EBNA1 obvezujuća i epigenetičko regulacija gastrokine tumor supresor gena u stanicama karcinoma želuca

EBNA1 obvezujuća i epigenetičko regulacija gena za suzbijanje gastrokine tumora u stanicama karcinoma želuca pregled Sažetak pregled Pozadina pregled, Epstein-Barr virus (EBV) latentno inficira ~ 10% želučanih karcinoma (GC). Epstein-Barr Nuklearni antigen 1 (EBNA1) izražava se u EBV-povezane GC, i mogu vezati DNK domaćina, gdje može utjecati na stanični regulaciji gena. Ovdje ćemo pokazati da EBNA1 veže direktno na DNA uzvodno od divergentno prepisanih tumor supresorski geni GC-specifičnih gastrokine 1 (GKN1) i gastrokine 2 (GKN2).
Metode pregled Mi koristimo čip-seq, čip-qPCR, a EMSA pokazati da EBNA1 veže direktno na GKN1 i GKN2 promotora lokusa. Mi stvaraju AGS-EBV i AGS-EBNA1 stanične linije za proučavanje učinaka EBNA1 na izrazu GKN1 i GKN2 mRNA sa ili bez 5 'azacitidin liječenja. Pregled Rezultati
Pokazali smo da gastrokine geni za prepisivanje ušutkani od strane DNA metilacije , Mi također pokazuju da je latentna EBV infekcija dodatno smanjuje GKN1 i GKN2 izraz u AGS stanicama karcinoma želuca, te da siRNA osiromašeni EBNA1 djelomično ublažava tu represiju. Međutim, ektopično izraz EBNA1 blago povećan GKN1 i GKN2 bazalni mRNA razine, ali smanjili svoje odaziv na demethylating agent. Pregled Zaključci
Ovi nalazi pokazuju da EBNA1 veže na divergentne promotora GKN1 i GKN2 gena u GC stanicama, i sugeriraju da EBNA1 doprinosi složene transkripcije i epigenetičke deregulacije GKN1 i GKN2 tumor supresorski geni u EBV pozitivne GC. pregled Ključne riječi pregled, EBV EBNA1 karcinom želuca Gastrokine Chip-Sekv Epigenetske Uvod pregled, Epstein-Barr virus ( EBV) je humani gammaherpesvirus naći u širokom rasponu limfoidne i epitelnih stanica malignih bolesti, uključujući Burkittov limfom, Hodgkinova bolest, karcinom nazofarinksa (NPC) i nakon transplantacije limfoproliferacijsku bolest (pregledano u [1, 2]). U novije vrijeme, EBV je pronađen u ~ 10% svih karcinoma želuca (GC) slučajeva u svijetu [3, 4]. EBV povezana GC je pokazala da se monoklonsko izdanak želučanog epitela EBV inficirane i smatra se da različita podtipa GC [5, 6]. Budući da je incidencija GC blizu 900.000 ljudi godišnje [7], EBV povezane GC može biti među najčešćih vrsta raka EBV-povezane.
U EBV pozitivnih stanica karcinoma želuca, EBV uspostavlja varijantu tipa I latencije, gdje EBV transkripcija je ograničena na kanonskog tipa i gena EBNA1, Ebers, Bart obitelj nekodiranom RNA i miRNAs, ali s nekim dodatnim ekspresijom LMP2A [6, 8-11]. Među tim latencije gena, EBNA1 je samo virusna nuklearni protein koji je otkriven u EBV-povezana GC. EBNA1 je potreban za osnivanje latentne mehanizam replikacije infekcije te za dugoročni opstanak latentno inficiranih stanica [12-15]. EBNA1 je vezanje DNA protein koji se veže za bilo viralnih i domaćina kromosomalnim mjestima. Veznih u virusnog genoma su karakterizirani na osnovnim funkcijama u replikaciji i kontrole transkripcije virusne ekspresije gena. Međutim, funkcija EBNA1 sekvenci-specifičnog vezanja na kromosom domaćina je manje dobro poznata. Dok EBNA1 može vezati za promotora regijama nekoliko gena domaćina, ostaje nejasno jesu li ti geni su podložne regulaciji EBNA1 [12, 16, 17]. Prekomjerna ekspresija vezne domene EBNA1 DNA, koja djeluje kao dominantni negativni EBV inficirane stanice, može inhibirati vijabilnost stanica u neinficiranim stanicama, što ukazuje da EBNA1 veže na i regulira stanični geni su važni za opstanak stanica [18]. Ektopično izraz EBNA1 je pokazala da se postigne ekspresiju stanica domaćina mRNA [19], ali nije jasno da li su ti učinci izravno ili neizravno povezani sa specifičnim vezanja EBNA1 mjesta u staničnom genomu.
U prethodnom istraživanju koristili smo Chip-seq metode za analizu genoma širom stranice obogaćivanje EBNA1 u latentno inficiranih Raji Burkittov limfom stanica i identificirali brojne stanične stranice vezan za EBNA1 [17]. Među tim EBNA1 stranicama stanični obogaćivanje smo identificirali značajno vezivanje EBNA1 vrh se nalazi na gastrokine 1 (GKN1) i gastrokine 2 (GKN2, također poznat kao faktor trolisnim interakciji proteina (TFIZ1)) gen klastera. GKN1 i GKN2 su identificirani na temelju njihove česte gubitak ekspresije u neoplastičnih epitelnim stanicama karcinoma želuca, u usporedbi sa normalnim tkivom želučane [20-22] (revijalni prikaz u [23]). Nekoliko nedavnih studija opisan antiproliferativne i anti-invazivne aktivnosti za GKN1 u želučanim epitelnim stanicama, što je, zajedno sa svojim čestim gubitak ekspresije kod raka, sugerira ona djeluje kao supresor tumora specifičnih za želučane epitela [21, 24-28]. GKN1 inhibiraju migraciju i invaziju u zacjeljivanju rana, transjažice i Matrigel pokus, kao zrcalnih staničnih markera povezanih sa prijelazom epitela-mezenhimalnih [26]. GKN1 i GKN2 geni se nalaze u neposrednoj blizini, a prepisuju se u suprotnim smjerovima, što sugerira da su vjerojatno dijele dvosmjerno promotor, te podliježu koordinirati propis zajedničkim transkripcijski regulacijski faktori (prikaz u [23]). Netlogu U tome studija, pokazali smo izravni vezanja između EBNA1 i GKN1-GKN2 lokusa i istražuju GKN1 i GKN2 ekspresije gena modulaciju koju EBV infekcije i EBNA1 proteina. Naši rezultati ukazuju na to da EBV infekcije mogu dodatno inhibira GKN1 i GKN2 izraz, i da je gubitak EBNA1 može olakšati epigenetičku de-represiju GKN2 transkripcije. Također smo uočili razine povišene DNA metilacije na GKN1 i GKN2 regije promotora i potencijalnu ulogu za EBNA1 u deregulaciju i epigenetičko represije ovog tumor supresorski lokusu. Pregled Rezultati
Identifikacija visoke popunjenosti EBNA1 vezno mjesto na GKN1 -GKN2 mjesto koje čip-ID br
Ranije objavljeni Chip-Sekv podataka iz Raji BL stanica pokazala je ograničeni broj visoko obogaćenog EBNA1 veznih mjesta na temelju vršnog rezultate i čitanje brojeva [17]. Nadalje inspekcija je pokazala jaku EBNA1 vezno mjesto se nalazi uzvodno od startna mjesta za divergentno prepisanih GKN1 i GKN2 gena (Slika 1A, gornja track). Sličan EBNA1 vezanje vršak je opažena u odvojenoj čip SEQ eksperimenta koji je proveden u EBV pozitivna nazofaringealni karcinom linije C666-1 (pune čip seq podatke za objavljivanje drugdje), što ukazuje da taj vezni javlja i epitela, te limfoidne tipovi stanica (Slika 1A, manja staza). Središte vrha se nalazi ~ 5 KB iz GKN2 i ~ 15 kb iz GKN1 transkripcija startna mjesta. Chip-qPCR se rabi za provjeru EBNA1 vezivanja na promotorske regije GKN1-GKN2 u oba Raji i C666-1 stanica (Slika 1B i C). qPCR pokazala je da EBNA1 vezan za GKN1-2 site sa sličnim učinkovitosti na prethodno validirane EBNA1 vezanja na PITPNB promotora. qPCR je također pokazala da EBNA1 vezivanja za GKN1-GKN2 je specifično jer nije bilo moguće otkriti EBNA1 vezanja bilo na staničnoj GAPDH lokusa ili kontrolnih područja EBV OriLyt, kako se i očekivalo (Slika 1B i C). Pretpostavljena EBNA1 vezanja na GKN1-GKN2 lokus identificiran poklapanjem s konsenzusom mjesta vezanja na EBV obitelji ponavljanja (FR) regiji, te ova sekvenca je testiran direktnog vezanja na EBNA1 s EMSA (Slika 1D). Rekombinantno EBNA1 DBD protein je ispitan na vezanje za probe sadrže GKN1-GKN2 stranice (GKN1 /2), FR ili negativan kontrolni slijed postojao konsenzus EBNA1 vezno mjesto. Otkrili smo da EBNA1 DBD vezan učinkovito na GKN1-GKN2 stranice, kao i na FR konsenzusa, ali ne vežu na kontrolnom nizu. Ovi rezultati sugeriraju da EBNA1 komunicira s GKN1-GKN2 promotorske regije kroz izravno se veže na DNA s EBNA1 DBD. Slika 1 EBNA1 veže na GKN1 i GKN2 promotora lokusa. (A) UCSC genom preglednik se koristi za mapiranje EBNA1 obvezujući vrh generirani od Raji i C666-1 čip-SEQ na GKN1 i GKN2 gen lokusa. RefSeq označeni transkripti su navedeni u nastavku čip Sekv vrha. (BC) Stvarno-PCR valjanosti Chip-seq podacima za EBNA1 veznog mjesta na GKN1 /2 zajedničkoj promotorske regije: EBNA1 (crvena crta) ili kontrolu IgG (plave trake) određene su čip u Raji (b) ili C666-1 stanice (c) za DNA binding na GKN1 /2 stranice, PITPNB promotor, GAPDH ili EBV Ori-Lyt. (D) EMSA analiza 32P obilježenih probi sadrže Control, GKN1 /2 stranice, ili EBV FR. Variranjem količine EBNA1 DBD proteina korištena u reakciji (0, 100, 300, 900 ng) vezivanje. Strelice predstavljaju EBNA1 specifične povezane komplekse ili besplatno sondu kako je naznačeno. Sonda slijed GKN1 /2 stranice i FR je označeno slijed homolognih (crvenim slovima) između GKN1 /2 i FR. Negativna kontrola (Ctrl) slijed također naznačeno. Stupci pogrešaka ukazuju na standardno odstupanje od srednje vrijednosti (SDM) za n = 3. pregled GKN1 i GKN2 mRNA vrlo su izraženi u osnovnoj tkivu želuca pregled Mi smo sljedeći mjereno GKN1 ili GKN2 mRNA razine u različitim želučanih stanica karcinoma linije i primarne normalno želuca tkivne QRT-PCR (slika 2). otkrili smo da GKN1 i GKN2 izraženi na mnogo višim razinama (~ 3 x 10 4 puta) u osnovnoj tkivu želuca nego u bilo kojoj od ispitanih staničnih linija (Slika 2A). Iako je po mnogo nižim razinama nego primarni tkivu želuca, GKN1 i GKN2 su izrazili na mjerljivim razinama u AGS stanične linije karcinoma želuca, uz GKN2 izražena na višim razinama od svih drugih GC staničnim linijama, ili EBV pozitivnih B-stanica ili stanične linije NPC ( slika 2B). Vrlo niske razine GKN1 ili GKN2 bi se moglo detektirati u osnovnoj oralno epitelnog tkiva, što dalje ukazuje da su ti geni su specifični za primarnu želučanom tkivu. Slika 2 GKN1 i GKN2 mRNA vrlo su izraženi u primarnoj tkivu želuca. RT-PCR analiza na razinu mRNA GKN1 (plava stupci) ili GKN2 (crvena stupci) u različitim vrstama stanica, uključujući GC izveden GTL, MKN28, MKN74, SNU638, AGS, BL-izvedeni Raji, EBV imortalizirane LCL, EBV pozitivan NPC linija C666-1, ili primarni usta epitelnih stanica u usporedbi s (A) ili bez (B) primarna tkivu želuca. Stupci pogrešaka ukazuju na standardno odstupanje od srednje vrijednosti (SDM) za n = 3. pregled EBV latencija smanjuje ekspresiju GKN1 i GKN2 mRNA u staničnim linijama GC
Za testiranje učinka EBV latentne infekcije na GKN1 i GKN2 izražavanja, generira prikazuje veza AGS stanica sadrži EBV B95.8 bacmid. Stanična linija AGS izabran je za otpor higromicina i GFP pozitivnosti kako bi se osiguralo da je sadržavao bacmid komponente. Za karakterizaciju stanične linije AGS-EBV, prvo smo analizirali izraz uzorak EBV gena (Slika 3). Otkrili smo da AGS-EBV stanice izrazio mjerljive razine mRNA EBNA1, BARF0 i LMP2A, ali ne LMP1, EBNA2 ili EBNA3C (Slika 3). Iako EBV B95.8 bacmid nedostaje Bart miRNAs, ovi rezultati u skladu su s AGS-EBV stanice usvajanje tip varijantu sam latenciju Gene Expression program s nekim izrazom LMP2A, slično onome u EBV pozitivne želuca tumora karcinoma tkiva [8, 10 ]. Za daljnju karakterizaciju AGS-EBV stanice, analizirane EBNA1 proteinsku ekspresiju pomoću Western blot (slika 4a) i EBV DNA kopiju broj od qPCR (Slika 4B). EBNA1 detektirana je kao jedan niskog preteka vrsta u očekivanoj molekulske mase (Slika 4A). Broj kopija EBV mjerena je usporedbom EBV Ori-Lyt DNA stanični GAPDH (Slika 4B). otkrili smo da AGS-EBV sadržane ~ 50% manje kopije genoma virusa u usporedbi s pozitivnim EBV LCLs. Da bi se utvrdilo da li EBNA1 zadržao svoj aktivnosti vezanja na DNA u AGS-EBV, proveli smo standardne čip analize (slika 4c). Otkrili smo da EBNA1 vezan za EBV dijade Symmetry (DS) DNA, kao i na mjesto vezanja GKN1-GKN2 u AGS-EBV stanica. Potom smo pitali da li GKN1 ili GKN2 mRNA razine su pogođeni EBV latentne infekcije u AGS stanica usporedbom RT-qPCR razina ekspresije kod AGS u odnosu na AGS-EBV stanica (Slika 4D). Otkrili smo da GKN1 i GKN2 su potisnute ~ 3-8 puta u AGS-EBV u odnosu na AGS stanica, sugerirajući da EBV latencija promiče ili stabilizira transkripcijski represiju GKN1 i GKN2. Slika 3 Karakterizacija izražavanja EBV gena u AGS-EBV staničnim linijama. AGS, AGS-EBV pozitivne i EBV-LCLs su analizirani na ekspresiju mRNA koje QRT-PCR s početnicama za EBNA1, BARF0, LMP2A, LMP1, EBNA2 ili EBNA3C, kao što je navedeno. Stupci pogrešaka ukazuju na standardno odstupanje od srednje vrijednosti (SDM) za n = 3. pregled Slika 4 EBV infekciju AGS stanica potiskuje GKN1 i GKN2 transkripciju. (A) Western blot analiza ekspresije proteina u EBNA1 AGS-EBV stanica u usporedbi sa stanicama AGS EBV-negativnim provedena je pomoću antitijela za EBNA1 (vrh) ili aktina (dno). broj (B) DNA kopija je ispitivana u realnom vremenu PCR EBV Ori-Lyt DNA u odnosu na razinu stanične GAPDH u AGS, AGS-EBV i EBV-LCL stanica. (C) čip i real-time PCR analiza EBNA1 (crvena bara) ili kontrolirati IgG (plave trake) za DNA vezanja na EBV mjesta, uključujući DS i Ori-Lyt ili staničnih mjesta, uključujući GKN1 /2 i GAPDH u AGS-EBV Stanice. (D) RT-PCR analize na razini mRNA GKN1 ili GKN2 u AGS (plave trake) ili AGS-EBV stanice (crvena crta). ** Označava P < 0,005. Stupci pogrešaka ukazuju na standardno odstupanje od srednje vrijednosti (SDM) za n = 3. pregled EBV povećava metilacije DNA ovisnu represiju GKN1 i GKN2 mRNA u staničnim linijama GC pregled GKN1 i GKN2 može biti predmetom epigenetičke suzbijanje u GC i tkiva kulture staničnih linija. Kako bi istražili ovu mogućnost, mi smo testirali je li liječenje s DNA demethylating agenta 5 'azacitidin (aza) ili deacetylating sredstvo (nab) u kombinaciji s forbol estera (TPA) bi aktivirao GKN1 ili GKN2 u AGS stanicama (Slika 5a). otkrili smo da aza Tretman je doveo do struko povećanje-10 u GKN2 i ~ 4 umnožak porasta u GKN1 transkripciju u AGS obrađena stanica. Za razliku od toga, NaB /TPA tretman proizvodi samo ~ 2 puta aktivacije transkripcije. Ovi rezultati ukazuju na to da su i GKN1 i GKN1 pod aktivnim epigenetičke represije kroz metilacije DNA. Kao dokaz da EBV imao nikakvog utjecaja na Aza inducirana aktivacija GKN1 ili GKN2, usporedili smo učinke aza liječenja na AGS u odnosu na AGS-EBV stanica za QRT-PCR (slika 5B). Otkrili smo da GKN1 i GKN2 učinkovito aktivirane su aza tretman u AGS stanicama, ali u manjoj mjeri u AGS-EBV. U tim pokusima, aza-inducirana aktivacija GKN2 potpuno je eliminirana, a aktivacija GKN1 je samo djelomično oslabljeni. Aza-tretman je doveo do ~ 8.4 strukog povećanja razine EBNA1 mRNA, što sugerira da tretman aza stimulira ekspresiju gena EBV lize u AGS-EBV staničnih linija. Ovi rezultati sugeriraju da EBV genski proizvodi spriječiti GKN2, te u manjoj mjeri aktivacije GKN1 nakon aza liječenja. Slika 5 EBV pojačava represiju GKN1 i GKN2 gensku ekspresiju DNA metilacije. (A) AGS stanice su tretirane s 10 uM aza, ili 1 mM NAB i 20 ng /mL TPA 48 sati i analiziran pomoću RT-PCR za GKN1 ili razinu ekspresije GKN2 u usporedbi s neobrađenim AGS. (B) stanice ili AGS AGS-EBV stanice su tretirane ili neobrađen 10 uM aza 48 sati, zatim se ispituje GKN1, GKN2 mRNA, ili razine EBNA1 mRNA. (C) MeDIP Test AGS ili AGS-EBV stanica tretiranih ili netretiranih sa 10 uM aza 48 sati pri različitim regijama DNA GKN1 i GKN2 lokusa. (D) MeDIP esej AGS ili AGS-EBV stanica tretiranih ili netretiranih s 10 uM aza 48 sati na staničnoj regijama za alfa globin-2, GAPDH, Cdc7, FOXP2, HDAC3 ili MAP3KIP2. (E) Genome položaj klica korištenih za GKN1-GKN2 čip i MeDIP testovima. * Označava p < 0,05, ** označava P < 0,005. Stupci pogrešaka naznačeno SDM za n = 3.
Da bi bolje razumjeli mehanizam GKN1 i GKN2 epigenetičke represije, ispitali smo razine metilacije DNA pomoću metil citozin-specifičnih antitijela usmjerena DNK imunotaloženje (MeDIP) testa. izmjerili smo obogaćivanje metiliranog DNA u kontrolnom području GKN1-GKN2 u AGS i AGS-EBV stanice s ili bez aza liječenja (Slika 5C). Zapaženo je da je relativno obogaćenje metiliranim CpG u području između veznog mjesta EBNA1 i GKN2 početka transkripcije (GKN2_A). Aza liječenje dovelo do smanjenja MeDIP signala u većini regija u kojoj je detektiran signal, što sugerira da Aza liječenje dovelo do općeg smanjenja metilacije DNA. Sličan gubitak CpG metilacije zabilježena je kod gena alfa-globin (koji se ne veže EBNA1), te na nekoliko obvezujuća EBNA1 stranica, uključujući HDAC3 i MAP3K7IP (Slika 5D). Mi smo također napomenuti da MeDIP signali su uglavnom veći u EBV-AGS nego u AGS stanicama, što ukazuje da EBV latentna infekcija može promicati ili stabilizirati metilacije DNA tijekom genomom.
EBNA1 osiromašeni aktivira ekspresiju GNK1 i GKN2 mRNA u EBV pozitivnih epitelnim stanicama pregled biste utvrdili je li EBNA1 pridonijeli potiskivanjem transkripcije od GKN1 i GKN2, prvo smo pokušali iscrpiti EBNA1 u AGS-EBV stanice pomoću siRNA (slika 6). generira smo siRNA ciljaju 3 'ne-kodiranja UTR EBNA1 mRNA, koji je djelomično iscrpljena EBNA1 proteina u AGS-EBV stanica (Slika 6b). Iscrpljivanje EBNA1 rezultirao je ~ 5 aktivaciji puta od GKN2, s malo može detektirati aktivaciju GKN1 (slika 6a). Ovi rezultati ukazuju na to da EBNA1 može funkcionirati kao transkripcijski represor GKN2 u AGS-EBV stanica. Slika 6 siRNA iscrpljivanje EBNA1 uzrokuje de-represiju nad GKN1 i GKN2 u AGS-EBV stanica. siCtrl ili siEBNA1 transfektirane AGS-EBV stanice su ispitane pomoću RT-PCR za GKN1 ili GKN2 mRNA razine u odnosu na staničnu GAPDH (A). Stanice se prikupe 72 sati nakon transfekcije siRNA. Western blot prikazuje EBNA1 (gornja ploča) i kontrola učitavanje Actin (donji panel) u AGS-EBV stanica (B). Stupci pogrešaka ukazuju na standardno odstupanje od srednje vrijednosti (SDM) za n = 3. pregled EBNA1 inhibira GKN1 i GKN2 transkripciju nakon DNK demetilitanog Netlogu Kako bi se dodatno istražiti doprinos EBNA1 na GKN1 i GKN2 regulacije transkripcije, mi smo testirali učinak ektopično izraz sama EBNA1 o aza-izazvanim razinama GKN1 ili GKN2 transkripcije u GC stanicama. AGS stanice su transduced s EBNA1 izražavanje lentivirus. Stabilno AGS-EBNA1 (rap-EBNA1) ili AGS- kontrolni vektor (rap-VEC) stanične linije su odabrane i ispitana na GKN1 i GKN2 mRNA razinama. Uočili smo da AGS-EBNA1 stanice imala ~ 2-3 puta veću bazalnu razinu GKN1 i GKN2 mRNA u odnosu na roditeljske AGS stanica (Slika 7a). Međutim, aza-inducirane razine mRNA GKN1 i GKN2 su oslabljena u AGS-EBNA1 odnosu na AGS stanica (Slika 7b). Aza tretman također je dovelo do velikog porasta razine EBNA1 mRNA (Slika 7c). Da bi se utvrdilo jesu li učinci EBNA1 na GKN1 i GKN2 su specifični za AGS stanica, prenesen smo još jednu negativnu GC stanične linije EBV MKN74 s EBNA1 lentivirus (Slika 7D-F). Slično AGS stanice, otkrili smo da EBNA1 povećana bazalna razina GKN1 i GKN2, ali umanjuje sposobnost aza da se dodatno izazvati GKN1 i GKN2 mRNA razine (Slika 7D i E). Potvrdili smo da je aza-tretman bio učinkovit mjerenje nivoa EBNA1 mRNA, koji su povećani ~ 7 puta (Slika 7f). Ovi rezultati ukazuju na to da izvanmaternične izraz EBNA1 može povećati bazalno, a inhibiraju aza-inducirane razine GKN1 i GKN2 transkripcije u EBV-negativnih GC staničnim linijama. Slika 7 EBNA1 inhibira GKN1 i GKN2 transkripciju nakon DNK metilne skupine u GC stanicama. (A) AGS stanice transducirane s rap-vektor (vektorski) ili rap-EBNA1 i zatim netretirane (Untr) ili tretirani s 10 uM 5'-azacitidin (aza) za 48 sati. GKN1 i GKN2 mRNA kvantificirane su QRT-PCR u odnosu na GAPDH. (B) Presavijte indukciju GKN1 i GKN2 mRNA aza su kvantificirani s ploče A. (C) QRT-PCR analizu razine EBNA1 mRNA u AGS stanica. (D) Isto kao u A, osim korištenja MKN74 umjesto AGS stanica. (E) Presavijte indukciju GKN1 i GKN2 mRNA kvantitativno iz panela D. (F) QRT-PCR analizu razine EBNA1 mRNA u MKN74 stanica. * Označava p < 0,05, ** označava P < 0,005. Stupci pogrešaka naznačeno SDM za n = 3. pregled Rasprava pregled U ovom istraživanju, identificirali smo vezanja velike zauzetosti EBNA1 u 5 'kontrolne promotor regije u divergentno prepisanih GKN1 i GKN2 genima. EBNA1 vezna mjesta zabilježen je u dva neovisna skupova podataka čip-Sekv s EBV pozitivne limfne BL stanica Raji i EBV pozitivne stanice epitela nazofarinksa karcinom C666-1 (Slika 1A). potvrdili smo ove vezna mjesta na konvencionalne čip-qPCR u obje stanične linije (Slika 1B i C). EBNA1 Također je pokazano da se spajaju direktno na tim mjestima s EMSA s rekombinantno EBNA1 DBD proteina (Slika 1D). Pokazali smo da GKN1 i GKN2 mRNA razine su vrlo potisnuto u većini staničnih linija u odnosu na primarnu želučanog tkiva (slika 2). Kako bi proučili potencijalnu ulogu EBV i EBNA1 u transkripcijskom kontrolom GKN1 i GKN2, generira smo EBV pozitivne AGS želučane linijske stanice karcinoma. Pokazujemo da EBV donosi varijantu tipa I latencija uzorak u AGS stanica (Slika 3), a koji se može vezati na EBNA1 promotorske regije GKN1 /GKN2 u staničnom kromosomu (Slika 4C). Također smo otkrili da GKN1 i GKN2 mRNA dalje su potisnute u EBV pozitivnih AGS stanica u odnosu na kontrolu negativnih AGS stanice EBV (Slika 4d). tada smo pokazali da aza tretman je doveo do povećanja ekspresije GKN1 i GKN2 (Slika 5a), a to EBV latentna infekcija inhibira aktivaciju aza GKN2 (slika 5B). Otkrili smo da siRNA iscrpljivanje EBNA1 u EBV pozitivnih AGS stanicama dovodi do transkripcije aktivacije GKN2 (slika 6). Mi također pokazuju da EBNA1 izvanmaternične izraz umjereno povećava bazalno, ali inhibira razine GKN1 i GKN2 transkripcije (Slika 7) aza-inducirane se. Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da EBNA1 veže na kontrolnoj promotor regije GKN1-GKN2 u više tipova stanica, te otvaraju mogućnost da EBNA1 doprinosi transkripcije i epigenetičko represije od GKN1 i GKN2 tumor supresorski geni u EBV pozitivne GC.
EBV latentna infekcija je poznato da se poveća tumore fenotip želučanih stanica karcinoma [29-31]. GKN1 i GKN2 su izvijestili da djeluju kao inhibitori rasta stanica i tumora smetnji u GC [20, 21, 23, 25-27]. Naši ekspresije mRNA podaci pokazuju visoke razine mRNA ekspresiju samo primarne normalnom tkivu želuca su u skladu s ulogom GKN1 i GKN2 kao tumor-supresor. Međutim, nismo uspjeli pokazati da prekomjerna ekspresija jednog ili oba GKN1 ili GKN2 u AGS ili AGS-EBV uzrokuje zaustavljanje staničnog ciklusa ili smanjenje održivost (podaci nisu prikazani). To sugerira da GKN1 i GKN2 funkciju u ranijim fazama razvoja tumorskih stanica, ili u složenijim tumora mikrookoliša. Mi nagađaju da EBNA1 može imati izraženiji učinak na GKN1 i GKN2 izražavanja u situacijama u kojima EBV se može zaraziti primarnih stanica želuca gdje bazalne ekspresije GKN1 i GKN2 su visoke i važne za suzbijanje tumora.
Prethodne studije koje su pokazale da GKN1 i GKN2 transkripcija podliježe epigenetičke suzbijanje DNA metilacije u svim oblicima GC [21]. Naša istraživanja su u skladu s ulogom DNA metilacije u epigenetičke suzbijanju GKN1 i GKN2 u AGS stanicama. Tretman s aza rezultiralo struko povećanje 4-10 ekspresije GKN1 i GKN2 mRNA (Slika 5A) i MeDIP otkrio obogaćenje metiliranog DNA na regije promotora (Slika 5C). AGS-EBV stanice pronađena je povećanje u DNA metilacije na nekoliko staničnih stranica, uključujući područja koja okružuju EBNA1 vezna mjesta na mjesto GKN1 promotorske regije (Slika 5c), te gene HDAC3 i MAP3K7IP2 (Slika 5D). Međutim, prisutnost EBNA1 u AGS-EBV stanica nije spriječilo aza-inducirana demetiliranje na ovim stranicama. To sugerira da EBNA1 može potisnuti transkripcije iz nekih promotora, kao GKN2, kroz mehanizam razlikuje od DNA metilacije. Međutim, ektopično izraz EBNA1 sama proizvela složeniji fenotip, što uzrokuje mali porast bazalnog izražavanja, ali ograničavanjem utjecaja aza-inducirane metilne skupine (slika 7). To može ukazivati ​​da je EBNA1 mogu djelovati različito kada izraženi ektopički, nego kada je izražen u kontekstu virusnog genoma. Ipak, naši rezultati ukazuju na to da EBNA1 remeti normalnu regulaciju transkripcije od GKN1 i GKN2 gena.
Preciznu funkciju EBNA1 u regulaciji transkripcije ostaje nejasno. EBNA1 je uključen u aktivacije transkripcije i represiju viralnih i staničnih gena [32, 33]. EBNA1 može potisnuti vlastitu ekspresiju mRNA iz EBV Qp na tip III latencije, u kojima je potiskivanje povezanog steričke smetnje s RNA polimerazom II vezanje za iniciranje transkripcije [34]. S druge strane, može aktivirati EBNA1 cP i LMP1 promotore tipa III latenciju gdje se može funkcionirati kao pojačivač nalik faktor [35-37]. EBNA1 je implicirana u transkripciju aktivacijom pojedinih staničnih gena, uključujući gena Nox2 sudjeluje u stvaranju reaktivnih kisikovih [19]. EBNA1 također mogu utjecati na host-stanica transkripciju kroz globalnu remodeliranja kromosom domaćina [38]. Dakle, EBNA1 možda mijenjaju staničnu transkripciju kroz više izravnih i neizravnih mehanizama.
Epigenetske modifikacije su poznati da igraju važnu ulogu u EBV-povezana želučanog karcinoma [39]. Zanimljivo, AGS stanice koje nose EBV bacmid genome imali su višu razinu meliliranom DNK na mnogim ispitivanih mjesta (Slika 5D). To je u skladu s pretpostavljenom ulogu EBV u metilacijom tumorskih supresorskih gena domaćina [40]. To je također u skladu s nalazima koji EBV pozitivne GC je povišenim DNA metilacije na promotorske regije nekoliko ključnih GC tumora smetnji, uključujući gastrokine genima [39, 41-45]. Dok EBNA1 vezan blizu DNA metiliran regijama GKN2, nismo bili u mogućnosti pokazati da EBNA1 modulira DNA metilacije na GKN1 i GKN2 mjestima (podaci nisu prikazani). Međutim, moguće je da EBNA1 zajedno s drugim virusnim kodiranih ili izazvane faktora mogu stabilizirati GKN1 i GKN2 potiskivanjem transkripcije kroz kromatin ovisan i strukturne mehanizam koji pojačava DNA metilacije. Također je moguće da se mogu regulirati EBNA1 GKN1 ili GNK2 samo u tkivu tumora i mikrookoliša koji nisu lako rekapitulirani u kulturi stanica. Iako je funkcija EBNA1 vezanja domaćin stanica kromosoma mjesta ostaje važno područje istraživanja, više sofisticirane modele infekcija može tražiti da se razjasni svoju potencijalnu ulogu u promjenu ekspresije stanica domaćina gena i karcinogeneze.
Metode
Stanice, plazmidi, i lentivirus infekcije pregled EBV-pozitivnih Burkittov limfom Raji stanice, EBV pozitivne nazofarinksa karcinom C666-1 stanice, i želučanih stanične linije karcinoma (poklon od Dr. Antonije R. Sepulveda, Columbia University), uključujući OPZ, MKN28, MKN74, SNU638 su održavane u RPMI koji sadrži 10% FBS i obogaćenim s antibioticima (penicilina i streptomicina). Želučani AGS karcinom stanice (ATCC No. CRL-1739.) bili su održavani u F-12K koji sadrži 10% FBS-a. Primarna usta epitelne stanice su od Dr. Manjunatha Benakanakere Sveučilišta u Pennsylvaniji i uzgajane u Keratonicyte-SFM medij. EBV-LCL je osnovana od strane primarne infekcije mononuklearnih stanica periferne krvi (PBMC) s EBV BAC viriona generiranih iz stimuliranih 293-EBV stanica [46, 47]. EBV-LCL sadrži otporan EBV bacmid su održavane u RPMI koji sadrži 10% FBS, higromicin B (100 ug /ml), Glutamax (Invitrogen), te antibiotici su higromicin B. AGS-EBV stanice generirane od AGS stanica ko-kultiviranih s EBV-LCL prilagođavanjem prethodno objavljene ko-kultiviranja postupkom opisanim AGS stanica infekciju rEBV kroz stanice do stanice kontaktu [48] uz neke modifikacije. Ukratko, EBV-LCL inducirana je 20 ng /ml 12 O pregled -tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) i 1 mM natrijevog butirata (NaB) 24 sata prije ko-kultiviranja. Inducirana EBV-LCL stanice su isprane s PBS dva puta u potpunosti ukloniti tvari koji izazivaju resuspendirani s potpunom RPMI mediju na 10 6 stanica /ml prije ko-inkubacije. AGS stanice su stavljene na ploče sa 6 jažica 24 sata prije ko-kultiviranja od 60 - 70% konfluentnosti AGS stanica u 1 ml potpuni F-12K mediju inkubirane sa 10 6 inducirano i ispere EBV-LCL stanica u 1 ml Potpuni RPMI. 24 sata kasnije, 2 ml seruma F-12K mediju se doda u svaku jažicu kako bi se smanjila koncentracija FBS do 5% za sprečavanje bujanja stanica. 3 dana nakon koinkubacije, EBV-LCL stanice su uklonjene iz ko-kultura i AGS stanice su temeljito isprane s PBS najmanje 5 puta da se ukloni bilo koji od donora EBV-LCL stanica. Zaražene AGS Stanice se zatim inkubira s svježim F-12K mediju s 10% FBS i 100 ug /ml higromicina B i medij za odabir je mijenjan svaka 2 do 3 dana dok su inficirane AGS stanice nastaju Hyg B selekcije kolonije s ekspresiju GFP (obično 3 do 4 tjedna nakon suradnje uzgoj). Kolonije izbor su tada sakupljene i ispitane EBNA1 i broj kopija EBV genoma prije podložno eksperimenata. AGS-EBV stanice su održavane u F-12K mediju s 10% FBS i 100 ug /ml higromicina B.
rap-EBNA1 lentivirus vektor ekspresije je konstruiran pomoću PCR amplifikacije EBNA1 s klicama (GCGGGATCCTCTGACGAGGGGCCAGGTACAGGACCT i ATCGTCGACTCACTCCTGCCCTTCCTCACCCTCATC) uvodi 5 ' BamH i 3 'Sal i mjesto klonirani u okvir rap-TCMV-FMCS-pPURO. AGS ili MKN74 stanice su zaražene s lentivirusom eksprimira rap-EBNA1 ili rap kontrolnom vektoru generirana svježe od 293T stanica. Zaražene AGS ili MKN74 stanice su zatim odabrane od 2,5 ug /ml puromicina za 10 do 14 dana. Odabrane stanice su skupljene i tretira se sa ili bez 5 'azacitidin 48 sata, a zatim podvrgnut RT-PCR.
SiRNA prema EBNA1 i siRNA kontrole (Cat. No. D-001810-01-20) su svi nabavljeni od Dharmacon. siRNA usmjerena protiv EBNA1 3'UTR su sintetizirani korištenjem ciljnu sekvencu CGGAGAUGACGGAGAUGAAUU. Transformacija siRNA parova je provedena pomoću Oligofectamine (Dharmacon), nakon specifikacije proizvođača.
Kromatina imunoprecipitaciju (chip) metoda za pregled čip analize su izvedene kao što je ranije [49] što je opisano. Svi autori pročitali i odobrili konačnu rukopis. Pregled

• Dugo nekodirajuće izraz RNK profil u ljudskom raka želuca i njegove kliničke significances
• Kompjutora analizi karcinom želuca Serijski Analiza ekspresije gena knjižnica otkriva različite profile povezane s ethnicity