EBNA1 bindend an epigenetic Regulatioun vun gastrokine entholl suppressor Genen vun gastric carcinoma Zellen

EBNA1 bindend an epigenetic Regulatioun vun gastrokine entholl suppressor Genen vun gastric carcinoma Zellen VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung Epstein-Barr Virus (EBV) infects latently ~ 10% vun gastric carcinomas (GC). Epstein-Barr Nuclear Antigen 1 (EBNA1) ass am EBV-verbonne GC ausgedréckt, an kann Provider DNA festleeën, wou et bewosst Gentherapie Regulatioun Impakt kann. Hei, mir weisen datt EBNA1 direkt DNA Photo'en Offloss vun der divergently ausserdeem GC-spezifesch entholl suppressor Genen gastrokine 1 (GKN1) an gastrokine 2 (GKN2). VerfÜgung Method VerfÜgung Mir benotzen Chip-weider, Chip-qPCR, an EMSA datt EBNA1 ze beweisen, direkt un der GKN1 an GKN2 Promoteur nët Photo'en. Mir generéieren AGS-EBV, an AGS-EBNA1 Zell Linnen d'Auswierkunge vun EBNA1 op GKN1 an GKN2 mRNA Ausdrock ze studéieren, mat oder ouni 5 'azacytidine Behandlung. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Mir weisen datt gastrokine Genen transcriptionally duerch DNA methylation entsat sinn . Mir weisen awer och, datt Uklang EBV Wonn weider GKN1 an GKN2 Ausdrock vun AGS gastric carcinoma Zellen reduzéiert, an datt siRNA Ausschöpfung vun EBNA1 alleviates deelweis dëser Repressioun. Allerdéngs, ectopic Ausdrock vun EBNA1 gehumpelt GKN1 an GKN2 basal mRNA Niveauen fräi, mä reduzéiert hir Réceptivitéit fir demethylating Agent. VerfÜgung Konklusiounen VerfÜgung Dës Conclusiounen bewisen, datt EBNA1 zu der Duden Promoter vun der GKN1 an GKN2 Genen am GC Zellen Photo'en, a proposéieren, datt EBNA1 dréit zu der komplex transcriptional an epigenetic Dereguléierung vum GKN1 an GKN2 entholl suppressor Genen am EBV positive GC. VerfÜgung Schlësselwieder VerfÜgung EBV EBNA1 Gastric carcinoma Gastrokine Chip-weider epigenetic Erschléisse VerfÜgung Epstein-Barr Virus ( EBV) e Mënsch gammaherpesvirus ass zu engem Netzwierk vu lymphoid an epithelial Zell malignancies fonnt, dorënner Burkitt d'lymphoma, Hodgkin senger Krankheet, nasopharyngeal carcinoma (dach), a Post-Transplantatioun lymphoproliferative Krankheet (iwwer- [1, 2]). Méi kuerzem, huet EBV vun ~ 10% vun all gastric carcinoma (GC) Fäll weltwäit [3, 4] fonnt ginn. EBV-verbonne GC gouf e monoclonal outgrowth vun EBV-Krankheet gastric epithelial Zellen ze ginn dës Distanz an ass als eng eegestänneg subtype vun GC [5, 6] gin. Well d'Heefegkeet vun GC ass no 900,000 Leit pro Joer [7], EBV-verbonne GC ënnert de meeschte verwandelt EBV-verbonne Cancers kann. VerfÜgung An EBV positive gastric carcinoma Zellen, féiert EBV eng Variant Typ ech latency, wou EBV Transkriptiouns ass zu kanonesche Typ limitéiert ech Genen EBNA1, EBERs, BART Famill net-coding RNS an miRNAs, mä mat e puer zousätzlech Ausdrock vun LMP2A [6, 8-11]. Dorënner latency Genen, ass EBNA1 der nëmmen Haren nuklear FAQ datt am EBV-verbonne GC fonnt gëtt. EBNA1 ass fir d'Opstelle vun der Uklang fonnt episomal Wonn a fir d'langfristeg Iwwerliewe vun latently infizéiert Zelle néideg [12-15]. EBNA1 ass eng DNA bindend FAQ datt souwuel Haren a Provider chromosomal Siten Photo'en. Déi obligatoresch Siten am Haren Nepgen gewiescht fir wiesentlech Funktiounen am Gedächtnis a transcriptional Kontroll vun Haren Gentherapie Ausdrock charakteriséiert. Allerdéngs ass d'Funktioun vun EBNA1 Haaptrei-spezifesch fir de Provider chromosome bindend manner gutt verstanen. Iwwerdeems EBNA1 fir de Promoteur Regioune vun e puer Provider Genen festleeën kann, bleift et kloer, ob dësen Genen ze EBNA1 Regulatioun Sujet sinn [12, 16, 17]. Overexpression vun der EBNA1 DNA bindend Domän, déi Funktiounen als dominant negativ zu EBV Krankheet Zellen, kann Zell Nuetsvolen zu uninfected Zellen inhibit, datt EBNA1 suggeréiert Photo'en ze a reguléieren bewosst Genen wichteg fir Zell Iwwerliewe [18]. Ectopic Ausdrock vun EBNA1 gouf Wierkung gewisen zu Gaascht Zell mRNA Ausdrock [19], mä et ass net kloer, ob dësen Effekter direkt oder indirekt ze bestëmmter EBNA1 bindend Siten an der bewosst Nepgen dinn. VerfÜgung An enger viregter studéieren, mir ginn Chip-weider Methode vum Daniel Nepgen-grouss Beräicherung Siten vun EBNA1 zu latently Krankheet Raji Burkitt d'lymphoma Zellen ze analyséieren an identifizéiert villen bewosst Siten duerch EBNA1 gebonnen [17]. Ënnert deenen EBNA1 bewosst Beräicherung Siten identifizéiert mir e wesentleche EBNA1 bindend Héichpunkt am gastrokine wellkomm 1 (GKN1) an gastrokine 2 (GKN2, och als trefoil Faktor bekannt proposéiert FAQ (TFIZ1)) Gentherapie Stärekoup. GKN1 an GKN2 hunn baséiert op hir heefeg Verloscht vun Ausdrock vun neoplastic gastric carcinoma epithelial Zellen, am Verglach zu normalen gastric Otemschwieregkeeten identifizéiert ginn [20-22] (iwwer- [23]). mat sengen heefege Ausdrock Verloscht vun Kriibs puer rezent Studien hu fir GKN1 zu gastric epithelial Zellen, déi, zesumme anti-proliferative an Anti-invasiv Aktivitéit beschreiwen, et als entholl suppressor spezifesch ze gastric epithelium Funktiounen mobiliséiert [21, 24-28]. GKN1 kann Zell Wanderung an Invasioun zu Meter verkënnegt, transwell an Matrigel assay, souwéi ofzeänneren Zell lues verbonne mat der epithelial-mesenchymal Transitioun [26] inhibit. GKN1 an GKN2 Genen sinn an direkter Noperschaft matzen an entgéintgesate Richtungen ausserdeem, suggeréiert, dass se wahrscheinlech enger bi-Direktional Promoteur deelen, an ënnerleien Regulatioun vun gedeelt Transkriptiouns reglementaresche Faktore ze koordinéieren (iwwer- [23]). VerfÜgung An dësem studéieren, hien huet mir direkt bindend tëscht EBNA1 an GKN1-GKN2 loci an GKN1 an GKN2 Gentherapie Ausdrock modulation vun EBV Wonn an EBNA1 FAQ propagéieren. Eis Conclusiounen hindeit datt EBV Wonn kann weider GKN1 an GKN2 Ausdrock inhibit, an datt Verloscht vun EBNA1 kann epigenetic de-Repressioun vun GKN2 Transkriptiouns vereinfachen. Mir gesinn och nik DNA methylation Niveauen am GKN1 an GKN2 Promoteur Regiounen, an e Potential Roll fir EBNA1 vun der Dereguléierung a epigenetic Repressioun vun dëser nët entholl suppressor. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Umeldung vun engem EBNA1 héich-realiséiert bindend Site bei GKN1 -GKN2 nët vun Chip-weider VerfÜgung Virdrun publizéiert Chip-weider Daten aus Raji BL Zellen eng limitéiert Zuel vu ganz beräichert EBNA1 bindend Siten réischt baséiert op Héichpunkt Fändelen an liesen Zuelen [17]. Weider Inspektioun Teamchef eng staark EBNA1 bindend Site läit Offloss vun Ufank Siten fir d'divergently ausserdeem GKN1 an GKN2 Genen (Dorënner 1A, ieweschte Streck). Eng ähnlech EBNA1 bindend Héichpunkt war an enger separater Chip-weider experimentéieren standing am EBV positive nasopharyngeal carcinoma Zell Linn C666-1 observéiert (voll Chip-weider Daten publizéiert soss gin), wat beweist, datt dat obligatoresch am souwuel epithelial existeiert, souwéi lymphoid Zell Zorte (Dorënner 1A, manner Streck). Den Zentrum vun der Héichpunkt Stadsadministratioun ~ 5 KB aus GKN2 an ~ 15 KB vum GKN1 Transkriptiouns Start Siten. Chip-qPCR war benotzt der EBNA1 ze validéieren bindend um GKN1-GKN2 Promoteur Regioun an zwee Raji an C666-1 Zellen (Dorënner 1B an C). qPCR uginn, datt zu der GKN1-2 Site gebonnen EBNA1 mat ähnlechen Effizienz zu engem virdrun validéiert EBNA1-verbindlech Site bei der PITPNB Promoteur. qPCR annoncéiert och dass EBNA1 verbindlech bis GKN1-GKN2 spezifesch war zënter et kee Magnéitfeld EBNA1 um entweder d'Kontroll Regiounen bewosst GAPDH nët oder EBV OriLyt bindend ass, wéi erwaart (Dorënner 1B an C). D'putative EBNA1 bindend Site bei GKN1-GKN2 nët war déi Formatioun mat engem Konsens bindend Site vun der EBV Famill vun Widerhuelung (FR) Regioun identifizéiert, an deem steet, war duerno fir direkt bindend ze EBNA1 vun EMSA (Dorënner 1D) getest. Sidd recombinant EBNA1 DBD FAQ war fir verbindlech bis Ämter assayed wouvun der GKN1-GKN2 Site (GKN1 /2), FR, oder eng negativ Kontroll Haaptreiestären engem Konsens EBNA1 bindend Site subtil. Mir hu fonnt, datt EBNA1 DBD effizient zu der GKN1-GKN2 Site, wéi och an der FR Konsens gebonnen, mä huet kruet net un der Kontroll Haaptrei. Dës Conclusiounen hindeit datt EBNA1 openee mat GKN1-GKN2 Promoteur Regioun duerch direkt DNA-verbindlech mat de EBNA1 DBD. Figur 1 EBNA1 Photo'en um GKN1 an GKN2 Promoteur nët. (A) Den Browser huet UCSC Nepgen benotzt EBNA1 bindend Héichpunkt vum Raji an C666-1 Chip-weider um GKN1 an GKN2 Gentherapie loci generéiert zu Kaart. RefSeq forcéiert gët sinn ënnert dem Chip-weider Héichpunkt ukomm. (V) Realtime-Hinnen alleguer Confirmatioun vun Chip-weider Daten fir EBNA1 bindend Site bei der GKN1 /2 gedeelt Promoteur Regioun: EBNA1 (rout Baren) oder Kontroll IgG (blo Baren) sech vum Chip an Raji (B) assayed oder C666-1 Zellen (C) fir DNA bindend um GKN1 /2 Site, PITPNB Promoteur, GAPDH, oder EBV Ori-Lyt. (D) EMSA Analyse vun 32P Fortgeschratten Ämter wouvun Control, GKN1 /2 Site, oder EBV FR. Verännerlech Montant vun EBNA1 DBD FAQ war zu verbindlechen Reaktioun (0, 100, 300, 900 NG) benotzt. Arrowheads vertrieden EBNA1-spezifesch gebonnen investéiert oder gratis Studiebäihëllefe wéi uginn. D'Studiebäihëllefe Haaptrei vun GKN1 /2 Site an FR ass mat Haaptrei homolog (rout Bréiwer) uginn tëscht GKN1 /2 an FR. Déi negativ Kontroll (Ctrl) Haaptrei ass och uginn. Feeler Baren weg Standard deviation aus der mëttlerer (sdm) fir n = 3. VerfÜgung GKN1 an GKN2 mRNA sinn héich an alleréischter Mo. Otemschwieregkeeten ausgedréckt VerfÜgung Mir nächst GKN1 oder GKN2 mRNA Niveau vun verschiddenen gastric carcinoma Zellen Linnen an am primäre gemooss normal gastric Otemschwieregkeeten vun qRT-Hinnen alleguer (Dorënner 2). Mir hu fonnt, datt GKN1 an GKN2 bei vill méi héich Niveauen ausgedréckt ginn (~ 3 × 10 4 fantastesch) an alleréischter Mo. Otemschwieregkeeten wéi an iergendengem vun der Zell Linnen getest (Dorënner 2A). Obwuel bei méi nidderegen Niveaue wéi Primärschoul Mo. Otemschwieregkeeten, GKN1 an GKN2 sech souwuel um moossbar Niveauen ausgedréckt an AGS gastric carcinoma Zell Linnen, mat GKN2 bei héichen Niveau ausdrécke wéi all aner GC Zell Linnen, oder EBV positiv B-Zell oder dach Zell Linnen ( Figur 2B). Ganz nidderegen Niveau vun GKN1 oder GKN2 konnt an der Primärschoul mëndlech epithelial Otemschwieregkeeten nogewise ginn, weider beweist dass dës Genen si spezifesch fir Primärschoul gastric-Otemschwieregkeeten. Figur 2 GKN1 an GKN2 mRNA sinn héich an alleréischter Mo. Otemschwieregkeeten ausgedréckt. RT-Hinnen alleguer Leeschtung war d'mRNA Niveau vun GKN1 (blo Baren) oder GKN2 (rout Baren) zu verschiddene Zell Linnen dorënner GC-ofgeleet GTL, MKN28, MKN74, SNU638, AGS, BL-ofgeleet Raji ze analyséieren, och EBV LCL, EBV positiv dach Linn C666-1, oder Primärschoul Mond epithelial mat (a) vergläichen Zellen oder ouni (B) Primärschoul Mo. Otemschwieregkeeten. Feeler Baren weg Standard deviation aus der mëttlerer (sdm) fir n = 3. VerfÜgung EBV latency GKN1 an GKN2 mRNA Ausdrock am GC Zell Linnen verklengert VerfÜgung den Effet vun EBV Uklang Harnweeër op GKN1 an GKN2 Ausdrock ze testen, mir generéiert eng AGS Zell Linn EBV B95.8 bacmid mat. D'AGS Zell Linn war fir hygromycin Resistenz an GFP komm ausgewielt ze suergen, datt et bacmid Komponente Texter. Fir d'AGS-EBV Zell Linn Markenzeeche, analyséiert mir éischter der EBV Gentherapie Ausdrock Muster (Dorënner 3). Mir hu fonnt, datt AGS-EBV Zellen Magnéitfeld mRNA Niveau vun EBNA1 ausgedréckt, BARF0, an LMP2A, mä net LMP1, EBNA2, oder EBNA3C (Dorënner 3). Obwuel EBV B95.8 bacmid der BART miRNAs Éloquence, sinn dëse Conclusiounen konsequent mat AGS-EBV Zellen eng Variant Typ ofwäichen ech latency Gentherapie Ausdrock Programm mat e puer Ausdrock vun LMP2A, gläicht dat am EBV positive gastric carcinoma entholl Otemschwieregkeeten observéiert [8, 10 ]. Fir weider AGS-EBV Zellen Markenzeeche, mir analyséieren EBNA1 FAQ Ausdrock vun Western blot (Dorënner 4A) an EBV DNA Kopie Zuel vun qPCR (Dorënner 4B). EBNA1 war um erwaart molekulare Mass (Dorënner 4A) als eenzege niddreger Heefegkeet Arten fonnt. EBV Kopie Zuel gouf, andeems EBV Ori-Lyt DNA zu bewosst GAPDH (Dorënner 4B) gemooss. Mir hu fonnt, datt AGS-EBV enthale ~ 50% manner Kopië vun der Haren Nepgen Verglach mat EBV positive LCLs. Fir erauszefannen, ob EBNA1 seng DNA bindend Aktivitéit zu AGS-EBV zréckbehalen, mir konventionell Chip assays (Dorënner 4C) gesuergt. Mir hu fonnt, datt op der EBV Dyad Briechung (DS) DNA gebonnen EBNA1, wéi och un d'GKN1-GKN2 bindend Site vun AGS-EBV Zellen. Mir gefrot nächst ob GKN1 oder GKN2 mRNA Niveau vun EBV Uklang Wonn am AGS Zellen, andeems RT-qPCR Ausdrock Niveauen am AGS famill ze AGS-EBV Zellen (Dorënner 4D) betraff huet. Mir hu fonnt, datt GKN1 an GKN2 repressed sech ~ 3-8 fantastesch an AGS-EBV famill ze AGS Zellen, suggeréiert datt EBV latency ënnerstëtzt oder stabilizes der transcriptional Repressioun vun GKN1 an GKN2. Figur 3 Characterization vun EBV Gentherapie Ausdrock vun AGS-EBV Zell Linnen. AGS, AGS-EBV positiv, an EBV-LCLs sech fir mRNA Ausdrock assayed vun qRT-Hinnen alleguer mat primers fir EBNA1, BARF0, LMP2A, LMP1, EBNA2, oder EBNA3C, wéi uginn. Feeler Baren weg Standard deviation aus der mëttlerer (sdm) fir n = 3. VerfÜgung Dorënner 4 EBV Wonn vun AGS Zellen Hien GKN1 an GKN2 Transkriptiouns. (A) Western blot Analyse vun EBNA1 FAQ Ausdrock vun AGS-EBV Zellen am Verglach mat EBV-negativ AGS Zellen war mat antibody fir EBNA1 (uewen) standing oder Actin (ënnen). (B) DNA Kopie Zuel gouf vun real-Zäit Hinnen alleguer vun EBV Ori-Lyt DNA relativ zu de Niveau vun bewosst GAPDH zu AGS, AGS-EBV, an EBV-LCL Zellen assayed. (C) Chip an real-Zäit Hinnen alleguer Analyse vun EBNA1 (rout Baren) oder Kontroll IgG (blo Baren) fir DNA um EBV Siten bindend dorënner DS a Ori-Lyt, oder bewosst Siten och GKN1 /2 an GAPDH zu AGS-EBV Zellen. (D) RT-Hinnen alleguer war standing der mRNA Niveau vun GKN1 oder GKN2 zu AGS (blo Baren) oder AGS-EBV Zellen (rout Baren) ze analyséieren. ** Beweist p &Si besteet; .005. Feeler Baren weg Standard deviation aus der mëttlerer (sdm) fir n = 3. VerfÜgung EBV Erhéijunge DNA methylation ofhängeg Repressioun vun GKN1 an GKN2 mRNA am GC Zell Linnen VerfÜgung GKN1 an GKN2 kënnen ze epigenetic Ennerdréckung vun GC an Otemschwieregkeeten Thema ginn Kultur Zell Linnen. Fir dës Méiglechkeet beschen, getest mir ob Behandlung mat DNA demethylating Agent 5 'azacytidine (December) oder deacetylating Agent (NaB) kombinéiert mat bor Ester (TPA) géif GKN1 oder GKN2 zu AGS Zellen (Dorënner 5A) aktivéieren. Mir hu fonnt, datt December Behandlung zu engem ~ 10 fantastesch Erhéijung vun GKN2 gefouert, an ~ 4 fantastesch Erhéijung vun GKN1 Transkriptiouns zu AGS behandelt Zellen. Am Géigesaz, NaB /TPA Behandlung nëmmen ~ 2 fantastesch Aktivatioun vun Transkriptiouns produzéiert. Dës Conclusiounen hindeit datt souwuel GKN1 an GKN1 ginn ënnert aktiv epigenetic Repressioun duerch DNA methylation. Fir Test wann EBV keen Effet op December Bedrug Aktivatioun vun GKN1 oder GKN2 no, am Verglach mir d'Effete vun December Behandlung op AGS relativ zu AGS-EBV Zellen vun qRT-Hinnen alleguer (Dorënner 5B). Mir hu fonnt, datt GKN1 an GKN2 vun effizient ausgeléist huet an AGS Zellen December Behandlung, mä zu enger grousser Distanz Mooss zu AGS-EBV. An dës Experimenter, war December-entschlof Aktivatioun vun GKN2 komplett éliminéiert, iwwerdeems Aktivatioun vun GKN1 nëmmen deelweis attenuated war. December-Behandlung gefouert och zu de ~ 8.4 fantastesch Erhéijung vun EBNA1 mRNA Niveauen, suggeréiert datt December Behandlung koum Ausdrock EBV lytic Gentherapie zu AGS-EBV Zell Linnen. Dës Resultater proposéiere der EBV Gentherapie Produiten GKN2 verhënneren, an zu enger klenger Mooss GKN1 Aktivéierung der December Behandlung. Figur 5 EBV verstärkt der Repressioun vun GKN1 an GKN2 Gentherapie Ausdrock vun DNA methylation. (A) AGS Zellen sech mat 10 μM December behandelt, oder 1 mm NaB an 20 Dummeldéng /ML TPA fir 48 Stonnen an analyséiert vun RT-Hinnen alleguer fir GKN1 oder GKN2 Ausdrock Niveau, am Verglach mat onbehandelt AGS. (B) AGS Zellen oder AGS-EBV Zellen goufen behandelt oder onbehandelt mat 10 μM December fir 48 Stonnen, duerno fir GKN1 assayed, GKN2 mRNA, oder EBNA1 mRNA Niveauen. (C) MeDIP assay vun AGS oder AGS-EBV Zellen behandelt oder onbehandelt mat 10 μM December fir 48 Stonnen op verschiddene DNA Regioune vun GKN1 an GKN2 loci. (D) MeDIP assay vun AGS oder AGS-EBV Zellen behandelt oder onbehandelt mat 10 μM December fir 48 Stonnen um bewosst Regioune fir alpha globin-2, GAPDH, CDC7, FOXP2, HDAC3, oder MAP3KIP2. (E) Genom Positioun vun primers fir GKN1-GKN2 Chip an MeDIP assays benotzt. * Bedeit p &Si besteet; .05, ** Beweist p &Si besteet; .005. Feeler Baren uginn sdm fir n = 3. VerfÜgung besser Fir de Mechanismus vun GKN1 an GKN2 epigenetic Repressioun verstoen, iwwerpréift mir d'DNA methylation Niveauen mat Duerch cytosine-spezifesch antibody ausernee DNA immunoprecipitation (MeDIP) assay. Mir assayed de Räichtum vun methylated DNA an der GKN1-GKN2 Kontroll Regioun an AGS an AGS-EBV Zellen mat oder ouni December Behandlung (Dorënner 5C). Mir gesinn eng relativ Beräicherung vun methylated CpG op enger Regioun tëscht der EBNA1 bindend Site an GKN2 Transkriptiouns Start Site (GKN2_A). December Behandlung Nerve enger Ofsenkung MeDIP Signal am meeschte Regioune wou e Signal nogewise gouf, suggeréiert datt December Behandlung fir eng allgemeng Reduktioun vun DNA methylation gefouert. Ähnlech Verloscht vun CpG methylation war um alpha-globin Gentherapie observéiert (déi EBNA1 net festleeën), a bei verschiddene EBNA1 bindend Siten, dorënner HDAC3 an MAP3K7IP (Dorënner 5D). Mir bemierken, och dass MeDIP Signaler wéi zu AGS Zellen generell méi héich an EBV-AGS goufen, proposéiert, datt EBV Uklang Wonn Promotioun kann oder DNA methylation uechter d'Provider Nepgen stabiliséieren. VerfÜgung EBNA1 Ausschöpfung activéiert GNK1 an GKN2 mRNA Ausdrock am EBV positive epithelial Zellen VerfÜgung fir erauszefannen, ob EBNA1 zu der transcriptional Repressioun vun GKN1 an GKN2 bäigedroen, mir benotzen siRNA (Dorënner 6) éischt zu AGS-EBV Zellen EBNA1 ze ewech envisagéiert. Mir entsteet eng siRNA d'Net-coding UTR vun EBNA1 mRNA, "3 gezielt déi deelweis EBNA1 FAQ do an AGS-EBV Zellen (Dorënner 6B). Ausschöpfung vun EBNA1 schéinen en ~ 5 fantastesch Aktivatioun vun GKN2, mat wéineg Magnéitfeld Aktivatioun vun GKN1 (Dorënner 6A). Dës Conclusiounen hindeit datt EBNA1 als transcriptional repressor vun GKN2 zu AGS-EBV Zellen Funktioun kënnen. Figur 6 siRNA Ausschöpfung vun EBNA1 bewierkt de-Repressioun vun der GKN1 an GKN2 zu AGS-EBV Zellen. siCtrl oder siEBNA1 transfected AGS-EBV Zellen vun RT-Hinnen alleguer fir GKN1 oder GKN2 mRNA Niveau relativ zu bewosst GAPDH (A) assayed goufen. Zellen sech op 72 Stonnen Post-transfection mat siRNA recoltéiert. Western blot weist EBNA1 (erop Rot) an Luede Kontroll Actin (ënneschten Rot) zu AGS-EBV Zellen (B). Feeler Baren weg Standard deviation aus der mëttlerer (sdm) fir n = 3. VerfÜgung EBNA1 GKN1 an GKN2 Transkriptiouns der DNA demethylation VerfÜgung bremst weider Fir de Beitrag vun EBNA1 zu GKN1 an GKN2 Transkriptiouns Regulatioun beschen, getest mir den Effet vun ectopic Ausdrock vun EBNA1 eleng op December-entschlof Niveau vun GKN1 oder GKN2 Transkriptiouns am GC Zellen. AGS Zellen sech mat enger EBNA1 ausdrécken lentivirus transduced. Stabil AGS-EBNA1 (pLU-EBNA1) oder AGS- Kontroll Vecteure (pLU-Vec) Zell Strecken erausgesicht a fir GKN1 an GKN2 mRNA Niveauen assayed. Mir gesinn, datt AGS-EBNA1 Zellen hat e ~ 2-3 fantastesch héich basal Niveau vun GKN1 an GKN2 mRNA relativ zu den Elteren AGS Zellen (Dorënner 7A). Allerdéngs,-December Bedrug mRNA Niveau vun GKN1 an GKN2 sech zu AGS-EBNA1 Verglach zu AGS Zellen (Dorënner 7B) attenuated. December Behandlung gefouert och zu engem groussen Zouhuele EBNA1 mRNA Niveauen (Dorënner 7C). Fir erauszefannen, ob d'Auswierkungen vun EBNA1 op GKN1 an GKN2 zu AGS Zelle spezifesch waren, transduced mir aner EBV negativ GC Zell Linn MKN74 mat EBNA1 lentivirus (Dorënner 7D-F). Ähnlech zu AGS Zellen, fonnt mir dass EBNA1 basal Niveau vun GKN1 an GKN2 fräi, mä inhibited der Fähegkeet vun December fir weider GKN1 an GKN2 mRNA Niveauen (Dorënner 7D an E) induce. Mir confirméiert datt December-Behandlung duerch Miessunge EBNA1 mRNA Niveauen efficace ass, déi fräi ~ 7 fantastesch (Dorënner 7F). Dës Conclusiounen hindeit datt ectopic Ausdrock vun EBNA1 basal Erhéijung kann, mä inhibit December-entschlof Niveau vun GKN1 an GKN2 Transkriptiouns am EBV-negativ GC Zell Linnen. Figur 7 EBNA1 bremst GKN1 an GKN2 Transkriptiouns der DNA demethylation am GC Zellen. (A) AGS Zellen sech mat pLU-Vecteure (Vec) transduced oder pLU-EBNA1 an dann onbehandelt (Untr) oder behandelt mat 10 μM 5'-azacytidine (December) fir 48 Stonnen. GKN1 an GKN2 mRNA sech duerch qRT-Hinnen alleguer relativ zu GAPDH laachen. (B) falen Aféierungs- vun GKN1 an GKN2 mRNA vun December sech aus Rot A. laachen (C) qRT-Hinnen alleguer Analyse vun EBNA1 mRNA Niveauen am AGS Zellen. (D) Same wéi am A, ausser mat MKN74 anstatt AGS Zellen. (E) falen Aféierungs- vun GKN1 an GKN2 mRNA laachen aus Rot D. (F) qRT-Hinnen alleguer Analyse vun EBNA1 mRNA Niveauen am MKN74 Zellen. * Bedeit p &Si besteet; .05, ** Beweist p &Si besteet; .005. Feeler Baren uginn sdm fir n = 3. VerfÜgung Diskussioun VerfÜgung An dëser Etude, mir bestëmmt eng héich-realiséiert EBNA1 bindend Site vun de Promoteur Kontroll Regioun vun der divergently ausserdeem GKN1 an GKN2 Genen "5. EBNA1 bindend Siten sech zu zwee onofhängeg Chip-weider Daten baut aus EBV positive lymphoid BL Zellen Raji an EBV positive epithelial nasopharyngeal carcinoma Zellen C666-1 (Dorënner 1A) observéiert. Mir bestätegt dës bindend Siten duerch konventionell Chip-qPCR zu souwuel Zell Linnen (Dorënner 1B an C). EBNA1 war och mat stilvoller recombinant EBNA1 DBD FAQ (Dorënner 1D) direkt op dëse Siten duerch EMSA zu kruet gewisen. Mir weisen datt GKN1 an GKN2 mRNA Niveauen am meeschte Zell Linnen relativ zu der Primärschoul gastric Otemschwieregkeeten héich repressed sinn (Dorënner 2). Fir d'Potential Roll vun EBV an EBNA1 an der transcriptional Kontroll vun GKN1 an GKN2 studéieren, generéiert mir eng EBV positive AGS gastric carcinoma Zell Linn. Mir weisen datt EBV eng Variant Typ bestëmmten ech Muster an AGS Zellen latency (Dorënner 3), an dass EBNA1 festleeën kann un der GKN1 /GKN2 Promoteur Regioun am bewosst chromosome (Dorënner 4C). Mir hunn och déi GKN1 an GKN2 mRNA weider am EBV positive AGS Zellen relativ opgeléist goufen EBV negativ AGS Zellen (Dorënner 4D) ze kontrolléieren. Mir weisen dann dass December-Behandlung fir d'Erhéijung Ausdrock vun GKN1 an GKN2 (Dorënner 5A) gefouert, an datt EBV Uklang Wonn bremst December Aktivatioun vun GKN2 (Dorënner 5B). Mir hu fonnt, datt siRNA Ausschöpfung vun EBNA1 am EBV positive AGS Zellen féiert zu Transkriptiouns Aktivatioun vun GKN2 (Dorënner 6). Mir weisen awer och, datt EBNA1 ectopic Ausdrock mëttelméisseg basal Majoratiounen, mee bremst den December-entschlof Niveau vun GKN1 an GKN2 Transkriptiouns (Dorënner 7). Geholl zesummen, weg dëse Conclusiounen datt EBNA1 zu der Zell Zorte Promoteur Kontroll Regioun an Multiple GKN1-GKN2 Photo'en, an d'Méiglechkeet, respektiv datt EBNA1 dréit zu der transcriptional an epigenetic Repressioun vun der GKN1 an GKN2 entholl suppressor Genen am EBV positive GC.
EBV Uklang Wonn ass bekannt de tumorigenic phenotype vun gastric carcinoma Zellen [29-31] ze erhéijen. GKN1 an GKN2 ginn am Rapport als Zell Wuesstem inhibitors an entholl suppressors am GC zu Funktioun [20, 21, 23, 25-27]. Eis mRNA Ausdrock Donnéeën héich-Niveau mRNA Ausdrock nëmmen an der Primärschoul normal gastric Otemschwieregkeeten weist sinn konsequent mat engem Roll vun GKN1 an GKN2 als entholl suppressor. Allerdéngs waren mir net capabel ze weisen, datt iwwer-Ausdrock vun entweder oder béiden GKN1 oder GKN2 zu AGS oder AGS-EBV eng Zell Zyklus verhaft Doudesursaach oder reduzéieren Nuetsvolen (Donnéeën net gewisen). Dëst deit drophin, datt GKN1 an GKN2 fonktionnéieren éischter Etappe vun entholl Zell Evolutioun, oder zu méi komplex entholl microenvironments. Mir spekuléieren, datt EBNA1 an Situatiounen engem méi nozekommen Effekt op GKN1 an GKN2 Ausdrock muss kënne wou EBV Primärschoul gastric Zellen globalen kann wou basal Ausdrock vun GKN1 an GKN2 sinn héich a wichteg fir entholl Ennerdréckung. VerfÜgung virdrun publizéiert Studie berichten iwwer propedeutësch GKN1 an GKN2 Transkriptiouns ënnerläit epigenetic Ennerdréckung vun DNA methylation an all Formen vun GC [21]. Eis Studien sinn konsequent mat der Roll vun DNA methylation an der epigenetic Ennerdréckung vun GKN1 an GKN2 zu AGS Zellen. Behandlung mat December schéinen der 4-10 fantastesch Erhéijung vun GKN1 an GKN2 mRNA Ausdrock (Dorënner 5A), an MeDIP réischt Beräicherung vun methylated DNA um Promoteur Regiounen (Dorënner 5C). AGS-EBV Zellen hat eng Erhéijung vun DNA methylation um puer bewosst Siten weisen, dorënner Regiounen der EBNA1 Ëmfeld Siten um GKN1 Promoteur Regioun (Dorënner 5C) obligatoresch, an der HDAC3 an MAP3K7IP2 Genen (Dorënner 5D). Allerdéngs huet d'Präsenz vun EBNA1 zu AGS-EBV Zellen net verhënneren demethylation op dës Siten-December entschlof. Dëst deit drophin, datt EBNA1 Transkriptiouns aus puer Promoteuren géint kënnen, wéi GKN2, duerch e Mechanismus verschidde vun DNA methylation. Allerdéngs, ectopic Ausdrock vun EBNA1 eleng produzéiert e méi komplizéiert phenotype, eng kleng Erhéijung vun basal Ausdrock warem, mä d'Auswierkunge vun December-entschlof demethylation (Dorënner 7) lagert. Dëst kann hindeit, datt dat EBNA1 anescht kann fonktionnéieren wann ectopically ausgedréckt, wéi wann an de Kontext vun der Haren Nepgen ausgedréckt. Trotzdem, eis Conclusiounen hindeit datt EBNA1 déi normal transcriptional Regulatioun vun der GKN1 an GKN2 Genen perturbs. VerfÜgung Déi genee Funktioun vun EBNA1 an Transkriptiouns Regulatioun bleift onkloer. EBNA1 huet an der transcriptional Aktivéierung a Repressioun vun béiden Haren a bewosst Genen [32, 33] agebonne ginn. EBNA1 kënnen hir eege mRNA Ausdrock vun der EBV Qp zu Typ III latency géint, wou Repressioun huet zu steric Amëschen mat RNS polymerase verbonne ginn II zu der Transkriptiouns Initiatioun Site bindend [34]. Op der aner Hand, kann EBNA1 CP an LMP1 Promoteuren an Typ III latency aktivéieren, wou et als eng enhancer-wëll Faktor Funktioun kënnen [35-37]. EBNA1 gouf an Transkriptiouns Aktivatioun vun e puer bewosst Genen, dorënner de Nox2 Gentherapie Équipe an reaktiv Sauerstoff Arten Équipe [19] agebonne. EBNA1 kann och Provider-Zell Transkriptiouns duerch eng global Remodeling vun de Provider chromosome [38] betreffen. Soumat kënnen EBNA1 bewosst Transkriptiouns duerch multiple direkten an indirekte Mechanismen ofzeänneren. VerfÜgung sinn Epigenetic Modifikatioune bekannt eng wichteg Roll am EBV-verbonne gastric carcinoma ze spillen [39]. Spannen, AGS Zellen EBV bacmid genomes haten héich Niveaue vu methylated DNA op ville getest Siten (Dorënner 5D) Droen. Dat ass mat der méiglecher Roll vun EBV an der methylation vum Provider entholl suppressor Genen konsequent [40]. Dëst ass och konsequent mat de Conclusiounen, dass EBV positive GC DNA methylation um Promoteur Regioune vun e puer Eckdaten GC entholl suppressors erhuewen huet, dorënner gastrokine Genen [39, 41-45]. Iwwerdeems EBNA1 bei DNA methylated Regioune vun der GKN2 gebonnen, mir dass EBNA1 modulates DNA methylation um GKN1 an GKN2 Siten (Donnéeën net gewisen) ze weisen knapp waren. Mä, ass et méiglech, datt EBNA1 am Veräin mat aneren Haren encoded oder entschlof Faktor kann GKN1 an GKN2 transcriptional Repressioun duerch eng chromatin-ofhängeg an strukturell Mechanismus stabiliséieren datt DNA methylation verstärkt. Et ass och méiglech, datt EBNA1 GKN1 oder GNK2 nëmmen an Otemschwieregkeeten oder entholl microenvironments regléieren kann dat net einfach geschloe zu Zell Kultur recapitulated sinn. Iwwerdeems d'Funktioun vun EBNA1 bindend Zell chromosome Siten zu Gaascht e wichtege Beräich vun Enquête bleift, méi mechanesch Wonn Modeller kann potenziellen Roll néideg sinn am Wou muss ech Provider Zell Gentherapie Ausdrock an carcinogenesis ze entschlësselen. VerfÜgung Method VerfÜgung BTS, plasmids, an lentivirus Wonn VerfÜgung EBV-positiv Burkitt d'lymphoma Raji Zellen, EBV positive nasopharyngeal carcinoma C666-1 Zellen, an gastric carcinoma Zell Linnen (e Geschenk vum Dr. Antonia R. Sepulveda, Columbia University) dorënner GTL, MKN28, MKN74, SNU638 sech haten an RPMI 10% FBS wouvun a mat Antibiotiken (penicillin an streptomycin) ergänzt. Gastric carcinoma AGS Zellen (ATCC Nr loosen-1739) waren an F-12K wouvun 10% FBS haten. Primärschoul Mond epithelial Zellen sech duerch Dr. Manjunatha Benakanakere, Universitéit vun Pennsylvania an cultured zu Keratinocyte-SFM mëttelfristeg gëtt. EBV-LCL war vun der Primärschoul Wonn vun Randerscheinung Blutt mononuclear Zellen (PBMC) mat EBV BAC virions aus stimuléiert 293-EBV Zellen [46, 47] generéiert etabléiert. EBV-LCL enthält eng hygromycin B resistent EBV bacmid zu RPMI wouvun 10% FBS haten sech, hygromycin B (100 μg /ml), glutamax (Invitrogen), an Antibiotiken. AGS-EBV Zellen sech aus AGS Zellen entsteet Co-Territoire mat EBV-LCL vun engem virdrun publizéiert Co-ubauen Method beschriwwen AGS Zellen Wonn mat rEBV duerch Zell-ze-Zell Kontakt [48] mat e puer Ännerungen evaluéieren. Kuerz, EBV-LCL vun 20 Dummeldéng /ml 12-O VerfÜgung -tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) an 1 mm Natrium butyrate (NaB) 24 Stonnen virun Co-ubauen entschlof war. D'entschlof EBV-LCL Zellen sech zweemol mat PBS zou ze misst de Pinguin Agenten ewechhuelen, resuspended mat komplett RPMI mëttel- um 10 6 Zellen /ml virun der Co-incubation. AGS Zellen sech zu 6-gutt Placke 24 Stonnen ier Co-ubauen plated, dann 60 - 70% a Spuenien wär AGS Zellen an 1 ml komplett F-12K mëttelfristeg waren an 1 ml mat 10 6 entschlof an Katakombe EBV-LCL Zellen incubated komplett RPMI. 24 Stonnen méi spéit, 2 ml vun Serum gratis F-12K mëttel- bis all gutt war dobäi dem FBS Konzentratioun op 5% ze reduzéieren Zell overgrowth ze verhënneren. 3 Deeg no Co-incubation, EBV-LCL Zellen sech aus der Co-Kulturen ofgegruewen an der AGS Zellen sech grëndlech mat PBS op d'mannst 5 Mol gewäsch keng vun den Donateuren EBV-LCL Zellen ze läschen. D'Personal AGS Zellen war dann mat frëschen F-12K mëttelfristeg mat 10% FBS an 100 μg /ml hygromycin B an der Auswiel mëttelfristeg war all 2 bis 3 Deeg bis d'Krankheet AGS Zellen geformt Hyg B Auswiel Kolonien mat GFP Ausdrock (normalerweis geännert incubated 3 bis 4 Wochen an der Co-ubauen). D'Auswiel Kolonien sech dann hinzeginn a fir EBNA1 Ausdrock an EBV Nepgen Kopie Zuel virun Thema ze Experimenter getest. AGS-EBV Zellen an F-12K mëttelfristeg mat 10% FBS an 100 μg /ml hygromycin B. VerfÜgung pLU-EBNA1 Lentivirus Ausdrock Vecteure haten sech war vun Hinnen alleguer amplification vun EBNA1 mat primers (GCGGGATCCTCTGACGAGGGGCCAGGTACAGGACCT an ATCGTCGACTCACTCCTGCCCTTCCTCACCCTCATC) gebaut Aféiere engem 5 ' BamH ech an 3 "Sal ech Site ze pLU-TCMV-FMCS-pPURO am Kader gekloonten. AGS oder MKN74 Zellen sech mat Lentivirus ausdrécken pLU-EBNA1 oder pLU Kontroll Vecteure generéiert frësch aus 293T Zellen infizéiert. Krankheet AGS oder MKN74 Zellen sech dann mat 2,5 μg /ml Puromycin fir 10 bis 14 Deeg ausgewielt. Déi gewielte Zellen sech hinzeginn a behandelt mat oder ouni 5'-azacytidine fir 48 Stonnen duerno zu RT-Hinnen alleguer ënnerworf. VerfÜgung siRNA géint EBNA1 an siRNA Control (Cat. Nr D-001810-01-20) sech aus all kaaft Dharmacon. siRNA ausernee géint EBNA1 3'UTR sech mat der Zil- Haaptrei CGGAGAUGACGGAGAUGAAUU Wierderbuch. Transfection vun siRNA duplexes war andems Oligofectamine (Dharmacon) gehaal, folgende Produzente Spezifikatioune. VerfÜgung Chromatin immunoprecipitation (Chip) assays VerfÜgung Chip assays sech standing wéi virdru beschriwwen [49]. All Auteuren liesen an guttgeheescht der Finale mëttelalterlech Handschrëft. VerfÜgung

• Laang Net-coding RNS Ausdrock Profil an mënschlechen gastric Kriibs a seng Krankheete significances
• An Silico Analyse vun Gastric carcinoma Serial Analys vum Gene Expression Bibliothéiken verréid verschiddene Profiler mat ethnicity