Expression av p53, inducerbart kväveoxidsyntas och vascular endothelial growth factor i mag precancerous och cancerous lesions: korrelation med kliniska

Expression av p53, inducerbart kväveoxidsyntas och vaskulär endotelial tillväxtfaktor i gastriska precancerösa och cancerösa lesioner: korrelation med kliniska Bild Sammanfattning
Bakgrund
tillväxt och metastas av tumörer beror på utvecklingen av en tillräcklig blodtillförsel via angiogenes. Nyligen genomförda studier tyder på att det inducerbara kväveoxidsyntas (iNOS), vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) och tumörundertryckaren p53 är grundläggande play-markörer av den angiogena processen. Överexpression av iNOS och VEGF har visats inducera angiogenes i tumörer. P53 trycker angiogenes genom nedreglering VEGF och iNOS. Korrelationen av uttryck av p53, VEGF och iNOS och kliniska funktioner i gastric cancer, men har inte väl karakteriserade.
Metoder
uttryck av p53, iNOS och VEGF i mag precancerous och cancerous lesions och dess relation med de kliniska egenskaper bestämdes med immunohistokemi (avidin-biotin-peroxidas-komplexmetod) på 55 slumpvis utvalda GC patienter och 60 symptomfria patienter från mass undersökning i hög incidens område för GC i Henan, norra Kina.
Resultat
de positiva immunostainig priser för p53, iNOS och VEGF i mag carcinom var 51%, 44% och 51%, respektive, och korrelerade väl med TNM steg, men visade inte signifikant skillnad mellan grupperna med olika grader av magväggen invasion djup av GC. En positiv immunfärgning reaktion för iNOS proteinet signifikant korrelerad med lymfkörtelmetastaser (p = 0,019; Spearman korrelationskoefficient). P53 protein ackumulering var högre i dåligt differentierade magcancer än väl differentierade en. I gastric biopsier, var ingen positiv immunosatining observerats för p53, iNOS och VEGF i histologiskt normal vävnad och kronisk ytlig gastrit (CSG). Men p53 var iNOS och VEGF positiv immunfärgning observerades i vävnader med olika svårighetsgrader av lesioner av kronisk atrofisk gastrit (CAG), intestinal metaplasi (IM) och dysplasi (Dys), och de positiva priser ökade med lesionen progression från CAG till IM till DYS. En hög tillfällighet positiv och negativ immunfärgning hastighet för p53, iNOS och VEGF observerades både i biopsiprov med CAG, IM och DYS från symptomfria patienter och magcancer vävnad från GC patienterna.
Slutsatser
föreliggande resultat indikerade att p53-protein ackumulering och ökat uttryck av iNOS och VEGF kan vara ansvarig för gastric carcinogenesis och tumör aggressivitet för magcancer.
gastric adenokarcinom (GC) är en av de vanligaste maligna sjukdomarna i Kina. Även GC har minskat i sin dödlighet är det fortfarande den ledande orsaken till cancerrelaterade dödsfall i detta land (Parkin et al, 1992;. Världshälsoorganisationen, 1994, Nomura A, 1996). Gastric cancer anses vara en flerstegs progressiv process. Den tidig indikator för ämnet predisponerade för GC är onormal hyperproliferation av gastric epitelceller, såsom kronisk atrofisk gastrit (CAG), DYS och intestinal metaplasi (IM), som har ansetts som precancerösa lesioner i GC (Du et al., 1993; Correa P, 1992). Dock är mycket begränsad information om mekanismen för gastric cancer.
Tillväxt och metastas av tumörer är beroende av utvecklingen av en tillräcklig blodtillförsel via angiogenes. Nyligen genomförda studier tyder på att det inducerbara kväveoxidsyntas (iNOS), vaskulär endotel tillväxtfaktor (VEGF) och tumör suppressor p53 är grundläggande play-skaparna av den angiogena processen (Ambs et al, 1994;.. Jekins et al, 1995; Forrester et al, 1996;.. Chiarugi et al, 1998). iNOS är en av isoformerna av kväveoxidsyntas som katalyserar bildningen av kväveoxid, en regulator av vaskulär permeabilitet. VEGF är ett dimert glykoprotein och har specifik mitogen aktivitet för endotelceller. Överuttryck av iNOS och VEGF kunde framkalla angiogenes i tumörer. P53 trycker angiogenes genom nedreglering VEGF och iNOS. Mutant p53 potentierar proteinkinas C-induktion av VEGF-uttryck (Zhang et al., 2000). I en tumorigenicitet modell med användning av humana fibroblastceller, förlusten av vildtyp-p53 och transfektion av aktiverad ras lett till ökad VEGF-uttryck (Devavrata et al., 1995). Transient transfektion av vildtyp-p53 och av v-src har befunnits utöva motsatta effekter på human VEGF-gen-promotoraktivitet i human glioblastom och transformerade humana fosternjurceller (Devavrata et al., 1995). Emellertid, därför att vildtyp-p53 inte trycka hypoxiinducerad transkription av VEGF-genen i stabilt transfekterade humana kolorektala karcinom och humana hepatoblastom-celler med en inducerbar p53-östrogenreceptorfusionsproteinet expressionssystem (Ambs et al., 1998), det har föreslagits att det finns ett behov av försiktighet i tolkningen p53-funktion på grundval av celler transient överuttryckte detta protein. Icke desto mindre har mutant p53 korrelerats med ökad VEGF-uttryck i humana lungcancer (Ambs et al., 1994), och kolorektal cancer (Ambs et al., 1999) genom immunhistokemisk färgning av kirurgiska prover. Det har rapporterats att dysfunktion av p53 /MDM-2 vägen kan hittas i mer än två tredjedelar av angiosarkom; sålunda påverkar mutant p53 utvecklingen av angiosarkom inte bara genom att påverka tillväxt och apoptos kontroll utan även genom att uppreglera VEGF (Chinrugi et al., 1998). Vi antar att förändringar i p53 kan iNOS och VEGF uttryck bidra till gastric cancer och påverka den kliniska beteendet hos GC via angiogenes. Korrelationen av uttryck av p53, VEGF och iNOS och kliniska funktioner i gastric cancer, men har inte väl karakteriserade.
Att karakterisera förändringar i p53, iNOS och VEGF-produktion i human gastrisk cancer, var den aktuella studien åtagit sig att bestämma proteinnivå av p53, iNOS och VEGF i normala vävnader och vävnader med olika svårighetsgrader av lesioner av CSG, CAG, DYS, IM och GC med och utan lymfkörtel metastas från kirurgiskt opererande human GC och gastriska biopsier från symptomfria patienter . Ämnena var från Linzhou och närliggande län Huixian i provinsen Henan, hög förekomst område för GC i norra Kina.
Material och metoder
Patienter
aktuella undersökningen ingår 55 slumpvis utvalda GC patienter och 60 symtomfri fria ämnen från mass undersökning i hög incidens område för GC. Femtiofem GC patienter utfördes magcancer kirurgi vid Linzhou Folkets sjukhus (n = 26) och den andra Anslutna sjukhuset i Henan Medical University (n = 29) från 1996 till 1998. Före operation, ingen av patienterna fick någon form av kemiska eller strålningsterapi. Medianåldern för patienterna var 61 år (30 ~ 77 år). Cancer prover klassificeras utifrån TNM som scen T1 (19 patienter, 35%), T2 (14 patienter, 25%), T3 (12 patienter, 22%) och T4 (10 patienter, 18%). Tumörerna histologiskt klassificeras som väl differentierade (15 patienter, 27%), måttlig differentierade (14 patienter, 25%) och dåligt differentierade (26 patienter, 47%). Av de 55 patienter, 35 inträffade lokala lymfkörtelmetastaser (64%). Gastric biopsier togs från 60 symptomfria patienter som frivilligt att delta i en rutin endoskopisk screening för esofagus och magcancer i Huixian, Kina. Inget val process var inblandad. Av de 60 försökspersoner undersöktes fanns 35 män och 25 kvinnor. Medianåldern för patienterna var 59 år (28 ~ 70 år). De biopsier togs från vardera pylorus i magsäcken från varje försöksperson.
Tissue bearbetning
Alla kirurgiskt resekterade exemplar och biopsiprov fixerades med 10% neutral formalin, inbäddade med paraffin och seriesnittades vid 5 pm. Sektionerna monterades på de histostick belagda objektglas. Fyra eller fem närliggande band uppsamlades för histopatologisk analys (hematoxylin och eosin-färgning) och för immunhistokemisk färgning.
Histopatologisk analys
Histopatologisk diagnos för gastric epitel gjordes enligt cellulära morfologiska förändringar och vävnadsarkitektur som använder tidigare fastställda kriterier (Wang , et al, 1994;.. Du, et al, 1993). I korthet, CSG: en inflammation manifesteras genom mild lymfocyter och plasma-cellinfiltration; CAG: körtel morfologi försvunnit helt eller delvis frånvarande i slemhinnan och ersätts av bindväv, inter-körtel utrymme främst infiltrerats av plasmaceller och lymfocyter; DYS: kännetecknas av kärn atypia med eller utan arkitektoniska avvikelser i mag epitel, men utan invasion; IM: bekräftades genom närvaron av bägarceller i magslemhinnan; adenokarcinom (AC):. invasion av neoplastiska gastriska celler genom basalmembranet
Immunohistokemisk färgning
Anti-p53-antikroppen är en monoklonal mus-anti-serum mot p53 av humant ursprung, och känner igen både vildtyp och mutant p53 ( ab-6, Oncogene Science, Manhasset, NY). Anti-iNOS-antikroppen är en monoklonal mus-anti-serum mot den C-terminala domänen av iNOS av humant ursprung (sc-7271, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Anti-VEGF-antikroppen är en polyklonal kanin-anti-serum mot VEGF av humant ursprung och känner igen en aminoterminal epitop som finns i VEGF 121, 165, 189 och 206 (Ab-2, Oncogene Science, Manhasset, NY). Avidin-biotin-peroxidas-komplexmetod användes för immunfärgning av p53, iNOS och VEGF. I korthet, efter awaxning, inaktiverande endogen peroxidasaktivitet och blockering korsreaktivitet med normalt serum (Vectastain Elite Kit, Vector, Burlingame, CA), sektionerna inkuberades över natten vid 4 □ med en utspädd lösning av de primära antikropparna (1: 1000 för p53, 1: 200 för iNOS och 1: 100 för VEGF). Placering av de primära antikropparna uppnåddes genom efterföljande applicering av en biotinylerad anti-primär antikropp, ett avidin-biotin-komplex konjugerat till pepparrotsperoxidas, och diaminobensidin (Vectastain Elite Kit, Vector, Burlingame, CA). Glasen motfärgades med hematoxylin. Negativa kontroller fastställdes genom att ersätta den primära antikroppen med PBS och normal mus eller kaninserum. Kända immunfärgning positiva glas användes som positiva kontroller.
Specifik färgning för varje protein kategoriseras som antingen positiv eller negativ baseras på närvaron av brunfärgfläckar. Mer än 10% av cellerna positivt färgade graderades som positiva. Tydlig färgning för kärnor (p53), cytoplasma och cellmembran (VEGF och iNOS) var kriteriet för en positiv reaktion (Wang et al., 1994). Alla immunfärgning glasen observerades av två patologer (L D Wang och L H Jiao). De glider med olika diagnoser av två patologer lästes igen (mindre än 5%), till avtalad diagnos gjordes.
Statistisk analys
X 2 test användes för andelen prover med positiv fläck . Spearman korrelationstest och linjär tendens testet användes för korrelationen mellan positiva värden och olika svårighetsgrader av lesioner (p < 0,05 ansågs signifikant) katalog Resultat
Histopatologiskt, alla 55 kirurgiskt utskurna gastric prover bekräftades som. adenokarcinom. Av GC patienterna 55, inträffade 11 fall invasionen i under slemhinna, 44 med hela-muskelskiktet. Av de 60 biopsiprover undersökta var 10 diagnostiseras som vanligt, 15 som CSG, 9 som CAG, 16 som IM med CAG, och 10 som DYS (tabell 1) .table en immunoreaktiviteten hos p53, iNOS och VEGF i magsäcken normal epitel och epitel med olika svårighetsgrader av lesioner
vid vid P53
iNOS

VEGF
vid No. prover undersöktes
Nej positiv fläck n (%)
Nej positiv fläck n (%)
Nej av positiv fläck n (%)
Normala
10
0 (0) Review 0 (0) Review 0 (0) Review CSGb
15
0 (0) Review 0 (0) Review 0 (0) katalog Cagc
9
1 (11) Review 0 (0) Review 2 (22) Review IMD
16
3 (19) katalog 2 (13) Review 5 (31) katalog DYSe
10
3 (30) Review 4 (40)
5 (50) Review GCF
55
28 (51) Review 24 (44) Review 28 (50) Review P53: c: fp = 0,02 d :: fp = 0,013; iNOS: c: f p = 0,03 d: f p = 0,015; VEGF: c: f p = 0,014 d: f p = 0,015
positiva immunfärgning för p53 var iNOS och VEGF observerades i mag epitelceller och cancerceller med olika hastigheter i lesioner av CAG, DYS, IM och GC. Men den positiva immunfärgning för p53, iNOS och VEGF observerades inte i normal gastrisk epitelvävnad och CSG. Figur 1, 2 och 3 visar en företrädare för p53, iNOS och VEGF immunofärgning i GC. p53 immunreaktivitet var belägen i kärnor, VEGF och iNOS immunreaktivitet fanns huvudsakligen i cytoplasman och cellmembranet. iNOS immunofärgning bekräftades genom Western blot på en del av iNOS positiva och negativa diabilder (tre bilder för varje), och konsekventa resultat erhölls för iNOS immunohistokemi och Western Blot (data visas ej). Den positiva immunfärgning takten för p53 var mycket låg i CAG, och något ökad i IM och DYS, och ökade signifikant i GC (tabell 1). Liknande resultat observerades i iNOS och VEGF (tabell 1). P53 positiv immunosatining takten i väl differentierade GC var lägre än i dåligt differentierade GC (p = 0,012, tabell 2). iNOS positiv färgning var liknande bland GC med olika grad av differentiering. Även VEGF immunfärgning takten i dåligt differentierade GC var högre än i väl differentierade GC, skillnaden var inte signifikant (tabell 2). Figur 1 Immunfärgning av p53 i gastrisk carcinom. Immunoreaktivitet är beläget i cellkärnor (pilar). 20X
Figur 2 immunfärgning av iNOS i magcancer. Immunreaktivitet ligger huvudsakligen i cytoplasman och cellkärnor membran. 10X
Figur 3 Immunofärgning av VEGF i gastrisk carcinom. Immunoreaktivitet ligger i cytoplasma och cellmembranet. 10X
Tabell 2 Immunoreaktivitet av iNOS, p53 och VEGF i GC och dess korrelation med olika grader av differentiering
vid
P53 *
iNOS
VEGF
Differentiering grad av GC
Nej prover undersöktes
Nej positiv fläck n (%)
Nej positiv fläck n (%)
Nej av positiv fläck n (%)
Väl differentiateda
15
5 (33) Review 7 (47) Review 6 (40) Review Medel-differentiatedb
14
6 (43) Review 5 (36) Review 6 (43) Review dåligt differentiatedc
26
17 (66) Review 12 (46) Review 16 (61) Review * a: cp = 0,012
iNOS positiv immunfärgning hastighet i de fall med djup invasion av GC (genom muskelskikt) var högre än i de med ytliga invasion (inom submucosa), men skillnaden var inte signifikant (Tabell 3). P53 och VEGF immunofärgning var likartad i GC patienter med ytlig och djup invasion.Table 3 immunoreaktiviteten hos p53, iNOS och VEGF och dess korrelation med invasion djup magcancer

vid P53
iNOS
VEGF
Invasion djup GC
Nej av prover Undersökta
No. positiv fläck n (%)
Nej positiv fläck n (%)
Nej positiv fläck n (%)
Inom slemhinna
11
5 (46) Review 3 (27) Review 6 (55) Review muskellagret
44
23 (52) Review 21 (48) Review 22 (50) Review iNOS immunosatining hastigheten i fallen med lymfkörtel metastas var högre än den i de utan lymfkörtel metastas (p = 0,014, tabell 4 ). Det fanns dock ingen skillnad observerades för p53 och VEGF mellan fallen med och utan lymfkörtel metastasis.Table 4 immunoreaktiviteten hos p53, iNOS och VEGF och dess korrelation med lymfkörtelmetastaser av magcancer
vid vid P53
iNOS *
VEGF
Lymfkörtel metastaser

Nej. av prover Undersökta
No. positiv fläck n (%)
Nej positiv fläck n (%)
Nej av positiv fläck n (%)
Ja
35
18 (51) Review 19 (55) Review 21 (60) katalog nr
20
10 (50) Review 5 (25) Review 7 (35) Review * p = 0,014
P53 immunfärgning hastigheten i fallen med TNM grade T1 var lägre än den i de med TNM grade T2, T3 och T4 (T1: T3, p = 0,023; T1: T4, p = 0,012). Liknande resultat observerades i VEGF (T1: T2 och T2: T3, p = 0,015; T1: T4, p = 0,014; T2: T4, p = 0,01, tabell 5). Det fanns dock ingen skillnad för iNOS immunfärgning mellan fallen med olika TNM stages.Table 5 immunoreaktiviteten hos p53, iNOS och VEGF och dess korrelation med kliniska TNM klassificering

vid P53 *
iNOS
VEGF **
TNM iscensätter
Nej prover undersöktes
Nej positiv fläck n (%)
Nej positiv fläck n (%)
Nej av positiv fläck n (%)
T1
19
7 (37) en
7 (37) Review 8 (42) en
T2
14
6 (43) b iPhonen 4 (29) Review 4 (29) b
T3
12
8 (67) c
7 (58) Review 8 ( 67) c
T4
10
7 (70) d
6 (60) Review 8 (80) d
* a: cp = 0,023, a: dp = 0,012; ** A: b och b: c p = 0,015, a: d p = 0,014, b: d p = 0,01 Review, en högre tillfällighet uttryck av p53, iNOS och VEGF i GC observerades. Av de 55 undersökta fallen fanns 20 fall visade positiv färgning för både p53 och iNOS (36%), 23 fall visar negativ färgning för både p53 och iNOS (42%) (p = 0,005, tabell 6), 19 fall visar positiv färgning för både p53 och VEGF (35%) och 18 fall som uppvisar negativa för både p53 och VEGF (33%) (p = 0,01, tabell 7). Sambanden var significant.Table 6 tillfällighet uttryck av p53 och iNOS protein i magcancer
vid p53 (+)
p53 (-)
vid n (%)
n (%)
iNOS (+) Review 20 (36) Review 4 (7)
iNOS (-) Review 8 (15) Review 23 (42) Review X2 = 15,68, p = 0,005
Tabell 7 tillfällighet uttryck av p53 och VEGF-protein i den gastriska karcinom
vid p53 (+)
p53 (-)
vid n (%) Review
n (%)
VEGF (+) Review 19 (35) Review 9 (16) Review VEGF (-) Review 9 (16) Review 18 (33)
X2 = 6,56, p = 0,01
Diskussion Review, en intressant iakttagelse i denna studie var att immunoreaktiviteten av p53, iNOS och VEGF inträffade i ett tidigt skede av gastric cancer. De positiva immunfärgning Cellerna invariably associerad med cell föröka aktivitet. Med skador gått från normal till CSG till CAG till IM till DYS, och GC de positiva immunfärgning priser för p53, iNOS och VEGF ökat betydligt, den ökande tendensen för p53, iNOS och VEGF hade en god linjär korrelation med skador progression. De nuvarande resultaten indikerade att p53-protein anhopning och ökat uttryck av iNOS och VEGF kan vara viktiga molekylära händelser som är involverade i ett tidigt skede av gastric cancer.
En annan intressant iakttagelse var att en hög slump positiv immunfärgning priser för p53 och iNOS (36 %) och p53 och VEGF (35%) observerades (tabell 6 och 7). Detta resultat överensstämde med resultaten i mänskliga lung- och kolonkarcinom (Ambs et al., 1999). Även p53 antikropp som används i denna studie kunde inte skilja vildtyp p53 från mutant p53, har tidigare studier indikerat att p53-proteinet detekteras genom immunohistokemi verkar representativa mest mutant p53. Ackumulering av p53 är en indikator för en förlust av p53-tumörsuppressorfunktion. Både mutationer och protein-proteininteraktioner kan orsaka en p53 ackumulering (Wang, et al., 1994). Med tanke på att p53-protein ackumulering korrelerade med dåligt differentiering och T2, T3 och T4 TNM stadium av GC, drog vi slutsatsen att p53-protein ackumulering i denna studie kan leda till förlust av celltillväxt kontroll och hämning för iNOS och VEGF, möjligen på grund av p53 mutation. Således kan den höga tillfällighet uttrycket av iNOS och VEGF och p53-protein ackumulering vara viktiga händelser för att förbättra gastrisk cancer och dåligt kliniska funktioner och kan vara användbara biomarkörer för att bedöma risken för utveckling av GC. Aktuella studier av japanska GC patienter har visat att ökad expression av VEGF och p53-protein ackumulering är associerade med intratumoral angiogenes (Takeuchi et al, 2000;.. Saito, et al, 1999) och dålig prognos (Skatani, et al. , 2000; Ikeguchi, et al, 2000;.. Maeda, et al, 1998). Rajnkova rapporterade att ökat uttryck av iNOS kan främja magcancer progression genom att tillhandahålla en selektiv tillväxtfördel till tumörceller med icke-fungerande p53. (Rajnkova, et al., 2001)
tredje observationen i denna studie var att ökat uttryck av iNOS och VEGF och p53-protein ackumulering skedde med en hög frekvens i mag biopsiprov med IM. IM, som kan definieras som utbyte av magslemhinnan av körtlar som har histologiska, histokemiskt och fysiologiska egenskaper hos tunntarmen, har varit starkt förknippad med magcancer. Föreliggande resultat visar att IM var en instabil scen med aktiva molekylära förändringar, och ytterligare analyser för att jämföra dessa förändringar med normal tunntarmen kommer ger mer information om betydelsen av IM i gastric cancer. Review Slutligen visade den aktuella studien att positiva immunfärgning andelen iNOS korrelerade väl med GC lymfkörtel metastas, ökat uttryck av VEGF och p53-protein ackumulering relaterade till TNM steg och GC differentiering. Dessa fynd tyder på att p53, iNOS och VEGF kan vara användbara biomarkörer för GC aggressivitet. Den molekylära grunden för den observerade uttrycket av iNOS och VEGF och p53-protein anhopning och deras roller i utvecklingen av gastric precancerösa lesioner och angeogenesis kräver att undersökas noggrant i laboratoriet och uppföljningsstudier.
Förkortningar
förkortningarna som används är:
CSG, kronisk ytlig gastrit
CAG:
kronisk atrofisk gastrit
DYS:
dysplasi
GC:
magcancer
iNOS:
inducerbart kväveoxidsyntas

IM:
intestinal metaplasi
VEGF.
vascular endothelial growth factor
förklaringar
Tack
Detta arbete stöddes delvis av. National Outstanding Young Scientist Award Kina 30025016, staten Key Project till grundforskning G1998051206 (Kina) och Stiftelsen Henan utbildningsnämnden
Authors "original lämnat filer för Images of Nedan är länkarna till författarnas ursprungliga inlämnade filer för bilder. 12885_2001_28_MOESM1_ESM.doc Författaroriginalfilen för figur 1 12885_2001_28_MOESM2_ESM.doc Författaroriginalfilen för figur 2 12885_2001_28_MOESM3_ESM.doc Författaroriginalfilen för figur 3

• Stöd vektor modell maskin för diagnos av lymfkörteln metastasering i magsäckscancer med multidetector datortomografi: en preliminär study
• Kombinerade funktioner baserade på MT1-MMP uttryck, CD11b + immunocyter densitet och LNR förutsäga kliniska resultat av mag cancer