A expressão de p53, iNOS e fator de crescimento endotelial vascular em lesões pré-cancerosas e cancerosas gástricas: correlação com aspectos clínicos

A expressão de p53, iNOS e fator de crescimento endotelial vascular em lesões pré-cancerosas e cancerosas gástricas: correlação com aspectos clínicos da arte abstracta
Fundo
O crescimento e metástase de tumores dependem do desenvolvimento de um fornecimento de sangue adequado através de angiogénese. Estudos recentes indicam que a sintase induzível do óxido nítrico (iNOS), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e o supressor tumoral p53 são play-marcadores fundamentais do processo angiogénico. A sobre-expressão de iNOS e o VEGF tem sido mostrado para induzir a angiogénese em tumores. P53 suprime a angiogênese por down-regulação VEGF e iNOS. A correlação da expressão de p53, VEGF e iNOS e características clínicas em carcinogênese gástrica, no entanto, não foi bem caracterizada.
Métodos
A expressão da p53, iNOS e VEGF nas lesões pré-cancerosas e cancerosas gástricas e sua relação com as características clínicas foi determinada com imuno-histoquímica (método complexo avidina-biotina-peroxidase) em 55 pacientes GC selecionados aleatoriamente e 60 indivíduos livres de sintomas da pesquisa em massa na área de alta incidência de GC em Henan, no norte da China.
resultados
as taxas immunostainig positivos para p53, iNOS e VEGF em carcinomas gástricos foram 51%, 44% e 51%, respectivamente, e bem correlacionada com os estágios TNM, mas não mostrou diferença significativa entre os grupos com diferentes graus de parede gástrica profundidade de invasão por CG. Uma reação imunocoloração positiva para a proteína iNOS foi significativamente correlacionada com metástases em linfonodos (p = 0,019; coeficiente de Spearman). acumulação da proteína p53 foi mais elevada no carcinoma gástrico pouco diferenciado de um em cada bem diferenciado. Em biópsias gástricas, não foi observada nenhuma immunosatining positivos para p53, iNOS e VEGF no tecido normal histologicamente e gastrite superficial crónica (CSG). No entanto, o p53, iNOS e VEGF imunocoloração positiva foi observada nos tecidos com diferentes gravidades de lesões de gastrite crónica atrófica (CAG), metaplasia intestinal (GI) e displasia (DIS), e as taxas positivas aumentou com a progressão da lesão de CAG para IM para dis. observou-se alta taxa de imunocoloração positiva e negativa coincidência para p53, iNOS e VEGF tanto em amostras de biópsia com CAG, IM e DYS dos sujeitos livres de sintomas e no tecido câncer gástrico dos pacientes do GC.
Conclusões of the apresentam resultados indicaram que a acumulação da proteína p53 e aumento da expressão de iNOS e VEGF pode ser responsável pela carcinogênese gástrica e agressividade do tumor do câncer gástrico.
adenocarcinoma gástrico (CG) é uma das doenças malignas mais comuns na China. Embora o GC foi recusado em sua taxa de mortalidade, continua a ser a principal causa de mortes relacionadas ao câncer neste país (Parkin et al, 1992;. Organização Mundial da Saúde, 1994; Nomura A, 1996). carcinogénese gástrica é considerada como um processo progressivo de múltiplos estágios. O indicador de início para o indivíduo com predisposição para a GC é hiperproliferação anormal das células epiteliais gástricas, tais como gastrite crónica atrófica (CAG), dis e a metaplasia intestinal (GI), que foram considerados como lesões pré-cancerosas de GC (You et ai., 1993; P Correa, 1992). No entanto, a informação para o mecanismo da carcinogénese gástrico é muito limitada.
O crescimento e a metástase de tumores dependem do desenvolvimento de um fornecimento de sangue adequado através de angiogénese. Estudos recentes indicam que a indutível da sintase do óxido nítrico (iNOS), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e p53 supressor de tumores são PLAY decisores fundamentais do processo angiogénico (Ambs et ai, 1994;.. Jekins et ai, 1995; Forrester et ai, 1996;.. Chiarugi et al, 1998). iNOS é uma das isoformas de sintase do óxido nítrico, que catalisa a formação de óxido nítrico, um regulador da permeabilidade vascular. O VEGF é uma glicoproteína dimérica e tem actividade mitogénica específica para células endoteliais. A sobre-expressão de iNOS e VEGF poderia induzir a angiogénese em tumores. P53 suprime a angiogênese por down-regulação VEGF e iNOS. p53 mutante potencia indução proteína quinase C da expressão de VEGF (Zhang et al., 2000). Em um modelo de tumorigenicidade usando células de fibroblastos humanos, a perda de p53 de tipo selvagem e a transfecção de ras activado levou a um aumento da expressão de VEGF (Devavrata et al., 1995). transfecção transiente de p53 de tipo selvagem e de v-src foi encontrado para exercer efeitos opostos sobre a actividade de VEGF humano do gene promotor de glioblastoma humano e células de rim fetal humano transformadas (Devavrata et al., 1995). No entanto, porque a p53 de tipo selvagem não reprimir a transcrição induzida por hipoxia do gene VEGF em carcinoma colorrectal humano estavelmente transfectadas e células de hepatoblastoma humanas com um sistema de expressão de proteína de fusão do receptor p53 do estrogénio indutível (Ambs et al., 1998), ele tem sido proposto que existe uma necessidade de cuidado na interpretação função de p53 sobre a base de células que sobre-expressam de forma transiente esta proteína. No entanto, o mutante p53 tem sido correlacionada com um aumento da expressão de VEGF no cancro do pulmão humano (Ambs et al., 1994), e o cancro colo-rectal (Ambs et al., 1999) por coloração imuno-histoquímica de espécimes cirúrgicos. Tem sido relatado que a disfunção do p53 /MDM2 de vias pode ser encontrada em mais de dois terços de angiossarcomas; Assim, o mutante p53 influencia o desenvolvimento de angiossarcoma não só ao afectar o crescimento e o controlo da apoptose, mas também por cima de regulação de VEGF (Chinrugi et al., 1998). Trabalhamos com a hipótese de que alterações de p53, iNOS e expressão VEGF pode contribuir para a carcinogênese gástrica e influenciar o comportamento clínico do GC via angiogênese. A correlação da expressão de p53, VEGF e iNOS e características clínicas em carcinogênese gástrica, no entanto, não foi bem caracterizada.
Para caracterizar as alterações de p53, iNOS e expressão VEGF na carcinogênese gástrica humana, o presente estudo foi realizado para determinar o nível de proteína de p53, iNOS e VEGF em tecidos normais e os tecidos com diferentes gravidades das lesões de CSG, CAG, DYS, IM e GC com e sem metástases linfonodais de ressecado cirurgicamente GC humana e biópsias gástricas de indivíduos livres de sintomas . Os sujeitos foram de Linzhou e Huixian município vizinho, na província de Henan, área de alta incidência de GC no norte da China.
Materiais e Métodos
Pacientes
A presente investigação incluiu 55 pacientes GC selecionados aleatoriamente e 60 sintoma sujeitos livres da pesquisa de massa na área de alta incidência de GC. Cinquenta e cinco pacientes do GC foram realizadas cirurgia de câncer gástrico no Hospital Linzhou Popular (n = 26) ea segunda Hospital Afiliado da Universidade de Medicina de Henan (n = 29) de 1996 a 1998. Antes da cirurgia, nenhum dos pacientes recebeu quaisquer tipos de química ou terapia de radiação. A idade média dos pacientes era de 61 anos (30 ~ 77 anos). espécimes de câncer foram classificados com base na TNM como estágio T1 (19 pacientes, 35%), T2 (14 pacientes, 25%), T3 (12 pacientes, 22%) e T4 (10 pacientes, 18%). Os tumores foram histologicamente classificados como bem diferenciado (15 pacientes, 27%), moderada diferenciado (14 pacientes, 25%) e pouco diferenciadas (26 pacientes, 47%). Dos 55 pacientes, 35 ocorreram metástases em linfonodos local (64%). As biopsias foram retirados de 60 indivíduos livres de sintomas que se voluntariaram para participar de uma triagem endoscópica de rotina para esôfago e câncer gástrico em Huixian, China. No processo de seleção estava envolvido. Dos 60 indivíduos examinados, havia 35 homens e 25 mulheres. A idade média dos participantes foi de 59 anos (28 ~ 70 anos). As biópsias foram tomadas cada a partir do piloro do estômago de cada sujeito. Processamento de tecidos
Todos os espécimes cirurgicamente ressecados e amostras de biópsia foram fixadas com formalina a 10% neutra, incorporado com parafina e seccionados a 5 mm. Os cortes foram montados em lâminas revestidas com histostick. Quatro ou cinco fitas adjacentes foram coletados para análise histopatológica (hematoxilina e eosina) e para a coloração imuno-histoquímica.
Análise histopatológica
O diagnóstico histopatológico de epitélio gástrico foi feita de acordo com as alterações morfológicas celulares e arquitetura de tecido, utilizando critérios previamente estabelecidos (Wang , et ai, 1994;.. É, et ai, 1993). Em resumo, CSG: uma inflamação que se manifesta por infiltração de linfócitos e células de plasma leve; CAG: morfologia glandular desapareceu parcialmente ou completamente ausente na mucosa e substituído por tecido conjuntivo, o espaço inter-glandular foi infiltrada principalmente por células de plasma e linfócitos; DYS: caracterizado por atipia nuclear com ou sem anomalias arquitetônicas no epitélio gástrico, mas sem invasão; IM: confirmado pela presença de células caliciformes na mucosa gástrica; adenocarcinoma (AC):. invasão de células neoplásicas gástricas através da membrana basal

coloração imuno-histoquímica de anticorpos anti-p53 é um anti-soro monoclonal de ratinho contra a p53 de origem humana, e reconhece tanto de tipo selvagem e p53 mutante ( Ab-6, Oncogene Science, Manhasset, NY). O anticorpo anti-iNOS é um anti-soro monoclonal de ratinho contra o domínio C-terminal de iNOS de origem humana (sc-7271, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). anticorpo anti-VEGF é um anti-soro policlonal de coelho contra o VEGF de origem humana e reconhece um epítopo amino-terminal encontradas em VEGF 121, 165, 189 e 206 (Ab-2, Oncogene Science, Manhasset, NY). O método do complexo avidina-biotina-peroxidase foi utilizado para a imunocoloração de p53, iNOS e VEGF. Em resumo, depois de desparafinação, inactivando a actividade da peroxidase endógena e bloqueando a reactividade cruzada com soro normal (Vectastain Elite Kit, Vector, Burlingame, CA), as secções foram incubadas durante a noite a 4 □ com uma solução diluída de os anticorpos primários (1: 1000 para p53, 1: 200 para iNOS e 1: 100 para o VEGF). Localização dos anticorpos primários foi conseguida por aplicação subsequente de um anticorpo biotinilado anti-primária, um complexo de avidina-biotina conjugado com peroxidase de rábano, e diaminobenzidina (Vectastain Elite Kit, Vector, Burlingame, CA). As lâminas foram contra-coradas com hematoxilina. Os controlos negativos foram estabelecidas através da substituição do anticorpo primário com PBS e soro normal de ratinho ou coelho. lâminas imunocoloração-positivas conhecidas foram utilizadas como controlos positivos.
coloração específica para cada proteína foi classificada como positiva ou negativa com base na presença de coloração cor-castanha. Mais de 10% de células marcadas positivamente foram classificados como positivos. coloração clara para os núcleos (p53), citoplasma e membrana celular (VEGF e iNOS) foi o critério para uma reacção positiva (Wang et al., 1994). Todos os slides imunocoloração foram observados por dois patologistas (L D Wang e G H Jiao). As lâminas com diagnóstico diferente por dois patologistas foram lidos novamente (menos do que 5%), até que o diagnóstico foi feito acordado.
Análise Estatística
O X 2 teste foi utilizado para a percentagem de amostras com mancha positiva . teste teste de correlação e de tendência linear de Spearman foram utilizados para a correlação entre as taxas positivas e diferentes gravidades das lesões (p < 0,05 foi considerado significativo)
Resultado
Histopatologicamente, todas as 55 amostras gástricas cirurgicamente ressecados foram confirmados como. adenocarcinoma. Dos 55 pacientes do GC, 11 casos ocorreu a invasão dentro da sub-mucosa, 44 com camada muscular inteiro. Das 60 amostras de biópsia examinados, 10 foram diagnosticados como normal, 15 como CSG, 9 como CAG, 16 como primário com CAG, e 10 como DYS (Tabela 1) .table uma imunorreactividade de p53, iNOS e VEGF no epitélio gástrico normais e os epitélios com diferentes gravidades das lesões


P53
iNOS

VEGF

No. de amostras examinadas
No. da mancha positivo n (%)
No. da mancha positivo n (%)
No. da mancha positivo n (%)
normala
10
0 (0)
0 (0)
0 (0)
CSGB
15
0 (0)
0 (0)
0 (0)
CAGC
9
1 (11)
0 (0) Página 2 (22)
IMD
16 Sims 3 (19) Página 2 (13)
5 (31)
DYSe
10 Sims 3 (30) página 4 (40)
5 (50)
GCF
55
28 (51)
24 (44)
28 (50)
P53: c: fp = 0,02 d :: fp = 0,013; iNOS: C: f p = 0,03 d: f p = 0,015; VEGF: c: f p = 0,014 d: f p = 0,015
A imunocoloração positiva para p53, iNOS e VEGF foi observada nas células epiteliais e células cancerosas gástrica com taxas diferentes nas lesões de CAG, DYS, IM e GC. Mas, a imunocoloração positiva para o p53, iNOS e VEGF não foi observada em tecido epitelial gástrica normal e CSG. A Figura 1, 2 e 3 mostra o representante da p53, iNOS e VEGF imunocoloração em GC. imunorreactividade p53 foi localizado no núcleo, VEGF e iNOS imunorreatividade foram localizados principalmente na membrana citoplasma e celular. iNOS imunocoloração foi confirmada por Western blot em parte da iNOS lâminas positivas e negativas (três lâminas de cada uma), e foram obtidos resultados consistentes para iNOS imuno-histoquímica e Western Blot (dados não mostrados). A taxa de positividade para p53 era muito baixa em CAG, e aumentou ligeiramente em IM e DYS, e aumentou significativamente no GC (Tabela 1). Resultados semelhantes foram observados em iNOS e VEGF (Tabela 1). P53 immunosatining taxa positiva em GC bem diferenciado foi menor do que no GC pobremente diferenciadas (p = 0,012, Tabela 2). iNOS coloração positiva foi semelhante entre o GC com diferente grau de diferenciação. Embora VEGF taxa de imunocoloração em GC mal diferenciado foi maior que no GC bem diferenciado, a diferença não foi significativa (Tabela 2). Figura 1 A imunocoloração de p53 no carcinoma gástrico. A imunorreactividade está localizada nos núcleos celulares (setas). 20X
Figura 2 imunocoloração da iNOS no carcinoma gástrico. Imunoreatividade está localizado principalmente no citoplasma e membrana nuclear celular. 10X
Figura 3 A imunocoloração de VEGF no carcinoma gástrico. A imunorreactividade está localizado no citoplasma e membrana celular. 10X
Tabela 2 Presença da iNOS, p53 e VEGF no GC e sua correlação com diferentes graus de diferenciação


P53 *
iNOS
VEGF
Diferenciação grau de GC
No. de amostras examinadas
No. da mancha positivo n (%)
No. da mancha positivo n (%)
No. da mancha positivo n (%)
Bem-differentiateda
15
5 (33)
7 (47)
6 (40)
Moderado-differentiatedb 14
6 (43)
5 (36)
6 (43)
mal-differentiatedc
26
17 (66)
12 (46)
16 (61)
* a: cp = 0,012
iNOS taxa de imunocoloração positiva nos casos com invasão profunda da GC (através de camadas musculares) foi maior do que naqueles com invasão superficial (dentro de submucosa), mas, a diferença foi não significativo (Tabela 3). P53 e VEGF imunocoloração foi similar em pacientes com GC superficial e profunda invasion.Table 3 Presença da p53, iNOS e VEGF e sua correlação com profundidade de invasão do carcinoma gástrico


P53
iNOS
VEGF
Invasion profundidade de GC
No. das amostras examinadas
No. da mancha positivo n (%)
No. da mancha positivo n (%)
No. da mancha positivo n (%)
Dentro mucosa
camada muscular 11
5 (46) Sims 3 (27)
6 (55)
44
23 (52)
21 (48)
22 (50)
iNOS taxas nos casos com metástase ganglionar immunosatining foi maior do que naqueles sem metástases em linfonodos (p = 0,014, Tabela 4 ). No entanto, não houve diferença observada para p53 e VEGF entre os casos com e sem linfonodos metastasis.Table 4 Presença da p53, iNOS e VEGF e sua correlação com metástases em linfonodos do carcinoma gástrico


P53
iNOS *
VEGF
metástases linfonodais

Não. das amostras examinadas
No. da mancha positivo n (%)
No. da mancha positivo n (%)
No. da mancha positivo n (%)
Sim
35
18 (51)
19 (55)
21 (60)
Sem
20
10 (50)
5 (25)
7 (35)
* p = 0,014 taxa de imunocoloração
P53 nos casos com grau de TNM T1 foi menor do que em pessoas com grau TNM T2, T3 e T4 (T1: T3, P = 0,023; T1: T4, P = 0,012). Resultados semelhantes foram observados em VEGF (T1: T2 e T2: T3, P = 0,015; T1: T4, p = 0,014; T2: T4, P = 0,01, Tabela 5). No entanto, não houve diferença para iNOS imunocoloração entre os casos com diferentes TNM stages.Table 5 Presença da p53, iNOS e VEGF e sua correlação com a classificação TNM clínico


P53 *
iNOS
VEGF ** estágios
TNM
No. de amostras examinadas
No. da mancha positivo n (%)
No. da mancha positivo n (%)
No. da mancha positivo n (%)
T1
19
7 (37) um
7 (37)
8 (42) um
T2
14
6 (43) b página 4 (29) 4
(29) b
T3
12
8 (67) c
7 (58)
8 ( 67) c
T4
10
7 (70) d
6 (60)
8 (80) d
* a: cp = 0,023, a: dp = 0,012; ** Um: a, c p = 0,015:: d p = 0,014, b: d p = 0,01
A maior expressão coincidente de p53, foi observada iNOS e VEGF no GC b e b. Dos 55 casos analisados, houve 20 casos que apresentam coloração positiva, tanto para p53 e iNOS (36%), 23 casos que mostram coloração negativa para ambos p53 e iNOS (42%) (p = 0,005, Tabela 6), 19 casos mostrando positiva coloração tanto para p53 e VEGF (35%) e 18 casos negativos que mostram tanto para p53 e VEGF (33%) (p = 0,01, Tabela 7). As correlações foram significant.Table 6 expressão coincidente de p53 ea proteína iNOS no carcinoma gástrico

p53 (+)
p53 (-)

n (%)
n (%)
iNOS (+)
20 (36) página 4 (7)
iNOS (-)
8 (15)
23 (42)
X2 = 15,68, p = 0,005
Tabela 7 expressão coincidente de p53 ea proteína VEGF na gástrica carcinoma

p53 (+)
p53 (-)

n (%)

n (%)
VEGF (+)
19 (35)
9 (16)
VEGF (-)
9 (16)
18 (33)
X2 = 6,56, p = 0,01
Discussão
Uma observação interessante neste estudo foi que a imunorreatividade de p53, iNOS e VEGF ocorreu na fase inicial da carcinogênese gástrica. As células de positividade foram invariavelmente associada com a atividade proliferam celular. Com as lesões progrediram de normal a CSG para CAG para IM para DYS, e GC, as taxas de positividade para p53, iNOS e VEGF aumentou significativamente, a crescente tendência para a p53, iNOS e VEGF tinha uma boa correlação linear com a progressão de lesões. Os presentes resultados indicam que a acumulação de proteína p53 e aumento da expressão de iNOS e VEGF podem ser importantes eventos moleculares envolvidos na fase precoce da carcinogénese gástrica.
Outra observação interessante foi que, uma coincidentes altas taxas de positividade para p53 e iNOS (36 %) e p53 e VEGF (35%) foi observada (Tabela 6 e 7). Este resultado foi consistente com as descobertas em carcinomas de pulmão e cólon humanos (Ambs et al., 1999). Embora anticorpo p53 utilizado neste estudo não poderia diferenciar-p53 do tipo selvagem de p53 mutante, Estudos anteriores indicaram que a proteína p53 detectados por imuno-histoquímica parece mais representativa p53 mutante. A acumulação de p53 é um indicador de uma perda de função supressora de tumor p53. Ambas as mutações e interacções proteína-proteína pode causar uma acumulação de p53 (Wang, et al., 1994). Considerando que a acumulação da proteína p53 foi correlacionada com mal-diferenciação e T2, T3 e estágio T4 TNM de GC, concluiu-se que a acumulação da proteína p53 no presente estudo pode levar à perda do controle da proliferação celular e inibição de iNOS e VEGF, possivelmente por causa de mutação do gene p53. Assim, a expressão coincidente de alta iNOS e VEGF e acumulação de proteína p53 podem ser eventos importantes para melhorar a carcinogénese gástrica e características clínicas e mal biomarcadores pode ser útil para avaliar o risco para o desenvolvimento de GC. Estudos recentes em pacientes GC japoneses demonstraram que o aumento da expressão de VEGF e acumulação de proteína p53 estão associadas com a angiogénese intra-tumoral (Takeuchi et ai, 2000;.. Saito, et ai, 1999) e de prognóstico reservado (Skatani, et ai. , 2000; Ikeguchi, et ai, 2000;.. Maeda, et ai, 1998). Rajnkova relataram que o aumento da expressão do iNOS pode promover a progressão do cancro gástrico, proporcionando uma vantagem de crescimento selectivo de células tumorais com p53 não-funcionamento. (Rajnkova, et al., 2001)
A terceira observação neste estudo foi de que o aumento da expressão do iNOS e VEGF e acumulação de proteína p53 ocorreram com uma frequência elevada em amostras de biópsia gástrica com IM. IM, o qual pode ser definido como a substituição da mucosa gástrica por glândulas que têm as alterações histológicas, histoquímica, e as características fisiológicas do intestino delgado, tem sido fortemente associada com cancro do estômago. Os resultados deste estudo demonstraram que o IM foi uma fase instável, com mudanças moleculares ativos, e uma nova análise para comparar essas mudanças com intestino delgado normal irá fornece mais informações para a importância do IM na carcinogênese gástrica.
Finalmente, o presente estudo demonstrou que a taxas de positividade de iNOS foi correlacionada bem com nó de linfa GC metástase, aumento da expressão de VEGF e acumulação da proteína p53 foi relacionado com estágios TNM e diferenciação GC. Estes resultados indicam que a p53, iNOS e VEGF pode ser biomarcadores úteis para a agressividade de GC. A base molecular para a expressão de iNOS e observadas de VEGF e acumulação de proteína p53 e os seus papéis na progressão de lesões pré-cancerosas gástricas e angeogenesis necessita de ser cuidadosamente investigados no laboratório e estudos de acompanhamento.
Abreviações
As abreviaturas utilizadas são:
CSG, gastrite crônica superficial
CAG:
gastrite atrófica crônica
DYS:
displasia
GC: adenocarcinoma gástrico
iNOS:
induzível da óxido nítrico sintase

IM:
metaplasia intestinal
VEGF:.
fator de crescimento endotelial vascular
Declarações
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado em parte por:. National Award Outstanding Jovem Cientista da China 30025016, projeto-chave do Estado para Pesquisa básica G1998051206 (China) e Fundação do Comitê de Educação Henan
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