vinculativo EBNA1 e regulação epigenética de genes supressores tumorais gastrokine em gástrica carcinoma cells

ligação EBNA1 e regulação epigenética de genes supressores tumorais gastrokine em células de carcinoma gástrico
vírus Epstein-Barr Abstract
Fundo
(EBV) latente infecta ~ 10 % de carcinomas gástricos (GC). De Epstein-Barr Nuclear Antigen 1 (EBNA 1) é expresso em GC associada a EBV, e podem ligar-se DNA do hospedeiro, em que pode ter impacto regulação do gene celular. Aqui, mostramos que EBNA1 se liga diretamente ao DNA a montante dos genes supressores tumorais específicas do GC divergente transcritas gastrokine 1 (GKN1) e gastrokine 2 (GKN2).
Métodos
Nós usamos ChIP-Seq, Chip-qPCR, e EMSA para demonstrar que EBNA1 se liga diretamente ao GKN1 e GKN2 promotor local. Geramos AGS-EBV, e linhas de células AGS-EBNA1 para estudar os efeitos da EBNA1 na expressão GKN1 e GKN2 mRNA com ou sem 5 'azacitidina tratamento.
Resultados
Mostramos que genes gastrokine são transcricionalmente silenciados pela metilação do DNA . Nós também mostram que a infecção EBV latente reduz ainda mais a expressão GKN1 e GKN2 em células de carcinoma gástrico AGS, e que a depleção de siRNA de EBNA1 alivia parcialmente essa repressão. No entanto, a expressão ectópica de EBNA1 aumentaram ligeiramente os níveis basais GKN1 e GKN2 de ARNm, mas reduziram a sua capacidade de resposta ao agente de desmetilação.

Conclusões Estes resultados demonstram que EBNA1 se liga ao promotor divergente dos genes GKN1 e GKN2 em células de GC, e sugerem que EBNA1 contribui para a transcrição complexo e desregulação epigenética dos genes supressores de tumor GKN1 e GKN2 em GC EBV positiva.
Palavras-chave
EBV EBNA1 gástrica carcinoma Gastrokine ChIP-Seq epigenética Introdução
Epstein-Barr vírus ( EBV) é um gammaherpesvirus humana encontrada em uma ampla gama de doenças malignas linfóides e células epiteliais, incluindo o linfoma de Burkitt, doença de Hodgkin, carcinoma nasofaríngeo (CNP), e doença linfoproliferativa pós-transplante (revisto em [1, 2]). Mais recentemente, o EBV foi encontrado em ~ 10% de todos os casos de carcinoma gástrico (CG) em todo o mundo [3, 4]. -EBV associada GC foi demonstrado ser uma consequência monoclonal de células epiteliais gástricas infectados com EBV e é considerado como sendo um subtipo específico de GC [5, 6]. Porque a incidência de GC está perto de 900.000 pessoas por ano [7], GC associada ao EBV pode estar entre os cancros associados ao EBV mais prevalentes.
Em EBV células de carcinoma gástrico positivos, EBV estabelece um tipo de variante I latência, onde transcrição EBV está limitado ao tipo canónico eu genes EBNA1, Ébers família Bart ARN e miARNs não codificante, mas com alguma expressão adicional de LMP2A [6, 8-11]. Entre estes genes de latência, EBNA 1 é a única proteína nuclear virai que é detectado em GC associada a EBV. EBNA 1 é necessário para o estabelecimento da infecção latente epissomal e para a sobrevivência a longo prazo das células infectadas de forma latente [12-15]. EBNA 1 é uma proteína de ligação de ADN que se liga a ambos os locais cromossómicos virais e hospedeiras. Os locais de ligação no genoma viral foram caracterizados por funções essenciais na replicação e de controlo transcricional da expressão de genes virais. No entanto, a função da sequência-específica EBNA1 ligação ao cromossoma do hospedeiro é menos bem compreendido. Enquanto EBNA1 pode ligar para as regiões promotoras de vários genes do hospedeiro, não fica claro se estes genes estão sujeitos à regulamentação EBNA1 [12, 16, 17]. A sobre-expressão do domínio de ligação de ADN EBNA1, que funciona como um negativo dominante em células infectadas com EBV, pode inibir a viabilidade das células em células não infectadas, sugerindo que se liga ao EBNA 1 e regula os genes celulares importantes para a sobrevivência das células [18]. A expressão ectópica de EBNA1 foi mostrado para efectuar a expressão de ARNm da célula hospedeira [19], mas não é claro se estes efeitos são directos ou indirectamente relacionado com a locais de ligação específicos EBNA1 no genoma celular.
Num estudo prévio, foram utilizados métodos chip-seq para analisar as instalações de enriquecimento de todo o genoma de EBNA1 em células de linfoma de Raji Burkitt latentes infectadas e identificados inúmeros sites celulares ligados por EBNA1 [17]. Entre esses locais de enriquecimento celular EBNA1 foi identificado um pico de ligação EBNA1 significativa localizado no gastrokine 1 (GKN1) e gastrokine 2 (GKN2, também conhecido como factor trevo interagindo proteína) (TFIZ1) aglomerado de genes. GKN1 GKN2 e foram identificados com base na sua perda frequente de expressão em células de carcinoma epitelial gástrica neoplásicas, em comparação com o tecido normal gástrica [20-22] (revisto em [23]). Vários estudos recentes têm descrito anti-proliferativa e actividade anti-invasiva para GKN1 em células epiteliais gástricas, que, juntamente com a sua perda de expressão frequente no cancro, sugerindo que funciona como supressor tumoral específico ao epitélio gástrico [21, 24-28]. GKN1 podem inibir a migração celular e invasão na cicatrização de feridas, e Transwell ensaio de Matrigel, assim como marcadores de células alter associados com a transição epitelial-mesenquimal [26]. genes GKN1 e GKN2 estão localizados nas proximidades e transcritos em direções opostas, o que sugere que eles provavelmente compartilham um promotor bi-direcional, e estão sujeitas a coordenar a regulação por fatores reguladores da transcrição compartilhada (revisto em [23]).
Neste estudo, demonstramos a ligação direta entre EBNA1 e GKN1-GKN2 loci e investigados GKN1 e GKN2 modulação da expressão gênica por infecção por EBV e proteína EBNA1. Nossos resultados sugerem que a infecção por EBV pode inibir a expressão GKN1 e GKN2, e que a perda de EBNA1 pode facilitar epigenética de-repressão da GKN2 transcrição. Observou-se também níveis de metilação do DNA elevada em regiões promotoras GKN1 e GKN2, e um papel potencial para EBNA1 na desregulamentação e repressão epigenético deste locus de supressor de tumor.

Resultados da Identificação de uma alta ocupação local de ligação ao GKN1 EBNA1 lócus -GKN2 por chip-Seq
anteriormente publicados dados do chip-Seq a partir de células Raji BL revelou um número limitado de sítios de ligação EBNA1 altamente enriquecido com base em resultados de pico e ler números [17]. A inspecção revelou um local de ligação forte EBNA1 localizada a montante dos locais de iniciação para os genes e GKN1 GKN2 divergentemente transcritos (Figura 1A, pista superior). Um pico de ligação EBNA1 semelhante foi observada numa experiência de ChIP-Seq separadas realizadas em linha de células de carcinoma nasofaríngeo EBV positiva C666-1 (dados completos Chip-seq a ser publicado noutro local), indicando que esta ligação ocorre em ambos epitelial, bem como linfóide tipos de células (Figura 1A, pista inferior). O centro do pico foi localizado ~ 5 kb a partir de GKN2 e ~ 15 kb a partir dos locais de iniciação de transcrição GKN1. ChIP-qPCR foi utilizado para validar a ligação na região do promotor de GKN1-GKN2 em ambas as células C666-1 (Figura 1B e C) Raji e EBNA1. qPCR indicou que EBNA1 vinculado ao site da GKN1-2 com eficiência similar a um site EBNA1 de ligação previamente validado no promotor PITPNB. qPCR também indicaram que a ligação a GKN1 GKN2-EBNA 1 foi específico, uma vez que não havia ligação em ambas as regiões de controlo do locus de EBV OriLyt GAPDH celular ou EBNA1 detectável, como seria de esperar (Figura 1B e C). O sítio de ligação putativo à EBNA1 GKN1-GKN2 lócus foi identificada por alinhamento com um local de ligação de consenso da família de EBV de repetições (FR) região, e esta sequência foi em seguida, testados quanto à ligação directa para EBNA1 por EMSA (Figura 1D). DBD proteína EBNA 1 recombinante purificada foi testada quanto à ligação a sondas contendo o local de GKN1-GKN2 (GKN1 /2), FR, ou uma sequência de controlo negativo a que falta um local de ligação consenso EBNA1. Descobrimos que EBNA1 DBD ligado de forma eficiente ao site do GKN1-GKN2, bem como para o consenso FR, mas não se ligam à sequência de controlo. Estes achados sugerem que EBNA1 interage com a região promotora GKN1-GKN2 através do DNA de ligação direta com o EBNA1 DBD. A Figura 1 se liga ao EBNA 1 e GKN1 GKN2 promotor lócus. (A) O navegador genoma UCSC foi usada para mapear pico de ligação EBNA1 gerado a partir de Raji e C666-1 ChIP-seq no loci de genes GKN1 e GKN2. RefSeq anotada transcrições são indicados abaixo do pico ChIP-Seq. (BC) de validação em tempo real-PCR dos dados Chip-seq para o sítio de ligação EBNA1 na região promotora GKN1 /2 compartilhado: EBNA1 (barras vermelhas) ou controlar IgG (barras azuis) foram ensaiadas pelo chip em Raji (B) ou C666-1 células (C) para DNA de ligação no local do GKN1 /2, promotor PITPNB, GAPDH, ou EBV Ori-Lyt. análise (D) EMSA de 32P rotulados sondas contendo Control, GKN1 site /2, ou FR EBV. Variando quantidade de proteína EBNA1 DBD foi usado na reacção (0, 100, 300, 900 ng) de ligação. Pontas de seta representam complexos ligados específicos de EBNA1 ou sonda livre, como indicado. A sequência sonda de GKN1 /2 local e FR é indicado com a sequência homólogos (letras vermelhas) entre GKN1 /2 e FR. A sequência de controlo negativo (Ctrl) também é indicado. As barras de erro indicam o desvio padrão da média (SDM) para n = 3.
GKN1 e ARNm GKN2 são altamente expressos no tecido do estômago primária
A seguir, mediu os níveis de ARNm GKN2 GKN1 ou em várias linhas de células do carcinoma gástrico e na primária tecido gástrico normal, por qRT-PCR (Figura 2). Descobrimos que GKN1 GKN2 e são expressas em níveis muito mais elevados (~ 3 × 10 4 vezes) no tecido do estômago primária do que em qualquer das linhas de células testadas (Figura 2A). Apesar de em níveis muito mais baixos do que o tecido do estômago primária, GKN1 e GKN2 foram ambas expressas em níveis mensuráveis ​​em linhas celulares de carcinoma gástrico AGS, com GKN2 expresso em níveis mais elevados do que todas as outras linhas de células de GC, ou de células B positivas EBV ou linhas de células de NPC ( A Figura 2B). Níveis muito baixos de GKN1 ou GKN2 poderia ser detectado no tecido epitelial oral, primário, indicando ainda que estes genes são específicos para gástrica-tecido primário. A Figura 2 e ARNm GKN1 GKN2 são altamente expressos no tecido do estômago primária. RT-PCR foi realizada para analisar o nível de ARNm de GKN1 (barras azuis) ou GKN2 (barras vermelhas) em diferentes linhas de células, incluindo derivados de GC GTL, MKN28, MKN74, SNU638, AGS, BL-derivado Raji, EBV imortalizada LCL, EBV A linha NPC positiva C666-1, ou células epiteliais da boca principal comparando com (A) ou sem (B) do tecido do estômago primária. As barras de erro indicam o desvio padrão da média (SDM) para n = 3.
latência de EBV reduz a expressão GKN1 e GKN2 ARNm em linhas de células de GC
Para testar o efeito da infecção latente por EBV em expressão GKN1 e GKN2, geramos uma linha de células AGS contendo EBV B95.8 bacm�eo. A linha celular de AGS foi seleccionado relativamente à resistência a higromicina e a positividade GFP para garantir que ele continha componentes bacmid. Para caracterizar a linha de células de AGS-EBV, analisou-se primeiro o padrão de expressão de genes de EBV (Figura 3). Descobrimos que as células AGS-EBV expressaram níveis detectáveis ​​de ARNm de EBNA1, BARF0, e LMP2A, mas não LMP1, EBNA2, ou EBNA3C (Figura 3). Embora EBV B95.8 bacmid carece BART miARNs, estes resultados são consistentes com células AGS-EBV, que adopta um tipo de variante I latência programa expressão do gene com alguma expressão de LMP2A, semelhante à observada em tecido EBV positiva tumor de carcinoma gástrico [8, 10 ]. Para caracterizar adicionalmente as células AGS-EBV, analisou-se a expressão da proteína EBNA1 por Western blot (Figura 4A) e de ADN de EBV número de cópias por qPCR (Figura 4B). EBNA1 foi detectada como uma única espécie de baixa abundância na massa molecular esperada (Figura 4A). número de cópias do EBV foi medida por comparação do ADN de EBV ori-Lyt para GAPDH celular (Figura 4B). Descobrimos que AGS-EBV continha ~ 50% menos cópias do genoma viral em comparação com LCLS EBV positivas. Para determinar se EBNA1 reteve a sua actividade de ligação ao ADN em AGS-EBV, foram realizados ensaios de ChIP convencionais (Figura 4C). Descobrimos que EBNA1 ligado ao ADN de EBV Díade Simetria (DS), bem como para o local de ligação GKN1-GKN2 em células AGS-EBV. A seguir, perguntou se os níveis GKN1 ou mRNA GKN2 foram afetados pela infecção latente EBV nas células AGS, comparando os níveis de expressão RT-qPCR em AGS relação a células AGS-EBV (Figura 4D). Descobrimos que GKN1 e GKN2 foram reprimidos ~ 3-8 vezes na AGS-EBV em relação a células AGS, sugerindo que a latência EBV promove ou estabiliza a repressão da transcrição de GKN1 e GKN2. Figura 3 Caracterização da expressão de genes de EBV em linhas celulares AGS-EBV. AGS, a AGS com EBV positiva, e EBV-LCLS foram ensaiadas quanto à expressão de ARNm por qRT-PCR com iniciadores para EBNA1, BARF0, LMP2A, LMP1, EBNA2, ou EBNA3C, como indicado. As barras de erro indicam o desvio padrão da média (SDM) para n = 3. A Figura 4
a infecção por VEB de células AGS e suprime GKN1 GKN2 transcrição. (A) Análise Western blot da expressão da proteína em células EBNA 1 AGS-EBV em comparação com células AGS negativas para EBV foi realizada utilizando o anticorpo para EBNA1 (topo) ou actina (parte inferior). Número (B) cópia do ADN foi analisada por PCR em tempo real de EBV ori-Lyt ADN em relação ao nível de GAPDH celular em AGS, a AGS com EBV, e células EBV-LCL. (C) chip e análise em tempo real PCR de EBNA1 (barras vermelhas) ou controlar IgG (barras azuis) para a ligação de DNA nos locais EBV incluindo DS e Ori-Lyt ou sites celulares, incluindo GKN1 /2 e GAPDH na AGS-EBV células. (D) RT-PCR foi realizada para analisar o nível de ARNm de GKN1 ou GKN2 em AGS (barras azuis) ou células AGS-EBV (barras vermelhas). ** Indica P < .005. As barras de erro indicam o desvio padrão da média (SDM) para n = 3.
EBV aumenta a repressão de metilação de ADN dependente de GKN1 e GKN2 ARNm em linhas de células de GC
GKN1 GKN2 e pode estar sujeito a supressão epigenética em GC e tecidos linhas de células de cultura. Para explorar esta possibilidade, foi testado se o tratamento com ADN de desmetilação agente 5 'azacitidina (AZA) ou agente de desacetilação (NAB) combinado com éster de forbol (TPA) iria activar GKN1 GKN2 ou em células de AGS (Figura 5A). Nós descobrimos que o tratamento Aza levou a um aumento de ~ 10 vezes na GKN2, e ~ 4 vezes de aumento na transcrição em GKN1 AGS células tratadas. Em contraste, o tratamento NaB /TPA produziu apenas ~ 2 vezes de activação de transcrição. Estes resultados sugerem que tanto GKN1 e GKN1 estão sob repressão epigenética activo através da metilação do DNA. Para testar se o EBV teve qualquer efeito sobre a activação induzida de Aza GKN1 ou GKN2, compararam-se os efeitos do tratamento sobre Aza AGS em relação a células AGS-EBV por qRT-PCR (Figura 5B). Descobrimos que GKN1 e GKN2 foi eficientemente activada pelo tratamento Aza em células AGS, mas numa menor extensão em AGS-EBV. Nestas experiências, a activação induzida por Aza de GKN2 foi completamente eliminada, enquanto que a activação de GKN1 foi apenas parcialmente atenuado. Aza-tratamento também levou ao aumento de ~ 8,4 vezes nos níveis de ARNm de EBNA 1, sugerindo que o tratamento aza estimula a expressão de genes de EBV lítica em linhas celulares AGS-EBV. Estes resultados sugerem que os produtos dos genes EBV evitar GKN2, e uma ativação GKN1 em menor grau, após o tratamento Aza. Figura 5 EBV reforça a repressão da expressão do gene GKN1 e GKN2 por metilação do DNA. células AGS (A) foram tratados com 10? M Aza, ou NaB 1 mM e 20 ng /mL de TPA durante 48 horas e analisado por RT-PCR para o nível de expressão GKN2 GKN1 ou, em comparação com AGS não tratados. (B) células ou células AGS AGS-EBV foram tratadas ou não tratadas com 10? M Aza durante 48 horas, em seguida, ensaiadas para GKN1, ARNm GKN2, ou níveis de mRNA de EBNA1. (C) ensaio da AGS MEDIP ou células AGS-EBV tratadas ou não tratadas com 10? M Aza durante 48 horas a diferentes regiões de ADN de GKN1 e GKN2 loci. (D) MEDIP ensaio da AGS ou células AGS-EBV tratadas ou não tratadas com 10 mM Aza por 48 horas em regiões celulares de alfa globina-2, GAPDH, Cdc7, FOXP2, HDAC3, ou MAP3KIP2. (E) Genome posição dos iniciadores utilizados para ensaios GKN1-GKN2 chip e MEDIP. * Indica P < 0,05, ** indica p < .005. As barras de erro indicada SDM para n = 3.
Para entender melhor o mecanismo de GKN1 e GKN2 repressão epigenética, examinamos os níveis de metilação do DNA usando ensaio metil-specific citosina anticorpo dirigido imunoprecipitação DNA (MEDIP). Nós ensaiado o enriquecimento do ADN metilado na região de controlo do GKN1-GKN2 em células AGS e AGS-EBV, com ou sem tratamento Aza (Figura 5C). Observou-se um enriquecimento relativo de CpG metilado em uma região entre o local de ligação EBNA1 e local de início da transcrição GKN2 (GKN2_A). Aza tratamento levou a uma diminuição do sinal de MEDIP na maioria das regiões em que foi detectado um sinal, sugerindo que o tratamento aza levou a uma redução geral da metilação do DNA. Semelhante perda de metilação de CpG foi observado no gene da alfa-globina (que não se liga EBNA 1), e em vários locais de ligação, incluindo EBNA1 HDAC3 e MAP3K7IP (Figura 5D). Observamos, também, que os sinais MEDIP foram geralmente maiores em EBV-AGS do que nas células AGS, sugerindo que a infecção latente por EBV podem promover ou estabilizar a metilação do DNA ao longo do genoma do hospedeiro.
Depleção EBNA 1 activa a expressão GNK1 e GKN2 ARNm em células epiteliais positivas EBV
para determinar se EBNA1 contribuiu para a repressão transcricional de GKN1 e GKN2, primeiro tentaram esgotar EBNA1 nas células AGS-EBV utilizando siRNA (Figura 6). Geramos um siRNA alvejando UTR não codificadora 3 'do ARNm EBNA1, que parcialmente esgotado proteína EBNA1 nas células AGS-EBV (Figura 6B). Depleção de EBNA1 resultou numa activação dobra ~ 5 de GKN2, com pouca activação detectável da GKN1 (Figura 6A). Estes achados sugerem que EBNA1 pode funcionar como um repressor transcricional de GKN2 em células AGS-EBV. Figura 6 depleção siARN da EBNA1 de provoca-repressão do GKN1 e GKN2 em células AGS-EBV. siCtrl ou siEBNA1 transfectadas células AGS-EBV foram analisadas por RT-PCR para mARN ou GKN1 GKN2 nível relativo de GAPDH celular (A). As células foram colhidas às 72 horas pós-transfecção com siARN. blot mostrando EBNA1 Western (painel superior) e de controlo de carga de actina (painel inferior) em células de AGS-EBV (B). As barras de erro indicam o desvio padrão da média (SDM) para n = 3.
EBNA1 inibe GKN1 e GKN2 transcrição depois de DNA desmetilação
Para explorar ainda mais a contribuição de EBNA1 a regulação da transcrição GKN1 e GKN2, testamos o efeito de expressão ectópica da sozinho EBNA1 sobre os níveis induzidos Aza de GKN1 ou GKN2 transcrição em células de GC. AGS células foram transduzidas com um lentivírus expressando EBNA1. Estável AGS-EBNA1 (PLU-EBNA1) ou linhas celulares AGS- vector de controlo (PLU-Vec) foram selecionadas e analisadas para níveis GKN1 e mRNA GKN2. Observou-se que as células AGS-EBNA1 tinha um ~ 2-3 vezes maior nível basal de GKN1 e ARNm GKN2 relativamente às células parentais AGS (Figura 7A). No entanto os níveis de mRNA,-Aza induzidas de GKN1 e GKN2 foram atenuadas em AGS-EBNA 1 em comparação com células de AGS (Figura 7B). tratamento aza também levou a um grande aumento nos níveis de ARNm de EBNA1 (Figura 7C). Para determinar se os efeitos da EBNA1 em GKN1 e GKN2 eram específicos de células AGS, nós transduzidas outra linha de células GC negativo EBV MKN74 com EBNA1 lentivírus (Figura 7D-F). Semelhante a AGS células, verificou-se que o aumento dos níveis basais EBNA1 de GKN1 e GKN2, mas inibiu a capacidade de induzir a Aza ainda mais os níveis de ARNm e GKN1 GKN2 (Figura 7D e E). Nós confirmou que Aza-tratamento foi eficaz, medindo os níveis de mRNA EBNA1, que aumentaram ~ 7 vezes (Figura 7F). Estes resultados sugerem que a expressão ectópica de EBNA1 pode aumentar basal, mas inibir os níveis induzidos de Aza GKN1 e GKN2 transcrição em linhas celulares de EBV-negativa GC. Figura 7 EBNA1 inibe GKN1 e GKN2 transcrição após desmetilação do DNA em células de GC. células AGS (A) foram transduzidas com PLU-Vector (Vec) ou PLU-EBNA 1 e, em seguida, tratada (Untr) ou tratados com 10? M de 5'-azacitidina (AZA), durante 48 horas. GKN1 e ARNm GKN2 foram quantificados por qRT-PCR em relação a GAPDH. (B) indução da dobra GKN1 e ARNm GKN2 por Aza foram quantificadas a partir do painel A. (C) qRT-PCR A análise dos níveis de ARNm em células EBNA 1 AGS. (D) O mesmo que em A, excepto que se utilizou em vez de células MKN74 AGS. (E) indução de dobra GKN1 e ARNm GKN2 quantificado a partir do painel D. Análise (F) de qRT-PCR de níveis de ARNm de EBNA1 nas células MKN74. * Indica P < 0,05, ** indica p < .005. As barras de erro indicam o SDM para n = 3. Discussão

Neste estudo, foi identificado um local de ligação de alta ocupação EBNA1 na região de controlo do promotor de 5 'dos ​​genes e GKN1 GKN2 divergentemente transcritos. locais de ligação de EBNA1 foram observados em dois conjuntos de dados do chip-Seq independentes de EBV células linfóides BL positivos Raji e EBV positiva células de carcinoma nasofaríngeo epiteliais C666-1 (Figura 1A). Confirmámos estas sítios de ligação convencional por ChIP-qPCR em ambas as linhas celulares (Figura 1B e C). EBNA1 também foi mostrado para ligar diretamente para esses sites por EMSA com EBNA1 recombinante purificada de proteína DBD (Figura 1D). Mostra-se que os níveis de mRNA e GKN1 GKN2 são altamente reprimido na maioria das linhas de células em relação ao tecido gástrico principal (Figura 2). Para estudar o papel potencial de EBNA1 de EBV e no controlo transcricional de GKN1 e GKN2, que gerada uma linha celular de carcinoma gástrico EBV positiva AGS. Nós mostramos que o EBV adopta uma variante de tipo I padrão a latência em células de AGS (Figura 3), e que EBNA1 pode ligar-se a região do promotor de GKN1 /GKN2 no cromossoma celular (Figura 4C). Nós também descobrimos que GKN1 e mRNA GKN2 foram ainda suprimidos em EBV células AGS positivos relativamente ao controlo EBV células AGS negativos (Figura 4D). Em seguida, mostraram que Aza-tratamento conduziu a um aumento da expressão de GKN1 e GKN2 (Figura 5A), e que a infecção latente por EBV inibe a activação de Aza GKN2 (Figura 5B). Descobrimos que a depleção de ARNsi de EBNA1 nas células AGS EBV positivas conduz à activação da transcrição de GKN2 (Figura 6). Também mostramos que a expressão ectópica EBNA1 basal aumenta moderadamente, mas inibe os níveis induzidos de Aza GKN1 e transcrição GKN2 (Figura 7). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que EBNA 1 liga-se a região de controlo do promotor do GKN1-GKN2 em vários tipos de células, e levantam a possibilidade de que EBNA1 contribui para a repressão transcricional e epigenética dos genes supressores de tumor GKN1 e GKN2 em GC EBV positiva.
infecção latente por EBV é conhecida por aumentar o fenótipo tumorigénico de células de carcinoma gástrico [29-31]. GKN1 e GKN2 são relatados para funcionar como inibidores do crescimento celular e supressores de tumor em GC [20, 21, 23, 25-27]. Nossos dados de expressão de ARNm que mostram a expressão de ARNm de alto nível apenas no tecido gástrico normal de primário são consistentes com um papel de GKN1 e GKN2 como um supressor de tumor. No entanto, não fomos capazes de demonstrar que a sobre-expressão de um ou ambos GKN1 ou GKN2 em AGS ou AGS-EBV provocar uma paragem do ciclo celular ou reduzir a viabilidade (dados não mostrados). Isto sugere que a função GKN1 e GKN2 em fases anteriores em evolução de células tumorais, ou no microambiente de tumor mais complexas. Especulamos que EBNA1 pode ter um efeito mais pronunciado sobre a expressão GKN1 GKN2 e em situações em que o EBV podem infectar as células gástricas primários onde a expressão basal de GKN1 e GKN2 são elevados e importante para a supressão do tumor.
Estudos publicados anteriores demonstraram que GKN1 e GKN2 transcrição é sujeito a supressão epigenética por metilação de DNA em todas as formas de GC [21]. Os nossos estudos são consistentes com o papel da metilação do DNA na supressão de epigenética GKN1 e GKN2 em células AGS. O tratamento com Aza resultou no aumento de 4-10 vezes na expressão de GKN1 e GKN2 ARNm (Figura 5A), e MEDIP revelou enriquecimento de ADN metilado nas regiões promotoras (Figura 5C). células AGS-EBV não mostrar um aumento de metilação do DNA em vários locais celulares, incluindo as regiões que rodeiam a sítios na região promotora GKN1 (Figura 5C) EBNA1 de ligação, e os genes e MAP3K7IP2 HDAC3 (Figura 5D). No entanto, a presença de EBNA1 nas células AGS-EBV não impediu desmetilação Aza-induzida nestes locais. Isto sugere que EBNA1 pode reprimir a transcrição a partir de alguns promotores, como GKN2, através de um mecanismo distinto da metilação do DNA. No entanto, a expressão ectópica de EBNA1 sozinho produziu um fenótipo mais complicado, causando um pequeno aumento na expressão basal, mas a limitação dos efeitos de desmetilação-Aza induzida (Figura 7). Isto pode sugerir que EBNA1 que pode funcionar de forma diferente quando expresso ectopicamente, do que quando expressa no contexto do genoma viral. No entanto, nossos resultados sugerem que EBNA1 perturba a regulação transcricional normal dos genes GKN1 e GKN2.
A função precisa da EBNA1 na regulação da transcrição permanece obscuro. EBNA1 tem sido implicado na activação da transcrição e a repressão de ambos os genes virais e celulares [32, 33]. EBNA1 pode reprimir a sua própria expressão de ARNm a partir do EBV Qp na latência do tipo III, onde a repressão tem sido associada a interferência estérica com ARN polimerase II de ligação ao local de iniciação da transcrição [34]. Por outro lado, EBNA1 pode activar promotores PB e LMP1 na latência do tipo III, onde ele pode funcionar como um factor potenciador do tipo [35-37]. EBNA1 tem sido implicado na activação da transcrição de alguns genes celulares, incluindo o gene Nox2 envolvida na formação de espécies de oxigénio reactivo [19]. EBNA1 pode também afectar a transcrição da célula hospedeira através de uma remodelação global do cromossoma do hospedeiro [38]. Assim, EBNA1 pode alterar a transcrição celular através de vários mecanismos directos e indirectos.
Modificações Epigenetic são conhecidos por desempenhar um papel importante no carcinoma gástrico associada a EBV [39]. Interessantemente, as células que transportam genomas de EBV AGS bacmid tinham níveis mais elevados de ADN metilado em muitos sítios testados (Figura 5D). Isto é consistente com o papel proposto para EBV na metilação de genes supressores tumorais hospedeira [40]. Isso também é consistente com os resultados que o EBV GC positiva elevou a metilação do DNA em regiões promotoras dos vários supressores tumorais chave GC, incluindo genes gastrokine [39, 41-45]. Enquanto EBNA1 ligado perto das regiões de ADN metilado do GKN2, não fomos capazes de mostrar que EBNA1 modula a metilação do DNA nos locais GKN1 e GKN2 (dados não mostrados). No entanto, é possível que EBNA 1 em associação com um outro factor codificado ou induzida por vírus pode estabilizar GKN1 e GKN2 repressão transcricional através de um mecanismo dependente da cromatina-e estrutural que reforça a metilação de DNA. É também possível que EBNA1 pode regular GKN1 GNK2 ou apenas em tecidos tumorais ou microambientes que não são prontamente retomados em cultura de células. Enquanto a função de ligar para hospedar sites de cromossomos de células EBNA1 continua a ser uma importante área de investigação, modelos de infecção mais sofisticados podem ser necessários para elucidar seu papel potencial em alterar a expressão do gene da célula hospedeira e carcinogênese.
Métodos
Células, plasmídeos, e infecção lentivírus
linfoma de células Raji de Burkitt, células C666-1 EBV positivo de carcinoma nasofaríngeo EBV-positivo, e linhas de células de carcinoma gástrico (um presente do Dr. Antonia R. Sepulveda, Universidade de Columbia), incluindo GTL, MKN28, MKN74, SNU638 foram mantidas em meio RPMI contendo FBS a 10% e suplementado com antibióticos (penicilina e estreptomicina). células de carcinoma gástrico AGS (ATCC N ° CRL-1739) foram mantidas em F-12K contendo 10% de FBS. células epiteliais da boca primária foram fornecidos pelo Dr. Manjunatha Benakanakere, Universidade da Pensilvânia e cultivadas em meio de queratinócitos-SFM. EBV-LCL foi estabelecida pela infecção primária de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) com viriões EBV BAC gerados a partir de células 293 estimuladas com EBV [46, 47]. EBV-LCL contém um EBV resistente bacmid foram mantidas em meio RPMI contendo FBS a 10%, higromicina B (100 ug /ml), Glutamax (Invitrogen), e antibióticos higromicina B. células AGS-EBV foram gerados a partir de células AGS co-cultivadas com EBV-LCL por adaptação de um co-cultivo de células infecção método descrito anteriormente publicada AGS com rEBV através de contacto célula-a-célula [48], com algumas modificações. Resumidamente, EBV-LCL foi induzida por 20 ng /mL de 12-O-tetradecanoilforbol
13-acetato (TPA) e butirato de sódio 1 mM (NAB) 24 horas antes da co-cultura. As células EBV-LCL induzidas foram lavadas com PBS duas vezes para remover completamente os agentes indutores, ressuspenderam-se com meio RPMI completo a 10 6 células /ml antes da co-incubação. células AGS foram plaqueadas em placas de 6 poços, 24 horas antes de co-cultivo, em seguida, 60 - 70% de células AGS confluentes em 1 ml de meio completo F-12K foram incubadas com 10 6 células EBV-LCL induzidas e lavadas em 1 ml RPMI completo. 24 horas mais tarde, 2 ml de meio F-12K isento de soro foi adicionado a cada poço para reduzir a concentração de FBS a 5% para evitar o crescimento excessivo de células. 3 dias após a co-incubação, as células EBV-LCL foram removidas das co-culturas e as células AGS foram exaustivamente lavadas com PBS, pelo menos 5 vezes para remover qualquer das células EBV-LCL dador. As células AGS infectados foi em seguida incubado com meio F-12K fresco com 10% de FBS e 100 ug /ml de higromicina B e o meio de selecção foi mudado todos os 2 a 3 dias até que as células AGS infectadas formaram colónias de selecção Hyg B com a expressão de GFP (geralmente 3 a 4 semanas após a co-cultura). As colónias de selecção foram então reunidas e testadas para a expressão de EBNA 1 e número de cópias do genoma de EBV antes sujeitas a experiências. células AGS-EBV foram mantidas em meio F-12K com FBS a 10% e 100 ug /ml de higromicina vector de expressão de EBNA 1 PLU-Lentivírus B.
foi construído por amplificação por PCR com os iniciadores de EBNA1 (GCGGGATCCTCTGACGAGGGGCCAGGTACAGGACCT ATCGTCGACTCACTCCTGCCCTTCCTCACCCTCATC e) introdução de um 5 ' BamH I e 3 'sítio Sal I clonado no quadro para PLU-CTVM-FMCS-pPURO. células AGS ou MKN74 foram infectadas com lentivírus expressando PLU-EBNA1 ou vetor de controle PLU gerado recentemente a partir de células 293T. AGS infectadas ou células MKN74 foram então seleccionadas com 2,5 ug /ml de puromicina para 10 a 14 dias. As células seleccionadas foram reunidas e tratadas com ou sem 5'-azacitidina durante 48 horas, em seguida, submetidas a RT-PCR.
ARNsi contra EBNA1 e ARNsi de controlo (Cat. No. D-001810-01-20) foram todos adquiridos a partir de Dharmacon. ARNsi dirigido contra EBNA1 3'UTR foram sintetizados utilizando a sequência alvo CGGAGAUGACGGAGAUGAAUU. A transfecção de ARNic em cadeia dupla foi realizada utilizando Oligofectamine (Dharmacon), seguindo as especificações do fabricante.
Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaios
ChIP ensaios foram realizados como descrito anteriormente [49]. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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