Экспрессия р53, адаптивные синтетазы оксида азота и фактора роста эндотелия сосудов в желудочном предраковых и раковых поражений: корреляция с клиническими признаками

Экспрессия р53, индуцируемого синтазы окиси азота и фактора роста эндотелия сосудов в желудочном предраковых и раковых поражений: корреляция с клиническими признаками
Аннотация
Справочная информация
рост и метастазирование опухолей зависит от развития адекватного кровоснабжения с помощью ангиогенеза. Недавние исследования указывают на то, что индуцируемый синтаза оксида азота (иОАС), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), и опухолевого супрессора р53 являются фундаментальными стыковые маркерами ангиогенный процесс. Избыточная экспрессия иСОА и VEGF было показано, индуцирует ангиогенез в опухоли. P53 подавляет ангиогенез понижающего регулирования VEGF и INOS. Корреляция экспрессии р53, VEGF и иСОА и клинические признаки в желудочном канцерогенезе, однако, не был хорошо охарактеризован.
Методы
Выражение р53, иСОА и VEGF в желудочном предраковых и раковых поражений и его связи с клинические признаки определяли с помощью иммуногистохимии (авидин-биотин-пероксидаза комплексный метод) на 55 случайно выбранных пациентов GC и 60 бессимптомных субъектов от массового опроса, в районе с высокой заболеваемостью для GC в провинции Хэнань, севере Китая.
Результаты
положительные темпы immunostainig для р53, иСОА и VEGF в желудочных карцином были 51%, 44% и 51%, соответственно, и хорошо коррелируют с этапами TNM, но не показали заметных различий между группами с различными степенями стенки желудка глубина вторжения с помощью ГХ. Положительная реакция иммунное для белка INOS значимо коррелировали с метастазов в лимфатических узлах (р = 0,019; коэффициент корреляции Спирмена). Накопление белка р53 была выше в слабо дифференцированной карциномы желудка, чем в хорошо дифференцированной один. В биопсии желудка, не наблюдалось никакого положительного immunosatining для р53, иСОА и СЭФР в гистологически нормальной ткани и хронический поверхностный гастрит (CSG). Тем не менее, р53, иОАС и СЭФР положительное иммунное окрашивание наблюдалось в тканях с различными уровнями серьезности поражений хронического атрофического гастрита (CAG), кишечной метаплазией (ИМ) и дисплазии (DYS), а положительные темпы повышался при прогрессировании поражения от CAG к IM в DYS. Высокий случайна положительные и отрицательные темпы иммунное для р53, иСОА и VEGF наблюдалась как в образцах биопсии с CAG, IM и DYS от бессимптомных субъектов и в желудочном раковой ткани от больных GC.
Выводы
Представленные результаты показали, что накопление белка р53 и повышенную экспрессию иСОА и VEGF может быть ответственным за рака желудка и агрессивности опухоли рака желудка.
аденокарциномы желудка (GC) является одним из наиболее распространенных злокачественных заболеваний в Китае. Хотя GC был отклонен в его смертности, остается ведущей причиной смертности от онкологических заболеваний в этой стране (Паркин и др, 1992;. Всемирная организация здравоохранения, 1994; Nomura A, 1996). Желудочный канцерогенез рассматривается как многоэтапный прогрессивный процесс. Ранний показатель для субъекта, предрасположенных к GC ненормально гиперпролиферация эпителиальных клеток желудка, таких, как хронический атрофический гастрит (CAG), DYS и кишечной метаплазией (IM), которые рассматривались в качестве предраковых поражений GC (вы и др., 1993; КОРРЕА Р, 1992). Тем не менее, информация о механизме канцерогенеза желудка является весьма ограниченным.
Рост и метастазирование опухолей зависит от развития адекватного кровоснабжения через ангиогенеза. Недавние исследования указывают на то, что индуцируемый синтаза оксида азота (иОАС), фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), и опухолевый супрессор р53 являются фундаментальными стыковые создатели процессе ангиогенеза (Ambs и др, 1994;.. Jekins и др, 1995; Форрестер и др ал, 1996;.. Chiarugi и др, 1998). иОАС является одной из изоформ синтазы оксида азота, который катализирует образование оксида азота, регулятор проницаемости сосудов. СЭФР представляет собой димерный гликопротеин и имеет специфическую активность митогенетический для эндотелиальных клеток. Избыточная экспрессия иСОА и VEGF может вызвать ангиогенеза в опухолях. P53 подавляет ангиогенез понижающего регулирования VEGF и INOS. Мутант р53 потенцирует протеинкиназа С индукцию экспрессии VEGF (Zhang и др., 2000). В качестве модели туморогенности с использованием клеток, фибробластов, потеря p53 дикого типа и трансфекция активированных привело к RAS повышению экспрессии VEGF (Devavrata и др., 1995). Переходная трансфекция р53 дикого типа и клиновидного ЦСИ было установлено, оказывают противоположные эффекты на активность промотора гена человека VEGF в глиобластомы человека и трансформированные клетки плода почки человека (Devavrata и др., 1995). Тем не менее, потому что p53 дикого типа не репрессировать гипоксией индуцированную транскрипцию гена VEGF в стабильно трансфицированных человеческой карциномы ободочной и клеток Гепатобластома человека с индуцируемого системой экспрессии слитого белка р53-эстроген-рецептор (Ambs и др., 1998), его было предположено, что существует необходимость осторожности в интерпретации функции р53 на основе клеток скоротечно избыточно экспрессирующих этот белок. Тем не менее, мутантный р53 коррелирует с повышенной экспрессией VEGF при раке легкого человека (Ambs и др., 1994), и колоректального рака (Ambs и др., 1999) с помощью иммуногистохимического окрашивания хирургических образцов. Сообщалось, что дисфункция p53 /МДМ-2 пути можно найти в более чем две трети angiosarcomas; Таким образом, мутант р53 влияет на развитие ангиосаркомой не только путем воздействия на рост и контроль апоптозу, но и повышающей регуляции VEGF (Chinrugi и др., 1998). Мы предположили, что изменения р53, иОАС и экспрессия VEGF может способствовать рака желудка и влияют на клиническое поведение GC с помощью ангиогенеза. Корреляция экспрессии р53, VEGF и иОАС и клинические признаки желудочного канцерогенеза, однако, не был хорошо охарактеризован.
Чтобы охарактеризовать изменения р53, иОАС и экспрессия VEGF в канцерогенезе желудка человека, данное исследование было предпринято с целью определить уровень белка р53, иСОА и VEGF в нормальных тканях и ткани с различными важностей поражений CSG, CAG, DYS, IM и GC с и без узла метастаза лимфатический из хирургически иссекают человека ГХ и биопсии желудка от бессимптомных субъектов , Испытуемые из Linzhou и близлежащих графство Huixian в провинции Хэнань, области с высокой заболеваемостью для GC в северном Китае.
Материалы и методы
пациентов
Настоящее исследование вошли 55 случайным образом отобранных пациентов ГХ и 60 symptom- бесплатные предметы из массового опроса в районе с высокой заболеваемостью для GC. Пятьдесят пять пациентов GC были проведены операции на желудке рака в народной больнице Linzhou (п = 26), а второй филиал больницы Хэнань медицинского университета (п = 29) с 1996 по 1998 год Перед хирургическим вмешательством, ни один из пациентов не получил каких-либо видов химической или лучевой терапии. Средний возраст пациентов составил 61 лет (30 ~ 77 лет). Образцы рака были классифицированы на основе TNM в качестве стадии Т1 (19 больных, 35%), Т2 (14 больных, 25%), Т3 (12 пациентов, 22%) и Т4 (10 больных, 18%). Опухоли были гистологически классифицировалось как хорошо дифференцированной (15 больных, 27%), умеренно дифференцированные (14 больных, 25%) и слабо дифференцированной (26 больных, 47%). Из 55 пациентов, 35 произошло локальное метастазировании в лимфатические узлы (64%). Желудочные биопсии были взяты из 60 бессимптомных пациентов, которые выразили готовность принять участие в обычном эндоскопического скрининга рака пищевода и желудка в Huixian, Китай. Ни один процесс отбора не был вовлечен. Из 60 обследованных было 35 мужчин и 25 женщин. Средний возраст испытуемых составлял 59 лет (от 28 ~ 70 лет). Биопсии были взяты из каждого привратника желудка от каждого субъекта.
Обработка Tissue
Все хирургическим путем резецированные образцы и образцы биопсии фиксировали 10% нейтральным формалином, внедренный с парафином, и серийно разрезали на 5 мкм. Секции были установлены на слайдах histostick покрытием. Четыре или пять соседних лент были собраны для гистопатологического анализа (гематоксилином и эозином пятна) и для иммуногистохимического окрашивания.
Гистопатологический анализ
Гистопатологическая диагноз для желудка эпителии было сделано в соответствии с клеточными морфологическими изменениями и архитектуры тканей с использованием ранее установленных критериев (Wang и др, 1994;.. Вы, и др, 1993). Короче говоря, CSG: воспаление проявляется мягким лимфоцитами и плазменно-клеточной инфильтрацией; CAG: железистый морфология исчезла частично или полностью отсутствует в слизистой оболочке и замещается соединительной тканью, между железистой пространство пропитывали в основном плазматическими клетками и лимфоцитами; DYS: характеризуется ядерной атипии с или без архитектурных аномалий в эпителии желудка, но без вторжения; IM: подтверждается наличием бокаловидных клеток в слизистой оболочке желудка; Аденокарцинома (переменный ток):. вторжение в неопластических клетках желудка через базальную мембрану
иммуногистохимическое окрашивание
антителом против р53 представляет собой моноклональное мышиное анти-сыворотка против р53 человеческого происхождения, и признается, как дикого типа и мутантных р53 ( Ab-6, онкогенов Наука, Манхассет, штат Нью-Йорк). Анти-иОАС антитело представляет собой моноклональное мышиное анти-сыворотка против С-концевого домена иСОА человеческого происхождения (SC-7271, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Анти-VEGF-антитело представляет собой поликлональные кроличьи антитела против VEGF в сыворотке крови человеческого происхождения и признает аминоконцевой эпитоп найденный в СЭФР 121, 165, 189 и 206 (Ab-2, онкогенов Наука, Манхассет, штат Нью-Йорк). Комплексный метод авидин-биотин-пероксидаза был использован для иммунное р53, иСОА и VEGF. Вкратце, после депарафинизации, инактивирующих эндогенной активности пероксидазы и блокирующего перекрестную реактивность с нормальной сывороткой (Vectastain Elite Kit; Vector, Burlingame, CA), срезы инкубировали в течение ночи при 4 □ с разбавленным раствором первичных антител (1: 1000 р53, 1: 200 на иСОА и 1: 100 для VEGF). Расположение первичных антител было достигнуто за счет последующего применения биотинилированного анти-первичным антителом, авидин-биотин комплекса, конъюгированного с пероксидаза хрена и ферменты диаминобензидино (Vectastain Elite Kit, Vector, Burlingame, CA). Срезы контр-окрашивали гематоксилином. Отрицательные контроли были установлены путем замены первичного антитела ПБС, а затем нормальной мыши или сывороткой кролика. Известные иммунным окрашиванием-положительные слайды были использованы в качестве положительного контроля.
Специфического окрашивания для каждого белка был отнесен к категории либо положительным, либо отрицательным на основании наличия коричневого цвета окраски. Более 10% клеток положительно окрашенных оценивались как положительные. Очистить окрашивание ядер (р53), цитоплазмы и клеточной мембраны (СЭФР и иОАС) был критерием положительной реакции (Wang и др., 1994). Все иммунным слайды наблюдались двумя патологи (L D Ван и L H Цзяо). Слайды с различным диагнозом по двум патологи считывали снова (менее 5%), до тех пор, согласованный диагноз не был сделан.
Статистический анализ
Х 2 тест использовали для проценте образцов с положительной окраски , Спирмен тест корреляции и линейная тенденция испытаний были использованы для корреляции между положительными ставками и различных степеней тяжести поражений (р &ЛТ; 0,05 считается значительным)
Результаты
Гистопатологически, все 55-хирургическим резецированные желудка образцы были подтверждены как. аденокарциномы. Из 55 пациентов GC, 11 случаев произошло вторжение в пределах к югу от слизистой оболочки, 44 с цельной мышечный слой. Из 60 гистологически исследованных образцов, 10 были диагностированы как обычно, 15, как CSG, 9, как ПНП, 16, как IM с CAG, и 10, как DYS (таблица 1) .table 1 иммунореактивности р53, иСОА и VEGF в желудочном эпителии нормальной и эпителий с различными важностей поражений
<й>
<й>
Р53

иСОА

VEGF

<й>
No. из проанализированных проб

No. положительных пятен п (%) завод
No. положительных пятен п (%) завод
No. положительных пятен п (%)

NormalA
10
0 (0)
0 (0)
0 (0)
CSGb
15
0 (0)
0 (0)
0 (0)
CAGC
9
1 (11)
0 (0)
2 (22)
IMD
16
3 (19)
2 (13)
5 (31)
DYSe
10
3 (30)
4 (40) <бр> 5 (50)
GCF
55
28 (51)
24 (44) 28
(50)
P53: C: Ф.П. = 0,02 d :: Fp = 0,013; иОАС: C: F р = 0,03 d: F р = 0,015; VEGF: C: F р = 0,014 d: F р = 0,015
Положительное иммунное окрашивание для p53, наблюдалась иОАС и VEGF в эпителиальных клеток желудка и раковые клетки с различными скоростями в поражениях CAG, DYS, IM и GC. Но, положительный иммуногистохимическое р53, иСОА и VEGF не наблюдалось в нормальном желудочном эпителиальной ткани и CSG. На рисунке 1, 2 и 3 показывает, представитель р53, ИНОС и VEGF иммунным окрашиванием в GC. р53 иммунореактивности находился в ядрах, VEGF и иОАС иммунореактивности были расположены в основном в цитоплазме и клеточной мембраны. иОАС иммунное была подтверждена с помощью Вестерн-блоттинга на части ИНОС положительных и отрицательных слайдов (три горки для каждого), и последовательные результаты были получены для ИНОС иммуногистохимии и вестерн-блоттинга (данные не показаны). Положительный показатель иммуногистохимическое р53 была очень низкой в ​​CAG, и немного увеличилась в IM и DYS, а также значительно увеличилось в GC (таблица 1). Аналогичные результаты наблюдались в иСОА и VEGF (таблица 1). P53 положительная норма immunosatining в хорошо дифференцированной GC была ниже, чем в слабо дифференцированной GC (р = 0,012, таблица 2). иОАС положительное окрашивание было похоже среди GC с разной степенью дифференциации. Хотя VEGF иммунным скорость в слабо дифференцированной GC была выше, чем в хорошо дифференцированной GC, разница не было статистически значимым (таблица 2). Рисунок 1 Иммунологическое р53 при раке желудка. Иммунореактивности находится в ядрах клеток (стрелки). 20X
Рисунок 2 иммунным иСОА при раке желудка. Иммунореактивности расположен в основном в цитоплазме клеток и ядерной мембраны. 10X
Рисунок 3 иммунным VEGF при раке желудка. Иммунореактивности находится в цитоплазме и клеточной мембране. 10X
Таблица 2 иммунореактивность INOS, p53 и VEGF в GC и его корреляция с различной степенью дифференциации
<й>
<й>
P53 *

иОАС

СЭФР

Дифференциация степень GC

No. из проанализированных проб

No. положительных пятен п (%) завод
No. положительных пятен п (%) завод
No. положительных пятен п (%)

хорошо differentiateda
15
5 (33)
7 (47)
6 (40)
Умеренно-differentiatedb
14
6 (43)
5 (36)
6 (43)
Плохо-differentiatedc
26
17 (66) 12
(46)
16 (61) *
а: р = 0,012
иОАС положительная норма иммунное в случаях с глубоким вторжением в GC (через мышечные слои) был выше, чем в тех, с поверхностным вторжением (в подслизистой), но разница была не имеет существенного значения (таблица 3). P53 и VEGF иммунное был похож на GC пациентов с поверхностной и глубокой invasion.Table 3 иммунореактивности р53, иСОА и VEGF и его корреляции с глубиной инвазии рака желудка
<й>
<й>
Р53

INOS

СЭФР

Invasion глубины GC

No. из проанализированных проб

No. положительных пятен п (%) завод
No. положительных пятен п (%) завод
No. положительных пятен п (%)

В пределах слизистой оболочке
11
5 (46)
3 (27)
6 (55)
мышечный слой
44
23 (52) 21
(48)
22 (50)
иОАС скорость в случаях с метастазов в лимфатических узлах immunosatining был выше, чем у пациентов без метастазов в лимфатических узлах (р = 0,014, таблица 4 ). Тем не менее, не было никакой разницы наблюдается p53 и VEGF между корпусами и без узла metastasis.Table лимфатического 4 иммунореактивности р53, иСОА и VEGF и его корреляции с лимфоузлов метастазирования рака желудка
<й>
<й>
Р53

иСОА *



VEGF узел метастаз лимфа
<бр> Нет. из проанализированных проб

No. положительных пятен п (%) завод
No. положительных пятен п (%) завод
No. положительных пятен п (%) завод
Да
35
18 (51) 19
(55) не
21 (60)
Нет
20
10 (50)
5 (25)
7 (35)
* р = 0,014
P53 скорость иммунным в случаях с TNM класса T1 был ниже, чем у пациентов с TNM класса Т2, Т3 и Т4 (Т1: Т3, р = 0,023; Т1: Т4, р = 0,012). Аналогичные результаты наблюдались в СЭФР (T1: T2 и T2: T3, р = 0,015; Т1: Т4, р = 0,014; Т2: Т4, р = 0,01, Таблица 5). Тем не менее, не было никакой разницы для INOS иммунным окрашиванием между этими случаями с различными TNM stages.Table 5 иммунореактивности р53, иСОА и VEGF и его корреляции с клинической классификацией TNM
<й>
<й>
P53 *

иОАС

СЭФР **

TNM этапах

No. из проанализированных проб

No. положительных пятен п (%) завод
No. положительных пятен п (%) завод
No. положительных пятен п (%)

T1
19
7 (37) а
7 (37)
8 (42) а
T2
14
6 (43) б
4 (29)
4 (29) б
T3
12
8 (67) с
7 (58)
8 ( 67) с
T4
10
7 (70) d
6 (60)
8 (80) d
* а: р = 0,023, а: дп = 0,012; ** А: Ь и Ь: с р = 0,015, а: d р = 0,014, б: d р = 0,01
Чем выше совпадением экспрессия р53, наблюдалась иОАС и VEGF в GC. Из 55 рассмотренных случаев было 20 случаев, показывающие положительное окрашивание как для p53 и иСОА (36%), 23 случая, показывающие отрицательное окрашивание на обоих р53 и иСОА (42%) (p = 0,005, таблица 6), 19 случаев с положительными окрашивания как для p53 и VEGF (35%) и 18 случаев, показывающих отрицательное как для p53 и VEGF (33%) (р = 0,01, таблица 7). Эти корреляции были significant.Table 6 случайна экспрессия р53 и белка INOS в раке желудка
<й>
р53 (+)

p53 (-)

<й>
п (%)

п (%)

иОАС (+)
20 (36)
4 (7)
иОАС (-)
8 (15)
23 (42)
X2 = 15,68, р = 0,005
Таблица 7 случайна экспрессия р53 и белка VEGF в желудочном карциномы
<й>
р53 (+)

p53 (-)

<й>
п (%)
<бр> п (%)

VEGF (+)
19 (35)
9 (16)
VEGF (-)
9 (16)
18 (33)
X2 = 6,56, р = 0,01
Обсуждение
интересное наблюдение в этом исследовании было то, что иммунореактивности р53, иОАС и VEGF произошло в ранней стадии рака желудка. Положительные иммунным окрашиванием клетки неизменно связаны с клеточной пролиферативной активностью. С поражения прогрессировал от нормали к CSG в CAG для мгновенного обмена сообщениями в DYS и GC, положительные темпы иммуногистохимическое р53, иОАС и VEGF значительно увеличилось, возрастающую тенденцию к р53, иОАС и VEGF имел хорошую линейную корреляцию с поражениями прогрессии. Представленные результаты показали, что накопление белка р53 и повышенную экспрессию иОАС и VEGF могут быть важными молекулярные события, связанные с ранней стадии рака желудка.
Еще одно интересное наблюдение заключалось в том, а высокие положительные темпы случайными иммуногистохимическое р53 и иСОА (36 %) и p53 и СЭФР (35%) наблюдалось (таблица 6 и 7). Этот результат согласуется с выводами, содержащимися в легких и ободочной карциномы человека (Ambs и др., 1999). Хотя p53 антитело, используемое в данном исследовании, не может дифференцировать p53 дикого типа из мутанта р53, предыдущие исследования показали, что белок р53 обнаружен иммуногистохимии, кажется, наиболее представительным мутантного р53. Накопление р53 является показателем потери функции р53-супрессора опухолей. Обе мутации и белок-белковых взаимодействий может привести к накоплению р53 (Wang и др., 1994). Учитывая то, что накопление белка р53 коррелирует с плохо дифференциацией и Т2, Т3 и Т4 TNM стадии ГХ, мы пришли к выводу, что накопление белка р53 в этом исследовании, может привести к потере контроля пролиферации клеток и ингибирования для иСОА и VEGF, возможно, из-за p53 мутации гена. Таким образом, высокая случайна экспрессия иСОА и VEGF и накопление белка р53 могут быть важными событиями для повышения желудочного канцерогенеза и плохо клинические особенности и могут быть полезными биомаркеров для оценки риска для развития GC. Недавние исследования японских пациентов GC показали, что повышенная экспрессия VEGF и накопление белка р53 связаны с интра-опухолевого ангиогенеза (Такеучи и др., 2000;. Сайто и др, 1999) и плохой прогноз (Skatani и др. , 2000; Ikeguchi и др., 2000;. Маэда, и др, 1998). Rajnkova сообщил, что повышенная экспрессия иСОА может способствовать прогрессированию рака желудка, обеспечивая селективное преимущество роста по отношению к опухолевым клеткам с нефункционирующее p53. (Rajnkova, и др., 2001)
Третье наблюдение в этом исследовании, было то, что повышенная экспрессия иСОА и VEGF и накопление белка р53 происходит с высокой частотой в желудочной биопсии образцах с IM. IM, который может быть определен как замена слизистой оболочки желудка железами, которые имеют гистологические, гистохимические и физиологических характеристик тонкой кишки, была тесно связана с раком желудка. Представленные результаты показали, что IM является нестабильным стадией с активными молекулярными изменениями и дальнейшего анализа, чтобы сравнить эти изменения с нормальной тонкой кишке будет обеспечивает больше информации для значимости обмена мгновенными сообщениями в желудочном канцерогенезе.
Наконец, настоящее исследование показало, что положительные темпы иммунным иСОА хорошо коррелирует с GC метастазов в лимфатических узлах, повышенная экспрессия VEGF и накопление белка p53 был связан с этапами TNM и GC дифференциации. Эти данные показывают, что p53, иОАС и VEGF могут быть полезными биомаркеры для GC агрессивностью. Молекулярные основы наблюдаемого выражения иСОА и VEGF и накопление белка р53 и их роли в прогрессии желудочного предраковых поражений и angeogenesis требует, чтобы быть тщательно исследованы в лаборатории и последующих исследований.
Сокращения
сокращения, используемые являются:
CSG, хронический поверхностный гастрит


CAG:
хронический атрофический гастрит


DYS:
дисплазия


GC:
аденокарциномы желудка


иОАС:
индуцибельной синтазы окиси азота


IM:
кишечная метаплазия


VEGF:.
эндотелиальный фактор роста сосудистого


декларациях
Благодарности
Эта работа была частично поддержана:. Национальный выдающийся молодой ученый премии Китая 30025016, Государственный ключевой проект фундаментальных исследований G1998051206 (Китай) и Фонд Комитета по образованию Хэнань
Авторы "оригинал представлены файлы для изображений изображения Ниже приведены ссылки на оригинальные файлы представленных авторов для изображений. 'Исходный файл для фигурного 1 12885_2001_28_MOESM2_ESM.doc Авторского 12885_2001_28_MOESM1_ESM.doc авторов исходного файла для исходного файла Рисунок 2 12885_2001_28_MOESM3_ESM.doc Авторского на рисунке 3

• Модель машины поддержки вектор для диагностики метастазов в лимфатических узлах при раке желудка с Multidetector к…
• Комбинированные функции, основанные на MT1-MMP экспрессии, плотность CD11b + иммуноцитов и LNR предсказывают клиниче…