníženie cyklin D 1 výraz. Okrem toho, porazený CTGF expresiu tiež výrazne znižuje migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka a zníženie expresie matrix metaloproteinázy (MMP) -2 a MMP-9. Štúdie na zvieratách sa zistilo, že nahých myší s injekciou CTGF knockdown stabilné bunkové línie predstavoval menší počet peritoneálnych siatie uzlíkov než bunkových línií kontroly.
Závery
Tieto dáta naznačujú, že CTGF hrá dôležitú úlohu v raste buniek a inváziu v ľudská rakovina žalúdka, a zdá sa, že potenciálny prognostický marker u pacientov s karcinómom žalúdka.
Kľúčové
Spojivové rastový faktor, tkanivový žalúdočné nádory bunkovej proliferácie invazívnosti peritoneálnej šírenie Úvod
Napriek značnému pokroku vo výskume rakoviny, rakoviny zostáva celosvetový zdravotný problém a úmrtnosť na rakovinu zostáva vysoká [1]. Karcinómu žalúdka je druhou najčastejšou príčinou úmrtí na nádorové ochorenie na svete, pričom sa zdá, že klesajúci trend vo výskyte, a to najmä v západných krajinách; to je ešte často hlásené v Číne a Japonsku [2, 3]. Aj napriek tomu, že prognóza pacientov s pokročilou rakovinou žalúdka Zdá sa, že zlepšenie v dôsledku štandardizácie chirurgických techník a nedávne pokroky v chemoterapii, 5-ročné prežitie po operácii zostáva nízka [4, 5]. Peritoneálnej metastázy je najbežnejší a významnou príčinou úmrtnosti po operácii rakoviny žalúdka [6, 7]. Avšak, mechanizmy peritoneálnej metastázy neboli jasne definované.
Rastový faktor spojivového tkaniva (CTGF), tiež známy ako CCN2 je členom CCN rodiny, vrátane cysteín bohaté na proteín 61 (Cyr61), tiež známy ako CCN1 a nefroblastom-over exprimovaného génu (XI), tiež známy ako CCN3, rovnako ako Wisp-1 /elm1 (CCN4), Wisp-2 /rcop1 (CCN5) a Wisp-3 (CCN6) [8, 9]. CTGF sa predpokladá, že multifunkčné signalizačné modulátor zapojené v celej rade biologických a patologických procesov, ako je angiogenézy, osteogeneze, fibrózy obličiek a kožu, a vývoj nádoru [10-12]. Hoci úloha CCN2 než v normálnej tkanív fibrózy je dobre študoval [13], funkcia CCN2 u rakoviny nie je tak dobre rozumie. Je zaujímavé, že CCN2 bol identifikovaný ako onkogén v rôznych typov rakoviny, ale je považovaný za tumor-supresorové gén v iných foriem rakoviny [14]. Zvýšená expresia CTGF sa nachádza v karcinómu prostaty [15], gliómami [16], rakovina prsníka [17], a dospelých pacientov s akútnou lymfoblastickou leukémiou [18]. Zvýšená expresia CTGF bolo spojené s progresiou nádoru krčka maternice [19], a pažeráka spinocelulárneho karcinómu [20]. Naopak, v pľúcnych adenokarcinómov [21] a rakoviny hrubého čreva [22], že nadmerná expresia CTGF bráni inváziu a metastázovaniu nádorových buniek, a to ako in vitro, tak in vivo.
Klinické štúdie ukázali, že nadmerná expresia CTGF významne koreluje s lymfatických uzlín metastáz a zlou prognózou u pacientov s rakovinou žalúdka [23, 24]. Avšak presná úloha CTGF v karcinómu žalúdka je stále neznámy. V tejto štúdii sme zistili CTGF expresiu v karcinómu žalúdka tkanivách. Zistili sme, že CTGF bol nadmerne vystavený u karcinómu žalúdka, a jeho expresia bola spojená s agresívnym správaním karcinómu žalúdka. Potom sme použili siRNA technológiu porazený endogénnej CTGF expresiu v rakovinových bunkách žalúdka. Preukázali sme, že zníženie expresie CTGF inhiboval rast a inváziu karcinómu žalúdka in vitro a oslabené peritoneálnej šírenie in vivo. Naša štúdia výrazne zdôrazňuje význam CTGF v raste a invázie karcinómu žalúdka, a môžu poskytovať terapeutický cieľ pri karcinóme žalúdka.
Materiály a metódy
reagencie
dimetyl-sulfoxid (DMSO) a trypsín boli získané od sigma (St. Louis, MO, USA). DMEM, streptomycín a ďalšieho spotrebného materiálu bunkové kultúry boli od Gibco BRL (Grand Island, NY, USA). Fetálny hovädzie sérum bolo od Hyclone (Logan, UT, USA). MTT [3- (4, 5-dimetyl-thiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltrazolium bromid] bol získaný od firmy Fluka (Ronkonkoma, NY, USA). CTGF, cyklin D1, matrix metaloproteinázy (MMP) -2, MMP-3, MMP-9 a GAPDH primárnej protilátka, rovnako ako druhá protilátka Rodamín (TRITC) konjugovaným AffiniPure kozí anti-myší IgG boli získané od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). CTGF ELISA kit bol zakúpený od R &D (Minneapolis, MN, USA). TRIzolu a Lipofectamine 2000 boli zakúpené od Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). SYBR @ Primescript ™ RT-PCR kit bol od Takara Biotechnology, Japonsko.
Vzorky tkanív a imunohistochemické farbenie
vzoriek nádorových boli získané od 110 pacientov s rakovinou žalúdka, ktorí podstúpili operáciu na oddelenie chirurgické onkológie, najprv pridružený Hospital of China lekárskej univerzity v období 2003-2005. Všetci pacienti podstúpili gastrctomy, a boli k dispozícii ich klinické a patologické dát. Normálny žalúdočné tkaniva boli odobraté z krytej distálnej resekovanou rozpätie vzoriek s rakovinou žalúdka. Všetky chirurgické vzorky boli skúmané skúsenými patológov a distálnej resekováno marža predstavovala tumor-free. Čerstvé tkanivá boli narezané na malé kúsky, snap-zmrazí v kvapalnom dusíku ihneď, a skladované pri -80 ° C až do extrakcie proteínu. Protokol štúdie bola prerokovaná a schválená etickou komisiou Číny lekárskej univerzity. Apartmán V imunohistochemického farbenia, 4 um histologické rezy boli zbavené parafínu sa xylénom a rehydratovaný cez odstupňovanou radom alkoholu. Rezy sa potom varí po dobu 10 minút v 0,01 M citrátovom pufri a endogénne peroxidáza bola blokovaná inkubáciou v 0,3% H 2 O 2 v metanole po dobu 30 minút. Nešpecifická väzba bola blokovaná inkubáciou sklíčka s normálnym kozím sére počas 30 minút pri teplote miestnosti. Rezy boli inkubované cez noc pri 4 ° C s 1:50 riedením CTGF primárnej protilátky. Rezy boli vystavené biotínom značenej sekundárnej protilátky po dobu 1 hodiny, do reakčného systému streptavidin-peroxidáza a vyvinutá s DAB- H 2 O 2. Farbenie sa hodnotila na nasledujúce stupnice: 0, žiadna farbenie; 1+, minimálna farbenie; 2+, mierne až silné farbenie v najmenej 20% buniek; 3+, silné farbenie aspoň 50% buniek. Skrine s 0 alebo 1+ farbenie boli klasifikované ako negatívne, a prípady s 2+ alebo 3+ farbenie boli klasifikované ako pozitívne.
Bunkové kultúre
rakovina žalúdka u bunkových línií, MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 a MGC803 boli získané z Ústavu bunkovej biológie, China Medical University v Číne. Boli kultivované v DMEM s obsahom 10% fetálneho séra hovädzieho dobytka, 100 U /ml penicilínu, 100 ug /ml streptomycínu pri 37 ° C vo zvlhčenej atmosfére 5% CO 2. Bunky boli vytlačené za použitia 0,25% trypsínu a 0,02 mol /l EDTA v PBS pre subkultúry.
Konštrukcia CTGF knockdown stabilné bunkové línie
Dve malé interferujúce RNA (siRNA), oligonukleotidy boli syntetizované na cieľovú dva rôzne regióny vo CTGF cDNA: GTGCATCCGTACTCCCAAA (PSC 1) a GCTAAATTCTGTGGAGTAT (PSC2). Boli klonované do expresného vektora siRNA pGCsilencer ™ U6.Neo.GFP. Nešpecifická siRNA bola použitá ako negatívna kontrola (PSNC). Sírne expresné plazmidy boli transfekovány do buniek použitím Lipofectamine SGC7901 2000. Bunky boli podrobené skríningu pomocou G418 (800 ug /ml), a kolónie sa odoberú po 3 týždňoch, stanovenú pomocou RT-qPCR a Western blot. Bunky transfekované PSC 1, PSC2 alebo PSNC boli označené PSC 1 buniek, buniek alebo PSC2 PSNC buniek, v danom poradí.
Real-Time kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie (RT-qPCR)
Celková RNA bola izolovaná z bunkových peliet za použitia TRIzolu činidla. Celková RNA (1 ug) bol premenený na cDNA pomocou RT (reverznej transkriptázy) reakcie kit. PCR v reálnom čase bola vykonaná za použitia Mx3000P real-time PCR systému podľa inštrukcií výrobcu a SYBR ® Premix ExTaq ako DNA špecifického fluorescenčného farbiva. PCR bola vykonávaná po dobu 40 cyklov 95 ° C počas 5 sekúnd a 60 ° C počas 40 s. Sekvencie primérov sú uvedené v tabuľke 1. Prah cyklus (Ct) bol získaný a relatívne množstvo, boli stanovené pre každú vzorku normalizované na GAPDH. Vyjadrenie mRNA boli vypočítané metódou ΔΔCt [25] .Table jeden primer Sekvencia
Gene
Primer Sekvencia (5'-3 ') vpred a vzad
Product (bp)

CTGF
CTTGCGAAGCTGACCTGGAA
AAAGCTCAAACTTGATAGGCTTGGA
90
MMP-2
ATGACATCAAGGGCATTCAGGAG
TCTGAGCGATGCCATCAAATACA
135
MMP-3
GGGTGAGGACACCAGCATGA
CAGAGTGTCGGAGTCCAGCTTC
178
MMP-9
TCCCAGACCTGGGCAGATTC
GCAAAGGCGTCGTCAATCAC
124
Cyclin D1
GATGCCAACCTCCTCAACGAC
CTCCTCGCACTTCTGTTCCTC
171
GAPDH
GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
TGGTGAAGACGCCAGTGGA
138
Analýza Western blot
tkanív alebo buniek boli lyžovanie v RIPA pufri s prídavkom zmesi inhibítora proteázy po dobu 30 minút pri teplote 4 ° C. Fragmenty buniek sa potom podrobí pôsobeniu ultrazvuku a krátko centrifugován (14000 g pri 4 ° C) po dobu 15 minút pre odstránenie nerozpustných materiálov. Rovnaká množstvo proteínu, boli oddelené pomocou SDS-PAGE a prenesené na PVDF membránu. Membrány boli blokované 5% netučného sušeného mlieka, a potom inkubované s prvou protilátkou a následne s chrenovou peroxidázou konjugovanou sekundárnou protilátkou. Proteínové pásy boli vizualizované metódou chemiluminiscenčná ECL.
Imunofluorescenčný a konfokálna zobrazovanie
bunky na Lab-Tek pre tkanivové kultúry komory sklíčka boli fixované v chladnom 100% metanolu počas 10 minút, a potom blokované s normálnym kozím sére po dobu 30 minút , Bunky boli inkubované s primárnou protilátkou cez noc pri 4 ° C, premyté 3 krát v PBS (PBT s 1 ‰ Triton X-100), a potom inkubované s druhou protilátkou konjugovanou s rodamínové. DNA farbivá DAPI bola použitá na farbenie DNA. Bunky boli zobrazené na Leica SP2AOBS konfokálního mikroskopu.
Upravené médium (CM) zber a enzyme-linked immunoassay (ELISA) Sims 3 x 10 5 Bunky boli nasadené na 100 mm tkanivovej kultivačnej misky s DMEM obsahujúcim 10 % fetálneho hovädzieho séra po dobu 2 dní. Potom boli bunky dvakrát premyté PBS a inkubované s 5 ml DMEM bez séra. 48 hodín neskôr sa upravené médium sa zachytí a odstreďuje pri 2000 g počas 5 minút, prešiel cez filtre (veľkosť pórov 0,45 um,) a skladované pri -80 ° C až do použitia.
Hladiny CTGF v kondicionovanie médiu z žalúdočné rakovina bunkové línie boli merané s použitím ľudského súpravy Quantikine ELISA podľa inštrukcií výrobcu. proliferácie
MTT
schopnosť proliferácie buniek bola hodnotená pomocou MTT [3- (4, 5-dimetyl-thiazol-2-yl) -2 , 5-diphenyltrazolium bromid] testu. Približne 5 x 10 3 bunky boli vrúbľovať do 96-jamkové kultivačné doštičky a kultivované v DMEM voľnom séra po dobu 24, 48, 72, a 96 hodinách, v danom poradí. Potom boli bunky inkubované s 20 ul MTT (10 mg /ml) počas 4 hodín pri teplote 37 ° Candy 200 ul DMSO bolo Pipetovanie do rozpustenia formazánu po dobu 20 minút pri teplote miestnosti. Optická hustota (OD) bola stanovená za použitia spektrofotometra (Bio-Rad) pri vlnovej dĺžke 570 nm.
Test tvorby kolónií
5 x 10 2 bunky suspendované v 2 ml 0,3% agarózy DMEM obsahujúcim 10% fetálne hovädzie sérum boli nanesené na 6-jamkové doštičky v hornej časti existujúcich 0,6% agaróza dno s rovnakým médiom. Doštičky boli inkubované pri teplote 37 ° C v 5% CO 2 inkubátora. Po troch týždňoch, bunkových kolónií > 0,1 mm v priemere sa počítali na základe mikroskopického poľa.
Cell invázie test
Invázia bola stanovená testom invázia komory. Bunky (2 x 10 4) boli vrúbľovať do hornej komory 24-jamkové Matrigelu potiahnuté mikroporézny membránový filter s 8 um pórov a spodná komora bola naplnená 0,5 ml DMEM s 10% fetálnym hovädzím sérom ako chemostatický. Po inkubácii po dobu 24 hodín, non-napádať bunky (horná komora) boli jemne odstrániť pomocou vatovej tyčinky hrotom a invázii buniek (dolná komora) boli odstránené za použitia metanolu a zafarbené trypánovej modrej. Invazívne schopnosť bola určená počtom prenikajúcich buniek pod mikroskopom pri 200 x zväčšení na 10 náhodných polí v každej jamky.
Migračného testu komory
Metóda in vitro migrácie testu bolo za použitia non-Matrigelu potiahnuté 24-jamkové Boyden komory (8 um, Millipore). Bunky (2 x 10 4) boli vrúbľovať do vložiek suspendované v 0,2 ml média DMEM bez séra. Non-migrujúci bunky boli odstránené z hornej komory filtra po inkubácii po dobu 24 hodín. Migrované bunky boli zafarbené a kvantifikované na základe postupu, ako je popísané vyššie. Trojmo testy boli vykonávané pre každú skupinu buniek v invázie a migračné testy a výsledky sú vyjadrené ako priemer ± SD.
Želatína zymografie
MMP-2 a MMP-9 aktivita bola stanovená želatína zymografií, ako bolo opísané skôr [ ,,,0],26]. Stručne povedané, po centrifugáciu bol supernatant oddelený a koncentrácia proteínu stanovená; rovnaké množstvo proteínu, pridané vzorkového pufra (Tris-HCl 1 M, pH 6,8, dodecyl sulfát sodný (SDS), 2%, glycerol 10%) boli nanesené na 7,5% SDS-polyakrylamidovom gélu, ktorý obsahuje 1 mg /ml želatíny. Po elektroforéze SDS bol odstránený z gélu dvakrát premyje 2,5% TritonX-100 po dobu 1 hodiny. Po krátkom opláchnutí sa gél inkubuje pri teplote 37 ° C počas 18 hodín v pufri, pH 7,6, obsahujúci 100 mM Tris-HCl, 10 mM chloridu vápenatého 2, 20 mM NaCl. Gél bol farbený with1% Coomassie Brilliant Blue R250 po dobu 2 hodín a potom sa spracuje s roztokom odfarbenie (40% metanol, 10% kyselina octová, 50% destilovanej vody). Proteolytické aktivita bola detekovaná ako jasné pásy proti pozadia škvrnu nestrávené substrátu v gélu na.
Štúdiu so zvieratami peritoneálnej implantácia
Tento experiment bol vykonaný v súlade s pokynom vydaným štátom Food and Drug Administration (SFDA Číny ). Zvieratá boli chované a starať sa o ne v súlade s pokynmi uvedenými vedeckej rady Národného republiky Číny.
Balb /c nahých myší, 35-40 dní staré a hmotnosti 20-22 g, boli dodané Shanghai SLAC Laboratory animal Limited Company. Myši boli udržiavané v sterilných podmienkach a kŕmené sterilné myši stravu a vodu. Zvieratá sa anestetizují inhaláciou isoflurance. PSC 1, PSC2, PSNC a SGC7901 bunky (1 x 10 7 buniek) sa suspendujú v 0,5 ml DMEM a naočkujú sa do brušnej dutiny testovaných myší. Myši boli usmrtené o šesť týždňov neskôr, a akékoľvek šírené uzlíky prítomné na tenké bránice boli vyhodnotené.
Štatistická analýza
všetky hodnoty v texte a údaje sú uvedené ako priemer ± SD. Celková miera prežitia boli stanovené s použitím Kaplan-Meierov odhad, udalosť je definovaná ako úmrtie na rakovinu v korelácii príčiny. Log-rank test bol použitý na identifikáciu rozdielov medzi krivkami prežitia skupín rôznych pacientov. V jednorozmerné analýze, 2-sledoval χ 2 testy pre kategorické premenné a 2-sledoval t test pre kontinuálne premenné boli použité na štatistické porovnanie. Hodnoty p Hotel < 0,05 boli vzatí do ukazujú významný rozdiel medzi prostriedkami.
Výsledky
CTGF je nadmerne exprimovaný u karcinómov žalúdka a koreluje s klinicko-rysy rakoviny žalúdka u pacientov
Zistili sme expresiu CTGF v žalúdočnej rakovinové tkanive a uzavreté distálnej normálneho tkaniva , Obrázok 1A je znázornené CTGF expresiu v piatich náhodne vybral pacientov. Zvýšené hladiny CTGF proteínu, boli nájdené v žalúdku človeka rakovinové tkanive v porovnaní s normálnou tkanív párovými pacientov. To bolo tiež potvrdené imunohistochemickým farbením (obrázok 1B). Okrem toho, aby sa ďalej skúmať koreláciu medzi expresiou CTGF a klinicko-funkcií, 110 vzoriek boli použité pre vyšetrenie s Imunohistochemické farbenia. Štatistická analýza odhalila pozitívna CTGF expresie bola významne spojená s histologického stupňa, lymfatických uzlín a peritoneálnej šírenie v porovnaní s tými u pacientov s negatívnym CTGF expresiu (tabuľka 2). Pozitívne CTGF expresia bola detekovaná častejšie v prípadoch lymfatických uzlinách metastázy (p = 0,012). Hladiny expresie CTGF významne zvýšili v nediferencovaných karcinómov žalúdka v porovnaní s diferencovanými karcinómov žalúdka (p = 0,039). A expresie CTGF proteínu bola významne koreluje s vývojom peritoneálnej šírenie rakoviny žalúdka (p = 0,011). Výpočet dĺžky trvania prežitia 110 zúčastnených pacientov metódou Kaplan-Meierovej bolo zistené, že pacienti, ktorí uvádzaný CTGF-pozitívnych nádorov preukázala kratší prežívanie v porovnaní s pacientmi, ktorí trpeli CTGF-negatívne nádory (Obrázok 1C, p 0,001 ). Obrázok 1 Nadmerná expresia CTGF v karcinómu žalúdka s horšou prognózou. A. Western blot analýza preukázala expresiu CTGF v žalúdočných rakovinových tkanivách a uzavreté distálnej normálnych tkanivách z piatich náhodne vybraných pacientov s karcinómom žalúdka. B. Imunohistochémia výsledky CTGF expresie v párových vzoriek žalúdočnej rakovina tkaniva. C. Kaplen-Meir krivky prežitie 110 pacientov s rakovinou žalúdka, zoskupené podľa CTGF expresiu.
Tabuľka 2 pridružení medzi CTGF expresiu a patologickým charakteristikám pacientov s rakovinou žalúdka (n = 110)

CTGF expresiu


Negatívne
pozitívnu
P hodnotu

rodovej rovnosti
Muž
33
34
0,779
Žena
20
23
vek (roky)
≤ 65
35
40
0,642 Hotel > 65
18
17
veľkosť tumoru (cm) Hotel < 5
26
25
0,585
≥ 5
27
32
Tumor umiestnenie
nižšia
42
37
0,413
Stredná
5
8
Horné Sims 3
6
Celý Sims 3
6
Histologické stupeň
rozlíšené
26
17
0,039 *
nediferencovaných
27
40
Lauren stupeň
Črevné
28
21
0,108
Difúzna
25
36
lymfatických uzlín
Negatívne
23
12
0,012 *
pozitívny
30 45
TNM štádium
Aj
11
8
0,080
II
15
9
III
20
22
IV
7
18
pečeňové metastázy
negatívne
50
55
0,588
pozitívny Sims 3
2
peritoneálnej šírenie
negatívny
50
44
0,011 *
pozitívny Sims 3
13
* P < 0,05; CTGF, spojivového tkaniva rastového faktora.
Expresia CTGF v ľudských nádorových bunkových línií žalúdočné a siRNA sprostredkovanú ticha
Najprv sme skúmali CTGF expresiu v šiestich žalúdočných nádorových bunkových línií (MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 a MGC803) pomocou Western blot. CTGF bol detekovaný vo všetkých hodnotených bunkových línií, a s SGC7901 bunky exprimujúce najvyššej úrovne (obrázok 2A). Z tohto dôvodu, SGC7901 bunky boli vybrané ako model pre ďalšie štúdie funkcie. Vzhľadom k tomu, biologicky aktívne CTGF je ako vylučované a vyjadrí sa v cytoplazme [8, 27], tiež na meranie hladiny vylučovaného CTGF v podmienečnom médiách týchto žalúdočných nádorových bunkových línií pomocou ELISA, ktorý sa zhodoval s úrovňou CTGF v cytoplazme každej bunkové línie (obrázok 2B). Obrázok 2 Expresia CTGF v žalúdočných nádorových bunkových línií a Vyradenie CTGF pomocou siRNA. A. Western blot, znázorňujúci expresiu CTGF v 6 žalúdočných nádorových bunkových línií. GAPDH slúžila ako kontrola proteín zaťaženie. B. CTGF v upravenom médiu 6 žalúdočných nádorových bunkových línií a stabilných transfekciou buniek bolo analyzovaných pomocou ELISA. Výsledky sú vyjadrené ako pg /ml /1 x 106cells (priemer ± SD, n = 4). blot analýza C. Western proteínového expresie CTGF v SGC7901, PSNC a CTGF knockdown stabilné bunkové línie (PSC 1 a PSC2). D. Imunofluorescenčný analýzy expresie CTGF. E. RT-qPCR ukazuje hladiny CTGF mRNA v SGC7901, PSNC a CTGF porazený stabilné bunkové línie (PSC 1 a PSC2). Dáta sú vyjadrené ako násobné zmeny vzhľadom ku kontrolným (kontrola je SGC7901). Hodnoty sú uvedené ako priemer ± SD z troch pokusov. * P < 0,05 v porovnaní s kontrolou.
Pre štúdium funkcie CTGF v bunkách SGC7901 je CTGF knockdown stabilný bunkové línie boli použité na analýzu tlmiaci efekt. Ako je znázornené na obrázku 2B, úroveň vylučovaného CTGF v klimatizovanom prostredí bola v transfektovaných bunkách siRNA stabilné významne znížila v porovnaní s kontrolou. Western blot a imunofluorescenčné farbenie ukázalo, že expresia CTGF proteínu v cytoplazme v CTGF porazený stabilných bunkových línií (Obr 2C, D), sa výrazne znížil. Okrem toho, expresia CTGF mRNA bola tiež významne znížila v CTGF knockdown stabilné bunkové línie (obrázok 2E).
Vyradenie CTGF expresiu inhibuje rast buniek karcinómu žalúdka
testu tvorby kolónií bola použitá pre hodnotenie rastu z buniek, v ktorých bol umlčaný CTGF. Ako je znázornené na obrázku 3A, CTGF knockdown stabilné bunky (PSC 1 a PSC2) vytvorený podstatne menej kolónií na mäkkom agare a v porovnaní s SGC7901 PSNC bunky (83 ± 10, 90 ± 15 oproti 30 ± 7 a 20 ± 5, v danom poradí). Pre ďalšie testovanie negatívny vplyv CTGF Knockdown na žalúdočné rast nádorových buniek, MTT test bol vykonaný a rastové krivky boli vytvorené (obrázok 3B). Ako je znázornené krivkami, ako PSC 1 a PSC2 bunky množili pomalší ako PSNC buniek a SGC7901 buniek v priebehu prvých 96 hodín po tom, čo boli bunky umiestnené. Významné zníženie tvorby kolónií a rastu CTGF umlčených buniek navrhol potlačenie CTGF môže negatívne regulovať žalúdočné rast rakovinových buniek. RT-qPCR ukázali, že mRNA z bunkového cyklu súvisiace proteín cyklin D1 boli regulované dole v dvoch CTGF porazený stabilných bunkových línií v porovnaní s PSNC a SGC7901 (obrázok 3C). V súlade s týmto výsledkom sme zaznamenali výrazné zníženie expresie cyklín D1 proteínu v CTGF Knockdown buniek PSC 1 a PSC2 (3D obrázok). Je zaujímavé, že liečba upraveného média z SGC7901 ktoré vylučovaného veľké množstvo CTGF bol schopný zachrániť cyklin D1 down-reguláciu a obnoviť bunkovú proliferáciu v CTGF knockdown stabilných buniek. Tieto údaje naznačujú, že supresia CTGF by mohli negatívne regulovať žalúdočné rast rakovinových buniek a znižujú cyklin D1 výraz. Obrázok 3 Vyradenie CTGF expresiu inhibuje rast buniek karcinómu žalúdka. Test formácie A. Colony. B. MTT proliferačnú test. C. Vyradenie CTGF dole regulovať hladinu mRNA cyklin D1. D. Vyradenie CTGF dole regulovať hladiny proteínu cyklín D1. PSC 1 /PSC2 + CM z SGC7901: PSC 1 alebo PSC2 bunky boli inkubované s upraveného média (CM) zo SGC7901. Všetky výsledky boli reprodukovateľné v troch nezávislých experimentoch. * P < 0,05 v porovnaní s kontrolou (kontrola je SGC7901).
Vyradenie CTGF expresiu inhibuje migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka
migráciu a inváziu buniek sú kritické procesy v nádorových metastáz. Skúmali sme migráciu buniek non-Matrigel potiahnuté Boyden komory a invázie buniek pomocou testu invázie komory Matrigelem povlakom, v danom poradí. V testoch migrácie (Obrázok 4A), migračné Sadzby PSC 1 a PSC2 bunky boli výrazne v porovnaní s kontrolou (0,05 P <) sa znížil. Ako je znázornené na obrázku 4B, CTGF knockdown tiež výrazne znižuje vlastnosti, invázia buniek v porovnaní s kontrolou. Invázia buniek rýchlosti PSC 1 a PSC2 bunky boli znížené o 61,4% a 55,8%, v danom poradí. RT-qPCR a Western blot ukázala, že MMP-2 a MMP-9 boli dole upravené v dvoch stabilných klonov v porovnaní s kontrolnými bunkami (obrázok 4C, D). Na rozdiel od MMP-3 významne nezmenilo a to ako v mRNA a nízka hladina bielkovín. Okrem toho, analýza ukázala zymografie činnosť ako MMP-2 a MMP-9 v transfektovaných bunkách siRNA stabilné boli výrazne nižšie ako u kontrolných buniek (obrázok 4E). Je zaujímavé, že liečba upraveného média z SGC7901 ktoré vylučovaného veľké množstvo CTGF indukované opätovné expresiu MMP-2 a MMP-9 a obnovil migráciu a inváziu CTGF knockdown stabilných buniek. Tieto výsledky naznačujú, že porazený CTGF expresie znižuje migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka a zníženie expresie MMP-2 a MMP-9. Obrázok 4 Vyradenie CTGF expresiu inhibuje migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka. A. Migrácia buniek test. B. Cell invázie test. Migrácia a invázia bunky boli fixované a zafarbené a reprezentatívne polia boli vyfotografované. Pre kvantifikáciu boli bunky spočítané v 10 náhodných polí pod svetelným mikroskopom (x 200). Trojmo testy boli vykonávané pre každú skupinu buniek v invázie a migračné testy a výsledky sú vyjadrené ako priemer ± SD. C. RT-qPCR bola vykonaná pre analýzu expresie mRNA MMP-2, MMP-3 a MMP-9 v CTGF porazený stabilné bunkové línie a kontrolné bunky. Pruhy predstavujú priemer ± SD z troch pokusov. D. boli zistené hladiny proteínovej MMP-2, MMP-3 a MMP-9 pomocou Western Blot. GAPDH slúžila ako kontrola proteín zaťaženie. Analýza zymografie E. Želatína pre aktivity MMP-2 a MMP-9. PSC 1 /PSC2 + CM z SGC7901: PSC 1 alebo PSC2 bunky boli inkubované s upraveného média (CM) zo SGC7901 * P <. 0,05 v porovnaní s kontrolou (kontrola je SGC7901).
Downregulace inhibuje CTGF peritoneálnej šírenie rakoviny žalúdka in vivo
K preskúmaniu účinkov CTGF na peritoneálnej šírenie buniek karcinómu žalúdka in vivo sme vrúbľovať rôzne bunky do nahých myší. SGC7901 bunky, riadenie stabilné bunkové línie (PSNC), a CTGF knockdown stabilné bunky (PSC 1 a PSC2) boli injikované do štyroch skupín po nahých myší. V dôsledku toho je takejto liečby, merateľný potlačenie peritoneálnej šírenie u myší s injekciou CTGF porazený stabilných buniek, v porovnaní s tými, ktoré sa injekčne SGC7901 bunky alebo bunky PSNC bolo uvedené (Obrázok 5A). Kvantitatívne, 117 ± 20 šírené uzliny boli zaznamenané u testovaných myší očkovaných SGC7901 bunkami a 137 ± 26 šírených uzliny boli zaznamenané u myší očkovaných PSNC buniek. Na rozdiel od toho významné menej diseminovanej uzliny boli schopné byť pozorované u myší injektovaných CTGF porazený stabilné bunky (Obrázok 5B). Obrázok 5 Vyradenie CTGF inhibuje rakovina žalúdka SGC7901 xenoštěpem peritoneálnej šírenia. SGC7901, PSNC a CTGF knockdown stabilné bunkové línie (PSC 1 a PSC2) boli injikované intraperitoneálne, ako je popísané v časti "Materiál a metódy". 6 týždňov neskôr boli myši usmrtené, fotografoval, členitý a všetky uzlíka šírená prítomné na tenké bránice sa počítali. A. Fotografie u nahých myší s peritoneálnej šírenie z každej skupiny. B. šírené uzliny boli vyhodnotené. Každý stĺpec predstavuje strednú hodnotu ± SD (n = 5 pre každú skupinu). * P < 0,05 as
v porovnaní s kontrolou (kontrola je SGC7901). Diskusia
najrozsiahlejší literatúry k dnešnému dňu, pokiaľ ide o CTGF definuje svoju úlohu v hojení rán a fibrotické choroby. V poslednej dobe niekoľko štúdií zapliesť CTGF vo vývoji nádoru a nádorových buniek prežitie [28-30]. Avšak, presná úloha CTGF v progresii nádoru nie je definitívne a funkcie CTGF v nádorových buniek biológii karcinómu žalúdka nie je ešte dôkladne preskúmané. Ak chcete tieto problémy riešiť, sme vyhodnotili CTGF expresiu s ohľadom na možné priamej korelácii s rastom buniek a invázie nádorových buniek žalúdka. Navyše sme ďalej skúmali účinky CTGF na peritoneálnej šírenie buniek karcinómu žalúdka in vivo.
V tejto štúdii, naše výsledky ukazujú, že CTGF bol vysoko exprimovaný v žalúdočných rakovinových tkanivách v porovnaní s spárovaných normálnou žalúdočné tkaniva. Expresie CTGF v nediferencovaných karcinómu žalúdka bol podstatne vyšší ako v diferencovanom karcinómu žalúdka. CTGF expresiu v nádorovom tkanive bola spojená s lymfatických uzlín a peritoneálnej šírenie. Okrem toho, u pacientov s pozitívnym CTGF expresiu mal významne nižší kumulatívny pooperačné 5 ročné prežitie (22,9%) ako tie, ktoré sa záporným CTGF expresiu (48,1%, obrázok 1C). Tieto výsledky naznačujú, že CTGF môžu byť zapojené do progresie a metastáz karcinómu žalúdka. Okrem toho, CTGF môže byť užitočným prognostický marker.
Niekoľko nedávnych štúdií ukázala, že CTGF reguláciu bunkového rastu u rakoviny pažeráka bunkách a pankreatických nádorových buniek [20, 30]. Avšak, málo je známe o vplyve CTGF expresiu na bunkový rast rakovinových buniek žalúdka. Naše výsledky ukazujú, že potlačenie CTGF viedla k inhibícii bunkovej proliferácie a klonogenní rast. Zmeny bunkového rastu môžu byť kľúčovými faktormi regulujúca vývoj rakoviny [31].

• Vyšší počet miest fosforylácie Helicobacter pylori ČAGA EPIYA C zvyšuje riziko rakoviny žalúdka, ale nie dvanástnikové ulcer
• počet kópií DNA profily žalúdočných prekurzorov rakoviny lézií