Uttrykk av p53, induserbar nitrogenoksid syntase og vaskulær endotelial vekstfaktor i mage forstadier og kreft lesjoner: korrelasjon med kliniske

Uttrykk av p53, induserbar nitrogenoksid syntase og vaskulær endotelial vekstfaktor i mage forstadier og kreft lesjoner: korrelasjon med kliniske
Abstract
Bakgrunn
vekst og metastasering av svulster avhenge av utviklingen av en tilstrekkelig blodtilførsel via angiogenese. Nyere studier viser at den induserbar nitrogenoksid syntase (iNOS), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og p53 tumor suppressor er fundamentale play-markører for den angiogene prosess. Overekspresjon av iNOS og VEGF har vist seg å indusere angiogenese i tumorer. P53 undertrykker angiogenese ved å nedregulere VEGF og iNOS. Korrelasjonen uttrykk av p53, VEGF og iNOS og kliniske funksjoner i magekreftutvikling, men har ikke blitt godt karakterisert.
Metoder
uttrykk av p53, iNOS og VEGF i mage forstadier og kreft lesjoner og dens forhold med kliniske kjennetegn ble bestemt med immunhistokjemi (avidin-biotin-peroksidase kompleks metode) på 55 tilfeldig utvalgte GC pasienter og 60 symptomfrie emner fra masseundersøkelse i høy forekomst område for GC i Henan, nordlige Kina.
resultater
den positive immunostainig priser for p53, iNOS og VEGF i mage karsinom var 51%, henholdsvis 44% og 51%, og korrelert godt med TNM etapper, men viste ikke signifikant forskjell mellom gruppene med ulike grader av mageveggen invasjon dybde ved GC. En positiv farging reaksjon for iNOS protein ble signifikant korrelert med lymfeknutemetastaser (p = 0,019; Spearman korrelasjonskoeffisient). P53-proteinet opphopning var høyere i dårlig differensiert magekreft enn i godt differensiert ett. I mage biopsier ble ingen positiv immunosatining observert for p53, iNOS og VEGF i histologisk normalt vev og kronisk overfladisk gastritt (CSG). Imidlertid, p53, iNOS og VEGF positiv farging ble observert i vev med forskjellige alvorlighetsgraden av lesjoner av kronisk atrofisk gastritt (CAG), intestinal metaplasi (IM) og dysplasi (DYS), og de positive priser økte med lesjon progresjon fra CAG til IM til dys. ble det observert en høy tilfeldig positiv og negativ farging sats for p53, iNOS og VEGF både i biopsiprøver med CAG, IM og DYS fra symptomfrie personer og magekreft vev fra GC pasientene.
Konklusjoner
presentere resultatene indikerte at p53 protein oppbygging og økt uttrykk av iNOS og VEGF kan være ansvarlig for magekreftutvikling og tumor aggressivitet av magekreft.
gastric adenokarsinom (GC) er en av de vanligste ondartede sykdommer i Kina. Selv om GC har blitt avvist i sin dødelighet, er det fortsatt den ledende årsak til kreft dødsfall her i landet (Parkin et al, 1992;. World Health Organization, 1994; Nomura A, 1996). Gastric kreftutvikling er regnet som en flertrinns progressiv prosess. Den tidlig indikator for faget disponert for GC er unormal hyper av mage epitelceller, som kronisk atrofisk gastritt (CAG), DYS og intestinal metaplasi (IM), som har vært vurdert som forstadier til kreft GC (Du et al., 1993; Correa P, 1992). Imidlertid informasjonen for mekanismen for gastrisk karsinogenese er meget begrenset.
Vekst og metastase av tumorer er avhengig av utviklingen av en adekvat blodtilførsel via angiogenese. Nyere studier indikerer at induserbar nitrogenoksid syntase (iNOS), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og tumor suppressor p53 er grunnleggende play-skaperne av angiogeneprosessen (Ambs et al, 1994;.. Jekins et al, 1995; Forrester et al, 1996;.. Chiarugi et al, 1998). iNOS er en av de isoformer av nitrogenoksidsyntase som katalyserer dannelsen av nitrogenoksyd, en regulator for vaskulær permeabilitet. VEGF er et dimert glykoprotein og har spesifikk mitogen aktivitet for endotelceller. Over-uttrykk for iNOS og VEGF kan indusere angiogenese i svulster. P53 undertrykker angiogenese ved å nedregulere VEGF og iNOS. Mutante p53 forsterker proteinkinase C induksjon av VEGF-ekspresjon (Zhang et al., 2000). I en tumorgenisitet modell ved anvendelse av humane fibroblast-celler, tap av villtype p53 og transfeksjon av aktiverte ras ført til økt VEGF-ekspresjon (Devavrata et al., 1995). Transient transfeksjon av vill-type p53 og av v-src har blitt funnet å utøve motstridende effekter på human VEGF-genpromoteren aktivitet på humant glioblastom og transformerte humane fosternyreceller (Devavrata et al., 1995). Imidlertid, fordi villtype p53 ikke undertrykke hypoksi-indusert transkripsjon av VEGF genet i stabilt transfekterte humane kolorektal karsinom og humane hepatoblastoma celler med en induserbar p53-estrogen-reseptor-fusjonsprotein ekspresjonssystem (Ambs et al., 1998), det det er foreslått at det er et behov for forsiktighet ved tolkning av p53-funksjon på basis av celler som forbigående overuttrykker dette proteinet. Likevel har mutant p53 blitt korrelert med øket VEGF-ekspresjon i humane lungekreft (Ambs et al., 1994), og kolorektal kreft (Ambs et al., 1999) ved immunhistokjemisk farging av kirurgiske prøver. Det har blitt rapportert at dysfunksjon av p53 /MDM-2 pathway kan finnes i mer enn to tredjedeler av angiosarcomas; således, påvirker mutant p53 utvikling av angiosarkom, ikke bare ved å påvirke vekst og apoptose kontroll, men også ved opp-regulering av VEGF (Chinrugi et al., 1998). Vi antok at endringer av p53, kan iNOS og VEGF ekspresjon bidra til gastrisk karsinogenese og påvirke den kliniske adferd av GC via angiogenese. Korrelasjonen uttrykk av p53, VEGF og iNOS og kliniske funksjoner i magekreftutvikling, men har ikke blitt godt karakterisert.
Å karakterisere endringer av p53, iNOS og VEGF uttrykk i menneskelig magekreftutvikling, ble denne undersøkelsen gjennomført for å bestemme protein nivået av p53, iNOS og VEGF i normalt vev og vev med ulike alvorlighetsgrader av lesjoner av CSG, CAG, DYS, IM og GC med og uten lymfeknutemetastaser fra kirurgisk reseksjon menneskelig GC og mage biopsier fra symptomfrie emner . Fagene var fra Linzhou og nærliggende fylke Huixian i Henan-provinsen, høy forekomst område for GC i det nordlige Kina.
Materialer og metoder
Pasienter
stede Undersøkelsen omfatter 55 tilfeldig utvalgte GC pasienter og 60 symptom gratis fag fra masseundersøkelse i høy forekomst område for GC. Femtifem GC pasienter ble utført magekreft kirurgi ved Linzhou Folkets sykehus (n = 26) og The Second Affiliated Hospital of Henan Medical University (n = 29) fra 1996 til 1998. Før kirurgi, ingen av pasientene mottatt noen typer kjemisk eller stråleterapi. Median alder for pasientene var 61 år (30 ~ 77 år). Cancer prøvene ble klassifisert på grunnlag av TNM som trinn T1 (19 pasienter, 35%), T2 (14 pasienter, 25%), t3 (12 pasienter, 22%) og T4 (10 pasienter, 18%). Tumorene ble histologisk gradert som godt differensiert (15 pasienter, 27%), moderat differensierte (14 pasienter, 25%) og dårlig differensierte (26 pasienter, 47%). Av de 55 pasienter, 35 oppsto lokale lymfeknutemetastase (64%). Gastric biopsier ble tatt fra 60 symptomfrie emner som frivillig til å delta i en rutinemessig endoskopisk screening for esophageal og magekreft i Huixian, Kina. Ingen utvelgelsesprosessen var involvert. Av de 60 fagene undersøkt, var det 35 menn og 25 kvinner. Median alder for de fagene var 59 år (28 ~ 70 år). De biopsier ble tatt hver fra pylorus i magen fra hvert fag.
Tissue behandling
Alle kirurgisk resected prøver og biopsiprøver ble fiksert med 10% nøytral formalin, innebygd med parafin, og serielt delt på fem mikrometer. Seksjonene ble montert på de histostick-belagt lysbilder. Fire eller fem tilstøtende bånd ble samlet for histopatologisk analyse (hematoxylin og eosin flekken) og for immunhistokjemisk farging.
Histopatologisk analyse
Histopatologisk diagnose for gastrisk epitel ble gjort i henhold til cellulære morfologiske endringer og vevsarkitektur hjelp tidligere etablerte kriterier (Wang , et al, 1994;.. Du, et al, 1993). I korte trekk, CSG: en betennelse manifestert ved mild lymfocytt og plasma-celle infiltrasjon; CAG: kjertel morfologi forsvunnet helt eller delvis fraværende i slimhinnene og erstattet med bindevev, inter-kjertler plass ble infiltrert hovedsakelig av plasmaceller og lymfocytter; DYS: preget av atom atypia med eller uten arkitektoniske forandringer i gastrisk epitel, men uten invasjon; IM: bekreftet ved nærværet av slimceller i mageslimhinnen; adenocarcinoma (AC). invasjon av neoplastiske gastriske celler gjennom basalmembranen
immunhistokjemisk farging
Anti-p53-antistoff er et monoklonalt mus-anti-serum mot p53 av human opprinnelse, og gjenkjenner både villtype og mutant p53 ( Ab-6, Oncogene Science, Manhasset, New York). Anti-iNOS-antistoffet er et monoklonalt mus-anti-serum mot det C-terminale domene av iNOS av human opprinnelse (sc-7271, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Anti-VEGF antistoff er et polyklonalt kaninantiserum mot VEGF av human opprinnelse og gjenkjenner en amino-terminal epitop som finnes i VEGF 121, 165, 189 og 206 (Ab-to, Oncogene Science, Manhasset, NY). Avidin-biotin-peroksidasekompleks metode ble anvendt for farging av p53, iNOS og VEGF. I korte trekk, etter avvoksing, inaktive endogen peroksidaseaktivitet og blokkering av kryss-reaktivitet med normalt serum (Vectastain Elite Kit, Vector, Burlingame, CA), ble seksjonene inkubert over natten ved 4 □ med en fortynnet løsning av de primære antistoff (1: 1000 for p53, 1: 200 for iNOS og 1: 100 for VEGF). Plassering av de primære antistoffer ble oppnådd ved etterfølgende påføring av et biotinylert anti-primær antistoff, en avidin-biotin kompleks konjugert til pepperrot-peroksidase, og diaminobenzidin (Vectastain Elite Kit, Vector, Burlingame, CA). Glassene ble kontra farget av hematoxylin. Negative kontroller ble etablert ved å erstatte det primære antistoff med PBS og normal mus eller kaninserum. Kjente immunofarging-positive objektglass ble anvendt som positive kontroller.
Spesifikk farging for hvert protein ble kategorisert som enten positiv eller negativ basert på tilstedeværelsen av brun-farge farging. Mer enn 10% celler positivt fargede ble gradert som positive. Klar farging for kjerner (p53), cytoplasma og cellemembran (VEGF og iNOS) var kriteriet for en positiv reaksjon (Wang et al., 1994). Alle farging lysbilder ble observert av to patologer (L D Wang og L H Jiao). Skinnene med forskjellig diagnose av to patologer ble lest på nytt (mindre enn 5%), inntil den avtalte diagnosen ble foretatt.
Statistical Analysis
X 2-test ble anvendt for den prosentandel av prøvene med positiv flekk . Spearman korrelasjonstest og lineær tendens test ble anvendt for korrelasjonen mellom positive rater og forskjellige alvorlighetsgraden av lesjoner (p 0,05 ble ansett som signifikant)
Resultater
Histopathologically, alle de 55 kirurgisk-resekterte gastriske prøver ble bekreftet som. adenokarsinom. Av de 55 GC pasienter, 11 tilfellene skjedde invasjonen innen sub-mucosa, 44 med hel-muskelen laget. Av de 60 biopsi-undersøkte prøvene, 10 ble diagnostisert som normalt, 15 som CSG, 9 som CAG, 16 som IM med CAG, og 10 som DYS (tabell 1) .table en immunreaktivitet av p53, iNOS og VEGF i mage normal epitel og epitel med ulike alvorlighetsgrader av lesjoner


P53
iNOS

VEGF

No. prøver undersøkt
No. positiv flekk n (%)
No. positiv flekk n (%)
No. positiv flekk n (%)
Normala
10
0 (0)
0 (0)
0 (0)
CSGb
15
0 (0)
0 (0)
0 (0)
CAGc
9
1 (11)
0 (0)
2 (22)
IMD
16
3 (19)
2 (13)
5 (31)
DYSe
10
3 (30)
4 (40)
5 (50)
GCF
55
28 (51)
24 (44)
28 (50)
P53: c: fp = 0,02 d :: fp = 0,013; iNOS: c: f p = 0,03 d: f p = 0,015; VEGF: c: f p = 0,014 d: f p = 0,015
positiv farging for p53, ble iNOS og VEGF observert i mage epitelceller og kreftceller med ulike priser i de lesjoner av CAG, DYS, IM og GC. Men, den positive farging for p53, iNOS og VEGF ble ikke observert i normal gastrisk epitelvev og CSG. Figur 1, 2 og 3 viser representative for p53, iNOS og VEGF immunfarging i GC. p53 immunreaktivitet var plassert i den kjerner, VEGF og iNOS immunoreaktivitet ble plassert hovedsakelig i cytoplasma og cellemembran. iNOS farging ble bekreftet ved Western-Blot på en del av iNOS positive og negative bakker (tre bakker for hver), og konsistente resultater ble oppnådd for iNOS immunhistokjemi og Western blot (data ikke vist). Den positive farging hastighet for p53 var meget lav i CAG, og noe økt i IM og DYS, og signifikant økt i GC (tabell 1). Lignende resultater ble observert i iNOS og VEGF (tabell 1). P53 positiv immunosatining rate i godt differensiert GC var lavere enn i dårlig differensiert GC (p = 0,012, Tabell 2). iNOS positiv farging var lik mellom GC med ulik grad av differensiering. Selv VEGF farging rate i dårlig differensiert GC var høyere enn i godt differensiert GC, forskjellen var ikke signifikant (tabell 2). Figur 1 Farging av p53 i magekreft. Immunreaktiviteten er lokalisert i cellekjerner (piler). 20X
Figur 2 Farging av iNOS i magekreft. Immunoreaktivitets ligger hovedsakelig i cytoplasma og cellekjernemembranen. 10X
Figur 3 Farging av VEGF i magekreft. Immunreaktiviteten er lokalisert i cytoplasma og cellemembran. 10X
Tabell 2 immunreaktivitet av iNOS, p53 og VEGF i GC og dens sammenheng med ulike grader av differensiering


P53 *
iNOS
VEGF
Differensiering grad av GC
No. prøver undersøkt
No. positiv flekk n (%)
No. positiv flekk n (%)
No. positiv flekk n (%)
Godt differentiateda
15
5 (33)
7 (47)
6 (40)
Moderat-differentiatedb
14
6 (43)
5 (36)
6 (43)
dårlig differentiatedc
26
17 (66)
12 (46)
16 (61) product: * a: cp = 0,012
iNOS positiv farging rente i de tilfeller som med dyp invasjon av GC (gjennom muskellagene) var høyere enn i de med overfladisk invasjon (innen submucosa), men forskjellen var ikke signifikant (Tabell 3). P53 og VEGF farging var lik i GC pasienter med overfladisk og dyp invasion.Table 3 immunreaktivitet av p53, iNOS og VEGF og dens korrelasjon med invasjonen dybde av magekreft


P53
iNOS
VEGF
invasjon dybde på GC
No. av undersøkte prøvene
No. positiv flekk n (%)
No. positiv flekk n (%)
No. positiv flekk n (%)
Innenfor slimhinnen
11
5 (46)
3 (27)
6 (55)
Muscle lag
44
23 (52)
21 (48)
22 (50)
iNOS immunosatining satsen i tilfeller med lymfeknutemetastaser var høyere enn i de uten lymfeknutemetastase (p = 0,014, Tabell 4 ). Imidlertid var det ingen forskjell observert for p53 og VEGF mellom tilfellene med og uten lymfeknute metastasis.Table 4 Immunreaktiviteten av p53, iNOS og VEGF og dens korrelasjon med lymfeknutemetastase av gastrisk karsinom


P53
iNOS *
VEGF
lymfeknutemetastaser

Nei. av undersøkte prøvene
No. positiv flekk n (%)
No. positiv flekk n (%)
No. positiv flekk n (%)
Ja
35
18 (51)
19 (55)
21 (60)
Ingen
20
10 (50)
5 (25)
7 (35) product: * p = 0,014
P53 farging satsen i tilfeller med TNM klasse T1 var lavere enn i de med TNM klasse T2, T3 og T4 (T1: T3, p = 0,023; T1: T4, p = 0,012). Lignende resultater ble observert i VEGF (T1 T2 og T2: T3, p = 0,015; T1: T4, p = 0,014; T2: T4, p = 0,01, tabell 5). Men det var ingen forskjell for iNOS farging mellom tilfeller med forskjellig TNM stages.Table 5 immunreaktivitet av p53, iNOS og VEGF og dens korrelasjon med klinisk TNM klassifisering


P53 *
iNOS
VEGF **
TNM iscenesetter
No. prøver undersøkt
No. positiv flekk n (%)
No. positiv flekk n (%)
No. positiv flekk n (%)
T1
19
7 (37) en
7 (37)
8 (42) en
T2
14
6 (43) b
4 (29)
4 (29) b
T3
12
8 (67) c
7 (58)
8 ( 67) c
T4 10
7 (70) d
6 (60)
8 (80) d product: * a: cp = 0,023, en: dp = 0,012; ** A: b og b: c p = 0,015, en: d p = 0,014, b: d p = 0,01
En høyere tilfeldig uttrykk av p53, iNOS og VEGF i GC ble observert. Av de 55 sakene var det 20 tilfeller viser positiv farging både for p53 og iNOS (36%), 23 tilfeller som viser negativ farging for både p53 og iNOS (42%) (p = 0,005, Tabell 6), 19 tilfeller viser positiv farging både p53 og VEGF (35%) og 18 saker som viser negativ for både p53 og VEGF (33%) (p = 0,01, tabell 7). Korrelasjonene var significant.Table 6 Tilfeldig uttrykk av p53 og iNOS protein i magekreft

p53 (+)
p53 (-)

n (%)
n (%)
iNOS (+)
20 (36)
4 (7)
iNOS (-)
8 (15)
23 (42)
X2 = 15,68, p = 0,005
Tabell 7 Tilfeldig uttrykk av p53 og VEGF protein i magekreft

p53 (+)
p53 (-)

n (%)

n (%)
VEGF (+)
19 (35)
9 (16)
VEGF (-)
9 (16)
18 (33)
X2 = 6,56, p = 0,01
diskusjon
en interessant observasjon i denne studien var at immunoreaktivitets av p53, iNOS og VEGF skjedde i den tidlige fasen av magekreftutvikling. De positive farging celler ble alltid forbundet med celle sprer aktivitet. Med lesjonene gått fra normal til CSG til CAG til IM til DYS, og til GC, de positive farging priser for p53, økt iNOS og VEGF betydelig, den økende tendensen til p53, iNOS og VEGF hadde en god lineær sammenheng med lesjoner progresjon. De foreliggende resultatene indikerte at p53 protein oppbygging og økt uttrykk av iNOS og VEGF kan være viktige molekylære hendelser som er involvert i den tidlige fasen av magekreftutvikling.
En annen interessant observasjon var at en høy tilfeldige positive farging priser for p53 og iNOS (36 %) og p53 og VEGF (35%) ble observert (tabell 6 og 7). Dette resultatet var konsistent med funnene i humane lunge og tykktarm karsinom (Ambs et al., 1999). Selv om p53-antistoff anvendt i denne studien kan ikke skille villtype p53 fra mutert p53 har tidligere undersøkelser indikert at p53-protein detektert ved immunohistokjemi synes å representative mest mutant p53. Akkumulering av p53 er en indikator for et tap av p53 tumor suppressor funksjon. Både mutasjoner og protein-protein interaksjoner kan føre til en opphopning p53 (Wang, et al., 1994). Tatt i betraktning at p53-protein akkumulering var korrelert med dårlig differensiering og T2, T3 og T4 TNM stadium av GC, konkluderte vi med at p53-protein-akkumulering i denne undersøkelsen kan føre til tap av celleproliferasjon kontroll og inhibering for iNOS og VEGF, muligens på grunn av p53 genmutasjon. Dermed kan den høye tilfeldig uttrykk for iNOS og VEGF og p53 protein opphopning være viktige hendelser for å forbedre magekreftutvikling og dårlig kliniske funksjoner og kan være nyttige biomarkører for å vurdere risiko for utvikling av GC. Nyere studier på japanske GC-pasienter har vist at øket ekspresjon av VEGF og p53-protein akkumulering er forbundet med intra-tumoral angiogenese (Takeuchi et al, 2000;.. Saito et al, 1999) og dårlig prognose (Skatani, et al. , 2000; Ikeguchi, et al, 2000;.. Maeda, et al, 1998). Rajnkova rapportert at økt uttrykk av iNOS kan fremme magekreft progresjon ved å gi en selektiv vekst fordel til kreftceller med ikke-fungerende p53. (Rajnkova, et al., 2001)
tredje observasjon i denne studien var at økt uttrykk av iNOS og VEGF og p53 protein akkumulering skjedde med en høy frekvens i mage biopsiprøver med IM. IM, som kan defineres som utskifting av mageslimhinnen ved kjertler som har histologisk, histokjemisk og fysiologiske egenskaper av tynntarmen, har vært sterkt assosiert med magekreft. De foreliggende resultatene viste at IM var en ustabil scene med aktive molekylære endringer, og videre analyse for å sammenligne disse endringene med normal tynntarm vil gir mer informasjon om betydningen av IM i magekreftutvikling.
Slutt denne studien viste at positive farging priser av iNOS var korrelert godt med GC lymfeknutemetastase, økt uttrykk av VEGF og p53 protein akkumulering var relatert med TNM etapper og GC differensiering. Disse funnene tyder på at p53, iNOS og VEGF kan være nyttige biomarkører for GC aggressivitet. Det molekylære grunnlaget for den observerte uttrykk for iNOS og VEGF og p53 protein oppbygging og deres roller i utviklingen av mage forstadier til kreft og angeogenesis krever å bli nøye undersøkt i laboratoriet og oppfølgingsstudier.
Forkortelser
De anvendte forkortelser er:
CSG, kronisk overfladisk gastritt
CAG:
kronisk atrofisk gastritt
DYS:
dysplasi
GC:
adenokarsinom i ventrikkel
iNOS:
induserbar nitrogenoksid syntase

IM:
intestinal metaplasi
VEGF.
vaskulær endotelial vekstfaktor
Erklæringer
Takk
Dette arbeidet ble støttet delvis av. National Outstanding Young Scientist Award of China 30025016, State Key Prosjekt til grunnforskning G1998051206 (Kina) og Foundation of Henan utdanningsutvalget
Forfattere 'originale legges filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes originale innsendte filer for bilder. 12885_2001_28_MOESM1_ESM.doc Forfatteroriginalfilen for figur 1 12885_2001_28_MOESM2_ESM.doc Forfatteroriginalfilen for figur 2 12885_2001_28_MOESM3_ESM.doc Forfatteroriginalfilen for figur 3

• Support vektor maskin modell for diagnostisering av lymfeknutemetastaser i magekreft med multidetector computertomografi: en foreløpig study
• Kombinerte funksjoner basert på MT1-MMP uttrykk, CD11b + immunocyttene tetthet og LNR forutsi klinisk utfall av magekreft