EBNA1 bindande och epigenetisk reglering av gastrokine tumörsuppressorgener i gastric cancerceller

EBNA1 bindande och epigenetisk reglering av gastrokine tumörsuppressorgener i gastriska karcinomceller Bild Sammanfattning
Bakgrund
Epstein-Barr-virus (EBV) infekterar latent ~ 10% av gastriska karcinom (GC). Epstein-Barr-Nuclear Antigen 1 (EBNA1) uttrycks i EBV-associerad GC, och kan binda värd-DNA, där det kan påverka cellulär genreglering. Här visar vi att EBNA1 binder direkt till DNA uppströms divergent transkriberade GC specifika tumörsuppressorgener gastrokine en (GKN1) och gastrokine 2 (GKN2).
Metoder
Vi använder Chip-Seq, ChIP-qPCR, och EMSA för att visa att EBNA1 binder direkt till GKN1 och GKN2 promotor locus. Vi genererar AGS-EBV, och AGS-EBNA1 cellinjer att studera effekterna av EBNA1 på GKN1 och GKN2 mRNA-expression med eller utan 5 'azacytidin behandling.
Resultat
Vi visar att gastrokine gener transkription tystas genom DNA-metylering . Vi visar också att latent EBV-infektion minskar ytterligare GKN1 och GKN2 uttryck i AGS gastric cancerceller, och att siRNA utarmning av EBNA1 lindrar delvis detta förtryck. Men ektopisk uttryck för EBNA1 ökat något GKN1 och GKN2 basal mRNA-nivåer, men minskat sin lyhördhet för demetyliseringsmedel.
Slutsatser
Dessa resultat visar att EBNA1 binder till den divergerande promotorn av GKN1 och GKN2 gener i GC-celler, och föreslår att EBNA1 bidrar till den komplexa transkriptions- och epigenetisk avreglering av de GKN1 och GKN2 tumörsuppressorgener i EBV positiv GC.
Nyckelord
EBV EBNA1 Gastric carcinoma Gastrokine ChIP-Seq epigenetisk Inledning
Epstein-Barr-virus ( EBV) är ett humant gammaherpesvirus som finns i ett stort antal olika lymfoida och epitelcellinjer maligniteter, inklusive Burkitts lymfom, Hodgkins sjukdom, nasofaryngealt karcinom (NPC), och efter transplantation lymfoproliferativ sjukdom (översikt i [1, 2]). På senare tid har EBV visat i ~ 10% av alla magcancer (GC) fall i hela världen [3, 4]. EBV-associerad GC har visats vara en monoklonal utväxt av EBV-infekterade gastriska epitelceller och anses vara en distinkt subtyp av GC [5, 6]. Eftersom förekomsten av GC är nära till 900.000 personer per år [7], kan EBV-associerad GC vara bland de vanligaste EBV-associerade cancerformer.
EBV positiva gastric cancerceller, EBV etablerar en variant typ I latens, där EBV-transkription är begränsad till den kanoniska typ i-gener EBNA1, Ebers, BART familjen icke-kodande RNA och miRNA, men med några ytterligare uttryck av LMP2A [6, 8-11]. Bland dessa latens gener, är EBNA1 den enda viralt kärnprotein som upptäcks i EBV-associerad GC. EBNA1 krävs för upprättandet av den latenta episomala infektion och för långsiktig överlevnad av latent infekterade celler [12-15]. EBNA1 är ett DNA-bindande protein som binder till både virala och värd kromosomala ställen. Bindningsställena i det virala genomet har präglats för viktiga funktioner i replikation och transkriptionell kontroll av viral genexpression. Emellertid är funktionen av EBNA1 sekvensspecifik bindning till värdkromosomen mindre väl förstådd. Medan EBNA1 kan binda till promotorregionerna för flera värdgener, är det fortfarande oklart om dessa gener är föremål för EBNA1 reglering [12, 16, 17]. Överuttryck av EBNA1 DNA-bindande domänen, vilken fungerar som en dominant negativ i EBV-infekterade celler, kan hämma cellviabilitet i oinfekterade celler, vilket antyder att EBNA1 binder till och reglerar cellulära gener som är viktiga för cellöverlevnad [18]. Ektopiskt uttryck av EBNA1 har visat sig påverka värdcell-mRNA-uttryck [19], men det är inte klarlagt om dessa effekter är direkt eller indirekt relaterade till specifika EBNA1 bindningsställen i det cellulära genomet.
I en tidigare studie använde vi chip-punkter metoder för att analysera genomet hela anriknings platser av EBNA1 i latent infekterade Raji Burkitts lymfomceller och identifierat ett flertal cellulära platser bundna av EBNA1 [17]. Bland dessa EBNA1 cellulär anrikningsställen vi identifierat en betydande EBNA1 bindningstopp belägen vid gastrokine 1 (GKN1) och gastrokine 2 (GKN2, även känd som trefoil faktor interagerande protein (TFIZ1)) genklustret. GKN1 och GKN2 har identifierats baserat på deras ofta förlust av uttryck i neoplastiska gastric carcinoma epitelceller, jämfört med normal gastrisk vävnad [20-22] (översikt i [23]). Flera nya studier har beskrivit antiproliferativa och anti-invasiv aktivitet för GKN1 i gastric epitelceller, som tillsammans med sin täta uttrycksförlust i cancer, föreslår den fungerar som tumörsuppressor specifika för gastric epitel [21, 24-28]. GKN1 kan hämma cellmigration och invasion vid sårläkning, transwell och Matrigel-analysen, samt förändrar cellmarkörer associerade med den epiteliala-mesenkymala övergång [26]. GKN1 och GKN2 gener ligger i omedelbar närhet och transkriberas i motsatta riktningar, vilket tyder på att de sannolikt delar en dubbelriktad promotor, och är föremål för samordnad reglering av delade transkriptionsreglerande faktorer (översikt i [23]).
I detta studie visade vi den direkta bindningen mellan EBNA1 och GKN1-GKN2 loci och undersökt GKN1 och GKN2 genuttryck modulering av EBV-infektion och EBNA1 protein. Våra resultat tyder på att EBV-infektion kan ytterligare hämma GKN1 och GKN2 uttryck, och att förlust av EBNA1 kan underlätta epigenetiska de-förtryck av GKN2 transkription. Vi observerade också förhöjd DNA metylering nivåer GKN1 och GKN2 promotorregioner, och en potentiell roll för EBNA1 i avregleringen och epigenetiska förtryck av denna tumörsuppressorgen locus.
Resultat
Identifiering av en hög beläggning EBNA1 bindningsställe på GKN1 -GKN2 locus av Chip-Seq
Tidigare publicerade Chip-Seq data från Raji BL celler visade ett begränsat antal av höganrikat EBNA1 bindningsställen baserade på toppresultat och läsa siffror [17]. Ytterligare inspektion avslöjade en stark EBNA1 bindningsställe beläget uppströms om startställena för de divergent transkriberade GKN1 och GKN2 gener (figur 1A, övre spår). En liknande EBNA1 bindande topp observerades i en separat Chip-Seq experiment i EBV positiv nasofarynxcancer cellinje C666-1 (full Chip-punkter data som ska publiceras på annat håll), vilket indikerar att denna bindning sker i både epitel-, samt lymfoid celltyper (Figur 1A, lägre spår). I mitten av toppen var belägen ~ 5 kb från GKN2 och ~ 15 kb från GKN1 transkriptionsstartställena. Chip-qPCR användes för att validera EBNA1 bindning vid GKN1-GKN2 promotorregionen i både Raji och C666-1 celler (Figur 1B och C). qPCR indikerade att EBNA1 bunden till GKN1-2 plats med liknande effektivitet till en tidigare validerad EBNA1-bindningsställe vid PITPNB promotorn. qPCR uppgav också att EBNA1 bindning till GKN1-GKN2 var specifik eftersom det inte fanns någon påvisbar EBNA1 bindning vid antingen cellulära GAPDH locus eller EBV OriLyt kontrollregioner, som väntat (Figur 1B och C). Den förmodade EBNA1 bindningsstället vid GKN1-GKN2 lokuset identifierades genom inriktning med en konsensusbindningsställe i den EBV familjen av upprepningar (FR) regionen, och denna sekvens testades sedan för direkt bindning till EBNA1 medelst EMSA (Figur 1D). Renat rekombinant EBNA1 DBD-protein analyserades med avseende på bindning till sonderna innehåller den GKN1-GKN2 plats (GKN1 /2), FR, eller en negativ kontrollsekvens som saknar en konsensus EBNA1 bindningsställe. Vi fann att EBNA1 DBD bunden effektivt till GKN1-GKN2 plats, liksom till FR konsensus, men inte binda till kontrollsekvensen. Dessa fynd tyder på att EBNA1 samverkar med GKN1-GKN2 promotorregionen genom direkt DNA-bindande med EBNA1 DBD. Figur 1 EBNA1 binder vid GKN1 och GKN2 promotor locus. (A) Den UCSC genomet webbläsare användes för att kartlägga EBNA1 bindningstopp genereras från Raji och C666-1 ChIP-seq vid GKN1 och GKN2 genloci. RefSeq kommenterade transkript indikeras under Chip-Seq topp. (BC) Realtime-PCR validering av Chip-punkter data för EBNA1 bindningsställena på GKN1 /2 delade promotorregionen: EBNA1 (röda staplar) eller kontroll-IgG (blå staplar) analyserades med chip i Raji (B) eller C666-1 celler (C) för DNA-bindande vid GKN1 /2 sida, PITPNB promotor, GAPDH eller EBV Ori-Lyt. (D) EMSA-analys av 32P märkta sonderna innehåller Control, GKN1 /2 webbplats eller EBV FR. Varierande mängd av EBNA1 DBD-protein användes i bindningsreaktionen (0, 100, 300, 900 ng). Pilspetsar representerar EBNA1 specifika bundna komplex eller fri prob som indikeras. Probsekvensen av GKN1 /2 plats och FR indikeras med sekvens homologa (röda bokstäver) mellan GKN1 /2 och FR. Den negativa kontrollen (Ctrl) sekvens också anges. Felstaplar anger standardavvikelse från medelvärdet (SDM) för n = 3.
GKN1 och GKN2 mRNA är mycket uttrycks i primär magen vävnad
Vi mätte nästa GKN1 eller GKN2 mRNA-nivåer i olika mag cancerceller linjer och i primär normal gastrisk vävnad av QRT-PCR (Figur 2). Vi fann att GKN1 och GKN2 uttrycks på mycket högre nivåer (~ 3 x 10 4 gånger) i primär magen vävnad än i någon av de testade cellinjerna (Figur 2A). Även vid mycket lägre nivåer än primär mage vävnad, GKN1 och GKN2 båda uttrycks i mätbara nivåer i AGS gastric carcinoma cellinjer, med GKN2 uttrycks vid högre nivåer än alla andra GC cellinjer, eller EBV positiv B-cell eller NPC cellinjer ( Figur 2B). Mycket låga nivåer av GKN1 eller GKN2 kunde detekteras i primär oral epitelial vävnad, vilket ytterligare indikerar att dessa gener är specifik för primära gastric-vävnad. Figur 2 GKN1 och GKN2 mRNA är mycket uttrycks i primär magen vävnad. RT-PCR utfördes för att analysera mRNA-nivån av GKN1 (blå staplar) eller GKN2 (röda staplar) i olika cellinjer inklusive GC-härledda GTL, MKN28, MKN74, SNU638, AGS, BL-härledda Raji, EBV immortalized LCL, EBV positiv NPC linje C666-1 eller primära mun epitelceller jämföra med (A) eller utan (B) primära mage vävnad. Felstaplar anger standardavvikelse från medelvärdet (SDM) för n = 3.
EBV latens minskar GKN1 och GKN2 mRNA uttryck i GC cellinjer
att testa effekten av EBV latent smitta GKN1 och GKN2 uttryck, vi genererade en AGS-cellinje som innehåller EBV B95.8 bacmid. AGS-cellinjen utvaldes för hygromycinresistens och GFP positivitet för att säkerställa att den innehöll bacmid komponenter. För att karakterisera AGS-EBV-cellinje, först analyserade vi EBV genuttrycket (Figur 3). Vi fann att AGS-EBV celler uttryckte detekterbara mRNA-nivåer av EBNA1, BARF0 och LMP2A, men inte LMP1, EBNA2 eller EBNA3C (Figur 3). Även EBV B95.8 bacmid saknar BART miRNA, dessa fynd överensstämmer med AGS-EBV-celler anta en variant av typ I latens genuttryck program med något uttryck av LMP2A, liknande den som observerades i EBV positiv magsäckscancer tumörvävnad [8, 10 ]. För att ytterligare karaktärisera AGS-EBV-celler, analyserade vi EBNA1 proteinuttryck genom Western blöt (figur 4A) och EBV-DNA kopienummer av qPCR (Figur 4B). EBNA1 detekterades som en enda låg abundans arter vid den förväntade molekylmassan (Figur 4A). EBV kopietal mättes genom att jämföra EBV Ori-Lyt DNA till cellulärt GAPDH (Figur 4B). Vi fann att AGS-EBV innehöll ~ 50% mindre kopior av det virala genomet jämfört med EBV positiva LCL. För att bestämma om EBNA1 behållit sin DNA-bindande aktivitet i AGS-EBV, utförde vi konventionella CHIP analyser (Figur 4C). Vi fann att EBNA1 bunden till EBV dyadsymmetri (DS) DNA, såväl som till den GKN1-GKN2-bindningsstället i AGS-EBV-celler. Vi frågade nästa om GKN1 eller GKN2 mRNA-nivåer påverkades av EBV latent infektion i AGS celler genom att jämföra RT-qPCR uttrycksnivåer i AGS förhållande till AGS-EBV-celler (Figur 4D). Vi fann att GKN1 och GKN2 var undertryckta ~ 3-8 gånger i AGS-EBV jämfört med AGS celler, vilket tyder på att EBV latens främjar eller stabiliserar transkriptions förtrycket av GKN1 och GKN2. Figur 3 Karakterisering av EBV-genuttryck i AGS-EBV-cellinjer. AGS, AGS-EBV positiv, och EBV-LCL testades med avseende på mRNA-expression genom QRT-PCR med primers för EBNA1, BARF0, LMP2A, LMP1, EBNA2 eller EBNA3C, såsom anges. Felstaplar indikerar standardavvikelse från medelvärdet (SDM) för n = 3.
Figur 4 EBV infektion av AGS-celler undertrycker GKN1 och GKN2 transkription. (A) Western blot-analys av EBNA1 proteinuttryck i AGS-EBV-celler jämfört med EBV-negativa AGS-celler utfördes med användning av antikropp för EBNA1 (överst) eller Actin (botten). (B) DNA kopieantal analyserades genom realtids-PCR för EBV Ori-Lyt DNA i förhållande till graden av cellulär GAPDH i AGS, AGS-EBV, och EBV-LCL-celler. (C) Chip och realtids-PCR-analys av EBNA1 (röda staplar) eller kontroll-IgG (blå staplar) för DNA-bindning på EBV platser, inklusive DS och Ori-Lyt eller cellulära platser, inklusive GKN1 /2 och GAPDH i AGS-EBV celler. (D) RT-PCR utfördes för att analysera mRNA-nivån av GKN1 eller GKN2 i AGS (blå staplar) eller AGS-EBV-celler (röda staplar). ** Anger p < 0,005. Felstaplar anger standardavvikelse från medelvärdet (SDM) för n = 3.
EBV ökar DNA-metylering beroende repression av GKN1 och GKN2 mRNA i GC cellinjer
GKN1 och GKN2 kan vara föremål för epigenetisk dämpning i GC och vävnad kultur cellinjer. För att utforska denna möjlighet undersökte vi om behandling med DNA-demetyliseringsmedel 5 'azacytidin (Aza) eller deacetylering medel (NaB) kombinerat med forbolester (TPA) skulle aktivera GKN1 eller GKN2 i AGS-celler (figur 5A). Vi fann att Aza behandling ledde till en ~ 10-faldig ökning i GKN2, och ~ 4-faldig ökning av GKN1 transkription i AGS behandlade celler. Däremot NaB /TPA-behandling producerade endast ~ 2 gånger aktivering av transkription. Dessa fynd tyder på att både GKN1 och GKN1 är under aktiv epigenetiska förtryck genom DNA-metylering. För att testa om EBV haft någon effekt på Aza inducerad aktivering av GKN1 eller GKN2, vi jämförde effekterna av Aza behandling på AGS förhållande till AGS-EBV-celler genom QRT-PCR (figur 5B). Vi fann att GKN1 och GKN2 effektivt aktiverades av Aza behandling i AGS celler, men i mindre utsträckning i AGS-EBV. I dessa experiment var Aza-inducerad aktivering av GKN2 helt elimineras, medan aktivering av GKN1 var endast delvis attenuerad. Aza-behandling ledde också till ~ 8,4-faldig ökning i EBNA1-mRNA-nivåer, vilket antyder att aza behandling stimulerar EBV lytiskt genuttryck i AGS-EBV-cellinjer. Dessa resultat antyder de EBV genprodukter förhindrar GKN2, och i mindre utsträckning GKN1 aktivering efter Aza behandling. Figur 5 EBV förstärker undertryckandet av GKN1 och GKN2 genuttrycket DNA-metylering. (A) AGS-celler behandlades med 10 pM Aza, eller 1 mM NaB och 20 ng /ml TPA under 48 timmar och analyserades med RT-PCR för GKN1 eller GKN2 expressionsnivån, jämfört med obehandlade AGS. (B) AGS-celler eller AGS-EBV-celler behandlade eller obehandlade med 10

• Långa icke-kodande RNA uttrycksprofilen i human magcancer och dess kliniska betydelser
• In silico analys av magcancer serieanalys av genuttryck bibliotek avslöjar olika profiler i samband med ethnicity