Expression von p53, induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase und vascular endothelial growth factor in Magen präkanzerösen und kanzerösen Läsionen: Korrelation mit klinischen Merkmalen

Die Expression von p53, induzierbare NO-Synthase und vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor im Magen präkanzerösen und kanzerösen Läsionen: Korrelation mit den klinischen Merkmalen
Zusammenfassung
Hintergrund
das Wachstum und die Metastasierung von Tumoren sind abhängig von der Entwicklung eines angemessenen Blutversorgung über die Angiogenese. Neuere Studien zeigen, dass die induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS), vascular endothelial growth factor (VEGF) und der Tumorsuppressor p53 sind grundlegende Spielmarken des angiogenetischen Prozesses. Überexpression von iNOS und VEGF wurde Angiogenese in Tumoren induzieren. P53 unterdrückt Angiogenese durch Herunterregulierung VEGF und iNOS. Die Korrelation der Expression von p53, VEGF und iNOS und klinischen Eigenschaften im Magen Karzinogenese, wurde jedoch nicht gut charakterisiert.
Methoden
Die Expression von p53, iNOS und VEGF im Magen präkanzerösen und kanzerösen Läsionen und ihre Beziehung mit die klinischen Merkmale mit Immunhistochemie (Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex-Verfahren) auf 55 zufällig ausgewählten GC-Patienten und 60 symptomfreien Probanden aus der Masse Umfrage im Hoch Inzidenz Bereich für GC in Henan, nord-China bestimmt.
Ergebnisse , die positive immunostainig Raten für p53, iNOS und VEGF in Magenkarzinomen waren 51%, 44% und 51%, bzw., und gut mit TNM Stadien korreliert sind, aber keine signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen mit unterschiedlichen Graden der Magenwand Invasionstiefe von GC. Eine positive Immunfärbung Reaktion für die iNOS-Protein wurde signifikant mit Lymphknotenmetastasen (; Spearman Korrelationskoeffizient p = 0,019) korreliert. P53 Protein-Akkumulation war in der schlecht differenzierten Magenkarzinom als in gut differenzierten ein. In Magenbiopsien wurde keine positive immunosatining für p53, iNOS und VEGF in der histologisch normalem Gewebe und chronische oberflächliche Gastritis (CSG) beobachtet. Allerdings p53, iNOS und VEGF positive Immunfärbung wurde in den Geweben mit unterschiedlichen Schweregraden der Läsionen der chronischen atrophischen Gastritis (CAG), intestinale Metaplasie (IM) und Dysplasie (DYS), und die positiven Raten beobachtet stieg mit der Läsionsprogression von CAG IM DYS. Eine hohe zufällige positive und negative Immunfärbung Rate für p53, iNOS und VEGF wurde in Biopsieproben mit CAG, IM und DYS aus den symptomfreien Probanden und bei Magenkrebsgewebe aus den GC-Patienten beobachtet beide.
Schlussfolgerungen
Die vorliegenden Ergebnisse zeigten, dass p53 Proteinakkumulation und erhöhte Expression von iNOS und VEGF könnte für Magen-Karzinogenese und Tumoraggressivität von Magenkrebs verantwortlich.
Gastric Adenokarzinom (GC) ist eine der häufigsten bösartigen Erkrankungen in China. Obwohl die GC hat in seiner Sterblichkeit abgelehnt wurde, bleibt es die führende Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle in diesem Land (Parkin et al, 1992;. Weltgesundheitsorganisation, 1994; Nomura A, 1996). Magen-Karzinogenese ist als mehrstufiger progressiver Prozess betrachtet. Der Frühindikator für das Subjekt zu GC prädisponiert ist abnormal Hyperproliferation von Magen-Epithelzellen, wie chronische atrophische Gastritis (CAG), DYS und intestinale Metaplasie (IM), die als präkanzeröse Läsionen der GC (You et al betrachtet worden., 1993; Correa P, 1992). Jedoch ist die Information für den Mechanismus der Karzinogenese Magen sehr begrenzt.
Das Wachstum und die Metastasierung von Tumoren auf die Entwicklung einer adäquaten Blutversorgung über Angiogenese abhängen. Neuere Studien zeigen, dass die induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS), vascular endothelial growth factor (VEGF) und Tumorsuppressor p53 sind grundlegende Spielmacher des angiogenen Prozesses (Ambs et al, 1994;.. Jekins et al, 1995; Forrester et al, 1996;.. Chiarugi et al, 1998). iNOS ist eine der Isoformen von Stickstoffoxid-Synthase, die die Bildung von Stickstoffmonoxid, ein Regulator der vaskulären Permeabilität katalysiert. VEGF ist ein dimeres Glycoprotein und hat spezifische mitogene Aktivität für Endothelzellen. Überexpression von iNOS und VEGF konnte Angiogenese in Tumoren induzieren. P53 unterdrückt Angiogenese durch Herunterregulierung VEGF und iNOS. Mutant p53 potenziert Proteinkinase C Induktion der VEGF-Expression (Zhang et al., 2000). In einem tumorigenicity Modell menschlichen Fibroblasten-Zellen, der Verlust von Wildtyp-p53 und Transfektion von aktivierten ras führte zu einer erhöhten Expression von VEGF (Bhishma et al., 1995). Die transiente Transfektion von Wildtyp-p53 und von v-src wurde gegenläufige Effekte auf den menschlichen VEGF-Gen-Promotor-Aktivität in menschlichen Glioblastom und transformierten menschlichen fötalen Nierenzellen ausüben gefunden (Bhishma et al., 1995). Da jedoch die Wildtyp-p53 nicht Hypoxie induzierte Transkription des VEGF-Gens in stabil transfizierten humanen kolorektalen Karzinom und menschlichen Hepatoblastom Zellen mit einem induzierbaren p53-Östrogen-Rezeptor-Fusionsprotein-Expressionssystem reprimieren (Ambs et al., 1998), es wurde vorgeschlagen, daß dieses Protein transient auf der Grundlage von Zellen in der Interpretation p53-Funktion eine Notwendigkeit zur Vorsicht ist überexprimieren. Dennoch wurde mit einer erhöhten Expression von VEGF in der menschlichen Lungenkarzinom (Ambs et al., 1994) und Darmkrebs (Ambs et al., 1999) durch immunhistochemische Färbung von chirurgischen Proben mutant p53 korreliert. Es wurde berichtet, dass Fehlfunktion des p53 /MDM-2-Weg kann in mehr als zwei Drittel der Angiosarkome gefunden werden; Somit beeinflusst mutant p53 die Entwicklung Angiosarkom nicht nur durch das Wachstum und Apoptose Kontrolle beeinflussen, sondern auch durch Hochregulieren VEGF (Chinrugi et al., 1998). Wir vermuten, dass Veränderungen von p53, iNOS und VEGF-Expression zu Magen-Krebsentstehung beitragen können, und das klinische Verhalten von GC über die Angiogenese beeinflussen. Die Korrelation der Expression von p53, VEGF und iNOS und klinische Merkmale der Magen-Karzinogenese hat sich jedoch nicht gut charakterisiert.
Zur Charakterisierung wurde die Änderungen von p53, iNOS und VEGF-Expression in menschlichen Magen Karzinogenese, ist die vorliegende Studie durchgeführt, um bestimmen die Proteinebene von p53, iNOS und VEGF in normalen Geweben und die Gewebe mit unterschiedlichen Schweregraden der Läsionen von CSG, CAG, DYS, iM und GC mit und ohne Knoten Metastasen die Lymphe aus chirurgisch menschlichen GC und Magen-Biopsien von symptomfreien Probanden reseziert . Die Probanden wurden von Linzhou und in der Nähe Grafschaft Huixian in der Provinz Henan, der High-Inzidenz Bereich für GC in Nordchina.
Materialien und Methoden
Patienten
Die vorliegende Untersuchung umfasste 55 zufällig ausgewählten GC-Patienten und 60 symptom freie Subjekte aus der Masse Umfrage im Hoch Inzidenz Bereich für GC. Fünfundfünfzig GC Patienten wurden von 1996 bis 1998 Vor der Operation Magenkrebs Chirurgie an der Linzhou Volkskrankenhaus (n = 26) und die zweite Affiliated Hospital der Henan Medical University (n = 29) durchgeführt wird, keiner der Patienten erhielten alle Arten von chemische oder Strahlentherapie. Das mittlere Alter der Patienten betrug 61 Jahre (30 ~ 77 Jahre). Cancer Proben wurden basierend auf TNM als Stufe T1 eingestuft (19 Patienten, 35%), T2 (14 Patienten, 25%), T3 (12 Patienten, 22%) und T4 (10 Patienten, 18%). Die Tumoren wurden als gut differenzierte (15 Patienten, 27%) histologisch abgestuft, mäßig differenzierten (14 Patienten, 25%) und schlecht differenzierten (26 Patienten, 47%). Von den 55 Patienten traten 35 lokale Lymphknotenmetastasen (64%). Magenbiopsien wurden von 60 symptomfreien Probanden genommen, die sich freiwillig in einer Routine endoskopische Screening für Speiseröhren und Magenkrebs in Huixian, China teilzunehmen. Keine Auswahlprozess beteiligt war. Von den 60 Probanden untersucht, dort waren 35 Männer und 25 Frauen. Das Durchschnittsalter der Probanden betrug 59 Jahre (28 ~ 70 Jahre). Die Biopsien wurden jeweils von den Pylorus des Magens aus jedem Fach.
Gewebeverarbeitung genommen
Alle operativ reseziert Proben und Biopsie-Proben wurden mit 10% neutralem Formalin fixiert, mit Paraffin eingebettet und seriell mit 5 &mgr; m geschnitten. Die Schnitte wurden auf die histostick beschichtete Objektträger aufgebracht. Vier oder fünf benachbarte Bänder wurden für die histopathologische Analyse gesammelt (Hämatoxylin und Eosin-Färbung) und zur immunhistochemischen Färbung.
Histopathologische Analyse
histopathologische Diagnose für Magen-Epithelien wurde nach zellulären morphologischen Veränderungen und Gewebearchitektur aus vorher festgelegten Kriterien (Wang et al, 1994;.. Sie, et al, 1993). Kurz gesagt, CSG: ein durch milde Lymphozyten und Plasma-Zell-Infiltration manifestiert Entzündung; CAG: Drüsen Morphologie verschwand teilweise oder vollständig in der Schleimhaut vorhanden ist und durch Bindegewebe ersetzt, inter-Drüsen Raum hauptsächlich durch Plasmazellen und Lymphozyten infiltriert; DYS: gekennzeichnet durch Kernatypien mit oder ohne architektonische Anomalien in der Magen-Epithel, aber ohne Invasion; IM: durch die Anwesenheit von Becherzellen in der Magenschleimhaut bestätigt; Adenokarzinom (AC):. Invasion von Tumorzellen des Magens durch die Basalmembran
Immunhistochemische Färbung
Anti-p53-Antikörper ist ein monoklonaler Maus-Anti-Serum gegen p53 menschlichen Ursprungs, und erkennt sowohl Wildtyp und Mutante p53 ( ab-6, Oncogene Science, Manhasset, NY). Anti-iNOS-Antikörper ist ein monoklonaler Maus-Anti-Serum gegen die C-terminale Domäne von iNOS menschlichen Ursprungs (sc-7271, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Anti-VEGF-Antikörper ein polyklonales Kaninchen-Antiserum gegen VEGF humanen Ursprungs und erkennt eine aminoterminale Epitop in VEGF gefunden 121, 165, 189 und 206 (Ab-2, Oncogene Science, Manhasset, NY). Die Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex-Verfahren wurde für die Immunfärbung von p53, iNOS und VEGF verwendet. 1000:; kurz gesagt, nach dem Entwachsen, endogene Peroxidase-Aktivität und die Blockierung Kreuzreaktivität mit normalem Serum (Vectastain Elite Kit Vector, Burlingame, CA) zu inaktivieren, wurden die Schnitte über Nacht bei 4 □ mit einer verdünnten Lösung des primären Antikörper (1 inkubiert für p53, 1: 200 für iNOS und 1: 100 für VEGF). Lage der primäre Antikörper wurde durch nachfolgende Anwendung eines biotinylierten anti-primären Antikörper, ein Avidin-Biotin-Komplex, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase erreicht und Diaminobenzidin (Vectastain Elite Kit, Vector, Burlingame, CA). Die Objektträger wurden gegengefärbt von Hämatoxylin. Negative Kontrollen wurden durch Ersatz des primären Antikörpers mit PBS und normale Maus oder Kaninchen-Serum hergestellt. Bekannte Immunofärbung-positive Objektträger wurden als positive Kontrollen verwendet.
Spezifische Markierung für jedes Protein als entweder positiv oder negativ, bezogen auf das Vorhandensein von braun-Farben-Färbung kategorisiert wurde. Mehr als 10% der Zellen positiv gefärbt wurden als positiv bewertet. Klare Färbung für Kerne (p53), Zytoplasma und Zellmembran (VEGF und iNOS) war das Kriterium für eine positive Reaktion (Wang et al., 1994). Alle immunostaining Objektträger wurden durch zwei Pathologen (L D Wang und L H Jiao) beobachtet. Die Folien mit unterschiedlichen Diagnose durch zwei Pathologen wieder gelesen wurden (weniger als 5%), bis die vereinbarte Diagnose gestellt wurde.
Statistische Analyse
Der X 2-Test für den Prozentsatz der Proben mit positiven Fleck verwendet wurde, . Spearman Korrelationstest und lineare Tendenz Test wurden für die Korrelation zwischen positiven Raten und nach unterschiedlichen Schweregraden der Läsionen (p < 0,05 wurde als signifikant betrachtet)
Ergebnisse

• Support-Vektor-Maschine-Modell für die Diagnose von Lymphknotenmetastasen bei Magenkrebs mit Multidetektor-Computertomographie: eine Vorstudie
• Kombinierte Funktionen auf Basis von MT1-MMP-Expression, CD11b + Immunozyten Dichte und LNR vorhersagen, die klinischen Ergebnisse von Magen cancer