EBNA1 privalomas ir epigenetinius reguliavimas gastrokine auglio slopinamojo genų skrandžio karcinoma ląstelių

EBNA1 privalomas ir epigenetinius reguliavimas gastrokine auglio slopinamojo genų skrandžio karcinoma ląstelių
Santrauka
faktai
Epstein-Barr virusas (EBV) latentiškai užkrečia ~ 10% skrandžio karcinoma (GC). Epstein-Barr atominės antigeno 1 (EBNA1) išreiškiamas EBV susijusių GC, ir gali įpareigoti šeimininko DNR, kur ji gali turėti įtakos ląstelių genų reguliavimo. Čia mes parodysime, kad EBNA1 jungiasi tiesiai į DNR srovę iš diverguojančiai aranžuotų GC-specifinis auglio slopinamojo genų gastrokine 1 (GKN1) ir gastrokine 2 (GKN2).
Metodai
mes naudojame lusto Eil.Nr., Chip-qPCR, ir EJSA įrodyti, kad EBNA1 jungiasi tiesiai į GKN1 ir GKN2 promotoriaus lokuso. Mes generuoti AGS-EBV ir AGS-EBNA1 ląstelių linijas išstudijuoti EBNA1 poveikį GKN1 ir GKN2 iRNR išraiškos arba be 5 'azacitidinas gydymą.
Rezultatai
Mes parodome, kad gastrokine genai transkripciškai nutildė DNR metilinimo , Mes taip pat rodo, kad latentinis EBV infekcija dar labiau sumažina GKN1 ir GKN2 išraišką AGS skrandžio karcinoma ląstelių, ir kad siRNR išeikvojimas EBNA1 iš dalies palengvina šį represijas. Tačiau negimdinis išraiška EBNA1 šiek tiek padidėjo GKN1 ir GKN2 bazinio iRNR lygiui, bet sumažinti jų reagavimą į demetilinimą agentas.
Išvados
šios išvados rodo, kad EBNA1 jungiasi prie skirtingo propaguotojas GKN1 ir GKN2 genų GC ląstelių, ir rodo, kad EBNA1 prisideda prie sudėtingos transkripcijos ir epigenetinio dereguliavimo iš GKN1 ir GKN2 navikas slopintuvas genų EBV teigiamą GC.
Raktiniai žodžiai
EBV EBNA1 Skrandžio karcinoma Gastrokine lustas Eil epigenetinius Įvadas
Epstein-Barr virusas ( EBV) yra žmogaus gammaherpesvirus rasti platų limfiniame ir epitelinių ląstelių navikų, įskaitant burkitt limfoma, Hodžkino liga, nosiaryklės karcinomą (NPC), ir po transplantacijos limfinio audinio liga (peržiūrėta [1, 2]). Daugiau neseniai, EBV buvo rasta ~ 10% visų skrandžio karcinoma (GC) atvejų pasaulyje [3, 4]. EBV susijusių GC buvo įrodyta, kad būti monokloninis atauga iš EBV-užkrėstas skrandžio epitelinių ląstelių ir yra laikomas skiriasi potipio GC [5, 6]. Kadangi GC dažnis yra artimas 900.000 žmonių per metus [7], EBV susijęs GC gali būti viena iš labiausiai paplitusių EBV susijusių vėžio.
EBV teigiamų skrandžio karcinoma ląsteles, EBV nustato variantas I tipo latency, kur Baro transkripcija yra tik kanoninės I tipo genai EBNA1, Ebers, Bart šeima ne kodavimo RNR ir miRNAs, bet su kai kurių papildomų išraiškos LMP2A [6, 8-11]. Tarp šių gaišties genų, EBNA1 yra tik virusinė branduolinės baltymas, kuris yra aptinkamas EBV susijusių GC. EBNA1 yra reikalingas latentinis episomal infekcijos nustatymo ir ilgalaikio išlikimo latentiškai infekuotų ląstelių [12-15]. EBNA1 yra DNR surišantis baltymas, kuris prisiriša prie abiejų virusinių ir priimančiųjų chromosomos vietose. Privalomas svetainių viruso genomo buvo būdingas ir esmines funkcijas į replikacijos ir transkripcijos kontrolės virusinės genų ekspresiją. Tačiau EBNA1 sekos-specifiškai jungiasi su pagrindine chromosomos funkcija yra mažiau gerai suprantamos. Nors EBNA1 gali jungiasi prie promotoriaus regionuose kelių šeimininko genus, lieka neaišku, ar šie genai yra taikomos EBNA1 reglamento [12, 16, 17]. Padidėjusi iš EBNA1 DNR rišantis domenas, kuris veikia kaip dominuojančios negatyvą EBV infekuotų ląstelių, gali slopinti ląstelių gyvybingumą sveikų ląstelių, rodančių, kad EBNA1 prisiriša prie ir reguliuoja ląstelių genus svarbias ląstelių išlikimas [18]. Negimdinis išraiška EBNA1 buvo įrodyta, kad poveikis šeimininko ląstelė iRNR raiška [19], tačiau nėra aišku, ar šis poveikis yra tiesiogiai ar netiesiogiai susiję su konkrečių EBNA1 privalomas svetainių ląstelių genomą.
Ankstesniame tyrime mes naudojamas Chip-paskesni metodai analizuoti genomo sodrinimo svetaines EBNA1 į latentiškai užkrėstų raji burkitt limfoma ląstelių ir nustatė daug ląstelių svetaines saistomi EBNA1 [17]. Tarp šių EBNA1 korinio sodrinimo svetainių, mes nustatė reikšmingą EBNA1 privalomas viršūnę esančią gastrokine 1 (GKN1) ir gastrokine 2 (GKN2, taip pat žinomas kaip trilapis faktorius bendrauja baltymo (TFIZ1)) genų klasterius. GKN1 ir GKN2 buvo nustatyti remiantis jų dažnai praradimo išraiška navikinių skrandžio karcinoma epitelio ląstelių, lyginant su normaliu skrandžio audinyje [20-22] (įvertintų pagal [23]). Keli naujausi tyrimai aprašyti antiproliferacinis ir anti-invazinių veiklą GKN1 skrandžio epitelinių ląstelių, kurios, kartu su savo dažnai išraiška nuostolių vėžiu, sako, jog tai veikia kaip konkretaus skrandžio epitelio [21, 24-28] naviko slopintuvas. GKN1 gali slopinti ląstelių migraciją ir invazija žaizdų gijimą, transwell ir Matrigel testą, taip pat alter ląstelių žymenų, susijusių su epitelio-mezenchiminių perėjimo [26]. GKN1 ir GKN2 genai yra labai arti ir transkripcija į priešingas puses, o tai rodo, kad jie greičiausiai praleisite dvikryptė promotorius, ir gali derinti reglamentavimą pasidalino transkripcijos reguliavimo veiksnių (peržiūrėtas [23]).
Tai tyrimas, mes įrodytas tiesioginis privalomas tarp EBNA1 ir GKN1-GKN2 loci ir ištyrė GKN1 ir GKN2 genų ekspresijos moduliacijos iki EBV infekcijos ir EBNA1 baltymų. Mūsų rezultatai rodo, kad EBV infekcija gali dar labiau slopina GKN1 ir GKN2 išraišką, ir kad EBNA1 praradimas gali palengvinti epigenetinius de-represijas GKN2 transkripcijos. Mes taip pat pastebėjo, padidėjęs DNR metilinimo lygis ne GKN1 ir GKN2 promotoriaus regionuose, ir galimas vaidmuo EBNA1 į dereguliavimo ir epigenetinio represijų šio auglio slopinamojo lokuso.
Rezultatai
identifikavimo aukštos užėmimo EBNA1 privalomu svetainę GKN1 -GKN2 lokusas pagal CHIP-Seq
Anksčiau paskelbti Chip-Eil duomenis iš Raji BL ląstelių atskleidė ribotas skaičius labai prisodrinto EBNA1 jungimosi vietų, remiantis piko balai ir skaityti numeriai [17]. Daugiau patikrinimas atskleidė stiprų EBNA1 prijungimo vietą, esančią prieš srovę nuo starto vietų už diverguojančiai aranžuotų GKN1 ir GKN2 genų (1a pav, viršutinė kelio). Panašus EBNA1 privalomas lygis buvo atskirame lustas Eil eksperimento atlikto EBV teigiamas nosiaryklės karcinomą ląstelių linijos C666-1 (pilnas Chip-paskesni duomenys turi būti skelbiami kitur), nurodant, kad tai privalomas pasitaiko tiek epitelio, taip pat limfiniame tipų ląstelių (pav 1A, mažesnis bėgių). Pikinės centras buvo įsikūręs ~ 5 KiB iš GKN2 ir ~ 15 KB iš GKN1 transkripcijos starto vietų. Lusto qPCR buvo patvirtinti EBNA1 privalomą tuo GKN1-GKN2 promotoriaus regione tiek Raji ir C666-1 ląstelių (1b ir C pav.) qPCR nurodė, kad EBNA1 susietas su GKN1-2 svetainėje panašaus efektyvumo anksčiau patvirtintu EBNA1-privalomas svetainėje tuo PITPNB rengėjas. qPCR taip pat nurodė, kad EBNA1 privalomas GKN1-GKN2 buvo specifinis, nes ten buvo neaptinkama EBNA1 privalomas abiejuose ląstelių GAPDH lokuso ar EBV OriLyt kontrolės regionuose, kaip ir tikėtasi (1B ir C pav.) Spėjamą EBNA1 privalomas svetainėje adresu GKN1-GKN2 lokuso nustatė, derinimą su sutarimo privalomą svetainę į EBV šeimos kartojasi (fr) regione, ir tada ši seka buvo išbandyta tiesioginis jungimasis su EBNA1 EMSA (1d pav.) Išgrynintas rekombinantinis EBNA1 DBD baltymas buvo tirta dėl jungimosi su zondais, kurių sudėtyje yra GKN1-GKN2 svetainėje (GKN1 /2), FR, arba neigiamos kontrolės seką trūksta sutarimo EBNA1 prijungimo vietą. Mes nustatėme, kad EBNA1 DBD efektyviai susietas su GKN1-GKN2 vietoje, taip pat į FR konsensuso, bet ne jungiasi prie kontroliuojančia seka. Šie rezultatai rodo, kad EBNA1 sąveikauja su GKN1-GKN2 promotoriaus regione per tiesioginį DNR surišantis su EBNA1 DBD. 1 pav EBNA1 jungiasi prie GKN1 ir GKN2 promotoriaus lokuso. (A) UCSC genomo naršyklė buvo naudojamas žemėlapį EBNA1 privalomą viršūnę gautos iš Raji ir C666-1 Chip-seq tuo GKN1 ir GKN2 genų lokusų. RefSeq komentuojami nuorašai yra nurodyti žemiau Chip-Eil viršūnę. (BC) Realaus laiko PGR įteisinimas Chip-paskesni duomenų EBNA1 privalomu svetainėje prie GKN1 /2 bendro promotoriaus regione: EBNA1 (raudoni stulpeliai) arba kontroliuoti IgG (mėlyna barai) buvo tiriami lustas Raji (B) arba C666-1 ląstelės (c) DNR jungimosi prie GKN1 /2 svetainės, PITPNB promotoriaus, GAPDH arba EBV Ori-Lyt. (D), EJSA analizė 32P paženklinti zondai, kurių sudėtyje yra kontrolė, GKN1 /2 svetainę, arba EBV FR. Kintamas dydis EBNA1 DBD baltymų buvo naudojamas privalomas reakciją (0, 100, 300, 900 GD). kaip nurodyta rodyklėmis atstovauti EBNA1 konkrečių įrištiems kompleksus arba laisvą zondą. Zondas seka GKN1 /2 svetainę ir FR pažymėti seka homologą (raudonomis raidėmis) tarp GKN1 /2 ir FR. Neigiamas (Ctrl) seka taip pat nurodė. Klaida barai rodo standartinį nuokrypį nuo vidurkio (SDM) už n = 3.
GKN1 ir GKN2 iRNR yra labai išreikštas pradinio skrandžio audinio
Mes šalia išmatuotas GKN1 arba GKN2 iRNR kiekį įvairių skrandžio karcinomos ląstelių linijų ir pirminių normalus skrandžio audinio KRL-PCR (2 paveikslas). Mes nustatėme, kad GKN1 ir GKN2 išreiškiami daug aukštesnio lygio (~ 3 × 10 4 kartus) pirminėje skrandžio audinyje negu bet kuri iš ląstelių linijų išbandytų (2A pav.) Nors daug žemesnio lygio negu pirminės skrandžio audinio, GKN1 ir GKN2 abu buvo išreikšta išmatuojamų lygių AGS skrandžio karcinoma ląstelių linijų, su GKN2 išreiškė aukštesniu lygiu nei visų kitų GC ląstelių linijų, arba EBV teigiamas B ląstelių arba NPC ląstelių linijas ( 2B pav.) Labai mažas GKN1 ar GKN2 gali būti aptikta pirminės burnos epitelio audinius, toliau rodo, kad šie genai yra specifiniai pirminės skrandžio audinių. 2 pav GKN1 ir GKN2 iRNR yra labai išreikštas pradinio skrandžio audinio. AT-PGR buvo atliekama analizuoti iRNR lygį GKN1 (mėlynos juostos) arba GKN2 (raudona barai) skirtingose ​​ląstelių linijose, įskaitant GC gautas GTL, MKN28, MKN74, SNU638, AGS, BL gautas Raji, EBV įamžinta LCL, EBV teigiamas NPC linija C666-1, arba pirminė burnos epitelio ląstelių, lyginant su (A) arba be (b) pirminių skrandžio audinio. Klaida barai rodo standartinį nuokrypį nuo vidurkio (SDM) už n = 3.
EBV latentinis sumažina GKN1 ir GKN2 iRNR išraišką GC ląstelių linijų
Norėdami išbandyti EBV latentinės infekcijos apie GKN1 ir GKN2 raiškos poveikį, mes sukurtas AGS ląstelių linija, kurių sudėtyje yra EBV B95.8 bacmid. AGS ląstelių linija buvo pasirinktas atsparumo higromicino ir GFP pozityvumo užtikrinti, kad jame bacmid komponentus. Norėdami apibūdinti AGS-EBV ląstelių liniją, pirmiausia analizuojama EBV genų ekspresijos šabloną (3 paveikslas). Mes nustatėme, kad AGS-EBV ląstelės išreiškė aptikti iRNR lygius EBNA1, BARF0 ir LMP2A, bet ne LMP1, EBNA2 arba EBNA3C (3 paveikslas). Nors EBV B95.8 bacmid trūksta BART miRNAs, šie duomenys sutampa su AGS-EBV ląstelės priimti variantas I tipo latency genų ekspresijos programą su kai LMP2A, panašus į stebėtą EBV teigiamą skrandžio karcinoma naviko audinyje [8, 10 išraiška ]. Norėdami papildomai apibūdinti AGS-EBV ląsteles, mes analizuojami EBNA1 baltymų ekspresiją Vakarų dėmė (4a pav) ir EBV DNR kopijų skaičių qPCR (4b paveikslas). EBNA1 buvo atpažintas kaip vieną mažo gausa rūšių numatomai molekulinės masės (4a paveikslas). Baro kopija skaičius buvo matuojamas lyginant su EBV Ori-Lyt DNR ląstelių GAPDH (4b paveikslas). Mes nustatėme, kad AGS-EBV esančius ~ 50% mažiau kopijų viruso genomo, palyginti su EBV teigiamų LCLs. Norėdami nustatyti, ar EBNA1 išlaikė savo DNR surišimo aktyvumą į AGS-EBV, mes atliekame įprastas lustas tyrimai (4C pav.) Mes nustatėme, kad EBNA1 susietas su EBV Dyad simetrija (DS) DNR, taip pat į GKN1-GKN2 privalomą svetainę AGS-EBV ląsteles. Mes šalia paklausė, ar GKN1 arba GKN2 iRNR lygiui įtakos turėjo EBV latentinės infekcijos AGS ląstelių lyginant RT-qPCR raiškos lygį AGS palyginti su AGS-EBV ląstelių (4d pav). Mes nustatėme, kad GKN1 ir GKN2 buvo represuoti ~ 3-8 kartus į AGS-EBV, palyginti su AGS ląstelių, o tai rodo, kad EBV latentinis skatina arba stabilizuoja transkripcijos represijas GKN1 ir GKN2. 3 pav apibūdinimas EBV genų raiškos AGS-EBV ląstelių linijų. AGS, AGS-EBV teigiamas, ir EBV LCLs buvo tiriami dėl iRNR išraiškos KRL PGR pradmenis EBNA1, BARF0, LMP2A, LMP1, EBNA2 arba EBNA3C, kaip nurodyta. Klaida barai rodo standartinį nuokrypį nuo vidurkio (SDM) už n = 3.
4 pav EBV infekcija AGS ląstelių slopina GKN1 ir GKN2 transkripciją. (A), Vakarų dėmė analizė EBNA1 baltymų raiškos AGS-EBV ląstelių, lyginant su EBV-neigiamas AGS ląstelių buvo atliekama naudojant antikūnus dėl EBNA1 (į viršų) arba aktino (apačioje). (B), DNR kopijų skaičiaus buvo tiriami realaus laiko PGR EBV Ori-Lyt DNR, lyginant su ląstelinio GAPDH lygio AGS, AGS-EBV, ir EBV LCL ląsteles. (C) lusto ir realaus laiko PGR analizė EBNA1 (raudonos juostos) arba kontroliuoti IgG (mėlyna barai) DNR privalomas ne EBV svetainių, įskaitant DS ir Ori-Lyt arba korinio svetainių, įskaitant GKN1 /2 ir GAPDH į AGS-EBV ląstelės. (D), AT-PGR buvo atliekama analizuoti iRNR lygį GKN1 ar GKN2 į AGS (mėlynos juostos) arba AGS-EBV ląstelių (raudonųjų barai). ** Nurodo p < 0,005. Klaida barai rodo standartinį nuokrypį nuo vidurkio (SDM) už n = 3.
EBV padidina DNR metilinimo priklausomą represijas GKN1 ir GKN2 mRNR GC ląstelių linijų
GKN1 ir GKN2 gali būti taikomos epigenetinio slopinimo GC ir audinių kultūra ląstelių linijos. Ištirti šią galimybę, mes patikrinome, ar gydymas DNR demetilinimą agentas 5 "azacitidino (AZA) arba deacetylating agentas (NAB) kartu su phorbol esteris (TPA) būtų aktyvuoti GKN1 arba GKN2 į AGS ląstelių (5a pav.) Mes nustatėme, kad Aza gydymas lėmė ~ 10 kartų padidinti GKN2 ir ~ 4 kartus didesnis GKN1 transkripcijos į AGS elgiamasi ląsteles. Priešingai, NAB /TPA gydymas pagaminta tik ~ 2 kartus aktyvavimo transkripcijos. Šie rezultatai rodo, kad tiek GKN1 ir GKN1 yra aktyviai epigenetinio represijų per DNR metilinimo. Norėdami patikrinti, ar EBV turėjo kokį nors poveikį Aza sukeltas aktyvavimo GKN1 ar GKN2, mes palygino AZA gydymo poveikį AGS palyginti su AGS-EBV ląstelėmis KRL-PCR (5b pav.) Mes nustatėme, kad GKN1 ir GKN2 buvo efektyviai įjungiamas AZA gydymo AGS ląsteles, tačiau mažesniu mastu AGS-EBV. Be šių eksperimentų, aza-sukeltas aktyvavimo GKN2 buvo visiškai panaikintos, o aktyvavimo GKN1 buvo tik iš dalies yra silpnos. Aza-gydymas taip pat paskatino ~ 8,4 kartus padidėjo EBNA1 mRNR lygių, o tai rodo, kad aza gydymas stimuliuoja EBV lizės genų raišką AGS-EBV ląstelių linijų. Šie rezultatai rodo, EBV geno produktai išvengti GKN2 ir mažesniu mastu GKN1 aktyvavimo po AZA gydymą. 5 pav EBV sustiprina GKN1 ir GKN2 genų ekspresijos represijas DNR metilinimo. (A) AGS ląstelės buvo gydomi 10 mikromolių Aza, arba 1 mM NaB ir 20 ng /ml TPA 48 valandas ir analizuojami RT-PGR metodu dėl GKN1 arba GKN2 ekspresijos lygio, palyginti su neapdorotų AGS. (B) AGS ląstelių arba AGS-EBV ląstelės buvo apdoroti arba neapdoroti su 10 mikromolių Aza 48 valandas, tada tiriami dėl GKN1, GKN2 iRNR arba mRNR EBNA1 lygiais. (C) MeDIP kiekybinė analizė AGS arba AGS-EBV ląstelių apdoroti arba neapdoroti su 10 mikromolių Aza 48 valandas skirtingose ​​DNR regionuose GKN1 ir GKN2 loci. (D), MeDIP kiekybinė analizė AGS arba AGS-EBV ląstelių apdoroti arba neapdoroti su 10 mikromolių Aza 48 val ne korinio regionuose alfa Gylių-2 GAPDH, CDC7, FOXP2 vietomis, HDAC3 arba MAP3KIP2. (R) Genomo gruntai naudojami GKN1-GKN2 Chip ir MeDIP tyrimų padėtis. * Nurodo p < 0,05, ** nurodo p < 0,005. Klaida barai nurodyta SDM už n = 3. pervežimas Siekiant geriau suprasti GKN1 ir GKN2 epigenetinio represijų mechanizmą, mes išnagrinėjome DNR metilinimo lygis per metilo Cytosine specifinius antikūnus nukreiptas DNR imunoprecipitacijos (MeDIP) testą. Mes tiriami iš denatūruotą DNR, GKN1-GKN2 valdymo regiono AGS ir AGS-EBV ląstelių su arba be AZA gydymo (5c pav) sodrinimą. Mes nustatėme santykinį sodrinimą Metilinto CPG ne regione tarp EBNA1 privalomą svetainėje ir GKN2 transkripcija starto vietoje (GKN2_A). Aza gydymas lėmė MeDIP signalo sumažėjimo daugelyje regionų, kur buvo aptiktas signalas, o tai rodo, kad aza gydymas lėmė bendrai mažinti DNR metilinimo. buvo stebimas panašus praradimas CpG metilinimo ne alfa-globino geno (kuri nesijungia EBNA1) ir keliose EBNA1 privalomas svetainėse, įskaitant HDAC3 ir MAP3K7IP (5d pav). Mes taip pat pažymėjo, kad MeDIP signalai paprastai buvo didesnis EBV-AGS nei AGS ląstelių, o tai rodo, kad EBV latentinė infekcija gali skatinti arba stabilizuoti DNR metilinimas visoje priimančiosios genomą.
EBNA1 išeikvojimas aktyvuoja GNK1 ir GKN2 iRNR išraišką EBV teigiamų epitelio ląstelių
Norėdami nustatyti, ar EBNA1 prisidėjo prie transkripcijos represijų GKN1 ir GKN2, mes pirmą kartą mėgino ardančių EBNA1 į AGS-EBV ląstelių naudojant siRNA (6 paveikslas). Mes generuoja siRNA taikymo 3 "ne kodavimo UTR iš EBNA1 iRNR, kuri iš dalies išeikvoti EBNA1 baltymų AGS-EBV ląstelių (6b pav.) Išeikvojimas EBNA1 lėmė ~ 5 kartus aktyvavimo GKN2, su mažai aptinkamų aktyvavimo GKN1 (6a pav.) Šie rezultatai rodo, kad EBNA1 gali funkcionuoti kaip transkripcijos slopinančioje iš GKN2 į AGS-EBV ląsteles. 6 pav siRNR išeikvojimas EBNA1 sukelia de-represijas GKN1 ir GKN2 į AGS-EBV ląsteles. siCtrl arba siEBNA1 perkeltų AGS-EBV ląstelės buvo tiriami RT-PCR už GKN1 arba GKN2 iRNR lygio, palyginti su ląstelių GAPDH (A). Ląstelės buvo nuimta po 72 valandų po transfekcijos su siRNA. Vakarų dėmė rodo EBNA1 (viršuje skydelis) ir pakrovimo kontrolė Actin (apatinė panelė) į AGS-EBV ląstelių (B). Klaida barai rodo standartinį nuokrypį nuo vidurkio (SDM) už n = 3.
EBNA1 slopina GKN1 ir GKN2 transkripciją po DNR demetilinimu
toliau tirti EBNA1 į GKN1 ir GKN2 transkripcijos reglamentavimo svarbą, mes išbandė poveikį negimdinis išraiška vien EBNA1 ant aza-sukeltų lygių GKN1 arba GKN2 rašybą GC ląsteles. AGS ląstelės buvo transdukuojamos su EBNA1 išreikšti lentiviruso. Stabilus AGS-EBNA1 (PLU-EBNA1) arba AGS- kontrolė vektorius (PLU-Vec) ląstelių linijas buvo atrinkti ir tiriami dėl GKN1 ir GKN2 mRNR lygiais. Mes pastebėjo, kad AGS-EBNA1 ląstelės buvo ~ 2-3 kartus didesnė bazinio lygio GKN1 ir GKN2 iRNR, palyginti su tėvų AGS ląstelių (7a pav.) Tačiau aza-indukuotos iRNR lygiai GKN1 ir GKN2 buvo susilpnintas į AGS-EBNA1 palyginti su AGS ląstelių (7b pav.) Aza gydymas taip pat lėmė didelį padidėjimą EBNA1 mRNR lygių (7c pav). Norėdami nustatyti, jeigu EBNA1 apie GKN1 ir GKN2 poveikis buvo būdingas AGS ląstelių, mes transdukuojamos kitą EBV neigiamą GC ląstelių linijos MKN74 su EBNA1 lentiviruso (pav 7D-F). Panašus į AGS ląsteles, mes nustatėme, kad EBNA1 padidino bazinių lygių GKN1 ir GKN2, tačiau slopino Aza galimybę toliau sukelti GKN1 ir GKN2 iRNR lygiui (7d ir E pav.) Mes patvirtino, kad Aza-gydymas buvo veiksmingas, matuojant EBNA1 iRNR lygiui, kuris padidėjo ~ 7 kartus (7F pav.) Šie rezultatai rodo, kad negimdinis išraiška EBNA1 gali padidinti bazinei, bet slopina Aza sukeltos lygius GKN1 ir GKN2 rašybą EBV-neigiamas GC ląstelių linijų. 7 pav EBNA1 slopina GKN1 ir GKN2 transkripciją po DNR demetilinant GC ląsteles. (A) AGS ląstelės buvo transdukuotus plu vektoriaus (vec) ar plu-EBNA1 ir tada neapdorotas (Untr) arba gydomi 10 mikromolių 5'-azacitidino (AZA) 48 val. GKN1 ir GKN2 iRNR buvo kiekybiškai KRL-PGR, palyginti su GAPDH. (B), Sulenkite indukciją GKN1 ir GKN2 mRNR iki Aza buvo kiekybiškai nuo skydelio A. (C) KRL-PGR analizė EBNA1 mRNR lygių AGS ląsteles. (D) Tas pats, kaip A, nebent naudojant MKN74, o ne AGS ląstelių. (R) Sulenkite indukciją GKN1 ir GKN2 iRNR kiekybiškai nuo skydelio D. (F) KRL-PGR analizės EBNA1 mRNR lygių MKN74 ląsteles. * Nurodo p < 0,05, ** nurodo p < 0,005. Klaida barai nurodyta SDM n = 3.
Diskusijos
Šiame tyrime mes identifikuoti didelio užimtumo EBNA1 prijungimo vietos 5 "rengėjas valdymo regione iš diverguojančiai aranžuotų GKN1 ir GKN2 genuose. EBNA1 jungimosi vietų buvo pastebėtas dviejų nepriklausomų Chip-Eil duomenų rinkinių iš EBV teigiami limfinę BL ląstelių Raji ir EBV teigiamas epitelio nosiaryklės ląstelės C666-1 (1a pav.) Mes patvirtino šiuos privalomus svetainių įprastiniais Chip-qPCR abiejų ląstelių linijas (1b ir C pav.) EBNA1 taip pat buvo įrodyta, kad tiesiogiai jungiasi prie šių EMSA svetaines su išgrynintas rekombinantinis EBNA1 DBD baltymo (1D pav.) Mes parodome, kad GKN1 ir GKN2 iRNR lygiai yra labai represuoti daugelyje ląstelių linijų, palyginti su pirmine skrandžio audinyje (2 paveikslas). Studijuoti potencialų vaidmenį EBV ir EBNA1 į transkripcijos kontrolės GKN1 ir GKN2, mes generuoja EBV teigiamą AGS skrandžio karcinoma ląstelių linijos. Mes parodome, kad EBV priima variantas I tipo latency modelį į AGS ląstelių (3 paveikslas), ir kad EBNA1 gali įpareigoti į GKN1 /GKN2 promotoriaus regione ląstelių chromosomos (4c pav.) Mes taip pat nustatė, kad GKN1 ir GKN2 iRNR buvo toliau nuslopintas EBV teigiamų AGS ląstelių santykinių kontroliuoti EBV neigiamų AGS ląsteles (4d pav.) Tada paaiškėjo, kad Aza elgesys privedė prie padidėjimas išraiška GKN1 ir GKN2 (5a pav), ir kad EBV latentinė infekcija slopina AZA aktyvavimo GKN2 (5b pav.) Mes nustatėme, kad siRNR išeikvojimas EBNA1 į EBV teigiamų AGS ląstelių veda į transkripcijos aktyvavimo GKN2 (6 paveikslas). Mes taip pat rodo, kad EBNA1 negimdinis išraiška vidutiniškai padidina bazinei, bet slopina Aza sukeltos lygius GKN1 ir GKN2 transkripcijos (7 pav.) Kartu paėmus, šie duomenys rodo, kad EBNA1 jungiasi prie GKN1-GKN2 rengėjas valdymo regiono keliais tipų ląstelių ir padidinti galimybę, kad EBNA1 prisideda prie transkripcijos ir epigenetinio represijas GKN1 ir GKN2 navikas slopintuvas genų EBV teigiamą GC.
EBV latentinė infekcija yra žinoma, kad padidinti tumorogeniškas fenotipą skrandžio karcinoma ląstelių [29-31]. GKN1 ir GKN2 Pranešama, kad veiktų kaip ląstelių augimo inhibitorių ir naviko slopintuvai GC [20, 21, 23, 25-27]. Mūsų iRNR raiška duomenų, rodančių, aukšto lygio iRNR raiška tik pirminėje normalų skrandžio audinio atitinka su GKN1 ir GKN2 vaidmenį kaip naviko slopintuvas. Tačiau mes negalėjome įrodyti, kad per išraiškos arba jų abiejų GKN1 arba GKN2 į AGS ar AGS-EBV sukelti ląstelių ciklo areštą ar sumažinti gyvybingumą (duomenys neparodyti). Tai rodo, kad GKN1 ir GKN2 funkciją ankstesniuose etapuose naviko ląstelių evoliucija, arba sudėtingesniais naviko mikroaplinkos. Mes spėlioti, kad EBNA1 gali turėti ryškesnį poveikį GKN1 ir GKN2 išraiškos tais atvejais, kai EBV gali užkrėsti pirminis skrandžio ląsteles, kur bazinis išraiška GKN1 ir GKN2 yra didelis ir svarbus naviko slopinimą.
Ankstesnės paskelbti tyrimai rodo, kad GKN1 ir GKN2 transkripcija yra taikomos epigenetinio slopinimo DNR metilinimo visose GC [21] formas. Mūsų tyrimai sutampa su DNR metilinimo vaidmenį epigenetinio slopinimo GKN1 ir GKN2 į AGS ląsteles. Gydymas Aza lėmė 4-10 kartų padidinti GKN1 ir GKN2 iRNR išraiškos (5a pav) ir MeDIP atskleidė sodrinimą Metilinto DNR tuo promotoriaus regionuose (5c pav.) AGS-EBV ląstelės padarė rodo DNR metilinimo padidėjimą kelis korinio svetainių, įskaitant regionus aplink EBNA1 jungimosi vietų tuo GKN1 promotoriaus regione (5c pav), o HDAC3 ir MAP3K7IP2 genus (5d pav.) Tačiau EBNA1 buvimas AGS-EBV ląstelių nesutrukdė Aza sukeltos demetilinimo šiose vietose. Tai rodo, kad EBNA1 gali slopinti Perrašymas iš kai kurių rengėjams, kaip GKN2 per mechanizmas skiriasi nuo DNR metilinimo. Tačiau negimdinis išraiška EBNA1 vien pagamino daugiau sudėtingas fenotipą, todėl šiek tiek padidėjo bazinio žodžio, bet apribojant Aza sukeltos demetilinant poveikį (7 pav). Tai gali reikšti, kad, kad EBNA1 gali veikti skirtingai, kai jie išreiškiami ectopically, nei tada, kai išreikštas viruso genomo kontekste. Nepaisant to, mūsų rezultatai rodo, kad EBNA1 perturbs normalų transkripcijos reguliavimą GKN1 ir GKN2 genų.
Tikslią funkciją EBNA1 transkripcijos reguliavimo lieka neaiškus. EBNA1 buvo susijęs transkripcijos aktyvavimo ir represijų abiejų virusinių ir ląstelių genų [32, 33]. EBNA1 gali slopinti savo iRNR raiška nuo EBV QP III tipo latency, kur represijos buvo susijęs su erdvinės kišimosi RNR polimerazės II jungimosi prie transkripcija inicijavimo svetainėje [34]. Kita vertus, EBNA1 gali įjungti CP ir LMP1 iniciatoriams III tipo delsą, kur ji gali veikti kaip stipriklis-kaip faktorius [35-37]. EBNA1 buvo susijęs transkripcijos aktyvavimo Kai kuriuose korinio ryšio genų, įskaitant Nox2 geno dalyvauja aktyvių deguonies formų formavimo [19]. EBNA1 taip pat gali turėti įtakos šeimininko ląstelių transkripciją per pasaulio neįvertino priimančiosios chromosomos [38]. Taigi, EBNA1 gali pakeisti ląstelių transkripciją per kelis tiesioginius ir netiesioginius mechanizmus.
Epigenetiniai modifikacijos žinoma, vaidina svarbų vaidmenį EBV susijusių skrandžio karcinoma [39]. Įdomu tai, kad AGS ląstelės vežantys EBV bacmid genomus turėjo didesnį denatūruotą DNR daugelyje tirtų svetainių (5d pav). Tai atitinka siūlomo vaidmens EBV atsižvelgiant į priimančiosios auglio slopinamojo genų [40] metilinimo. Tai taip pat suderinama su išvadomis, kad EBV teigiamas GC yra padidėjusi DNR metilinimas ne promotoriaus regionuose kelių pagrindinių GC naviko slopintuvai, įskaitant gastrokine genų [39, 41-45]. Nors EBNA1 jungiasi prie DNR denatūruotas regionuose GKN2, mes negalėjome įrodyti, kad EBNA1 moduliuoja DNR metilinimas tuo GKN1 ir GKN2 vietų (duomenys neparodyti). Tačiau, tai yra įmanoma, kad EBNA1 kartu su kitu virusiniu koduota arba sukeltas veiksnys gali stabilizuoti GKN1 ir GKN2 transkripcijos represijas per chromatino priklausomas ir struktūrinio mechanizmo, kuris sustiprintų DNR metilinimas. Ji yra taip pat įmanoma, kad EBNA1 gali reguliuoti GKN1 arba GNK2 tik audinių arba naviko mikroaplinkos, kad yra ne lengvai kartojami ląstelių kultūroje. Nors EBNA1 privalomu surengti ląstelių chromosomų svetainių funkcija išlieka svarbi sritis, tyrimo, gali būti reikalaujama, sudėtingesnių infekcija modeliai išsiaiškinti galimą vaidmenį keičiant priimančiosios ląstelių genų ekspresiją ir kancerogenezės.
Metodai
Langeliai, plazmidės, ir lentivirus infekcija
EBV teigiamas burkitt limfoma raji ląstelės, EBV teigiamas nosiaryklės C666-1 ląstelės ir skrandžio karcinoma ląstelių linijas (dovana dr Antonia R. Sepúlveda Kolumbijos universiteto), įskaitant GTL, MKN28, MKN74, SNU638 buvo palaikoma RPMI, kurių sudėtyje yra 10% FBS ir papildytas antibiotikų (penicilino ir streptomicino). Skrandžio vėžys AGS ląstelės (ATCC Nr BEL-1739), buvo prižiūrimi, F-12K, kurių sudėtyje yra 10% FBS. Pirminis burnos epitelio ląstelės buvo numatyta dr Manjunatha Benakanakere, Pensilvanijos universitetas ir kultivuojamos keratinocitų-SFM terpėje. EBV LCL buvo įsteigtas pirminės infekcijos periferinio kraujo vienabranduolėse ląstelių (PBMC) EBV AKK virusų dalelėms, gautas iš skatino 293-EBV ląstelių [46, 47]. EBV-LCL yra higromicino B atsparus EBV bacmid ir buvo išlaikytos RPMI, kurių sudėtyje yra 10% FBS, higromicino B (100 mikrogramų /ml), glutamax (Invitrogen), ir antibiotikų. AGS-EBV ląstelės buvo gautos iš AGS ląstelių kartu auginamų EBV-LCL pritaikant anksčiau paskelbtą bendro auginimo metodą, aprašytą AGS ląstelių infekcija su rEBV per mobilųjį-to-ląstelių kontakto [48] su kai modifikacijos. Trumpai, EBV-LCL buvo sukeliama 20 ng /ml 12-O
-tetradecanoylphorbol-13-acetatas (TPA) ir 1 mM natrio butiratas (NAB) 24 valandos prieš bendrai auginimas. Nulemti EBV LCL ląstelės buvo plaunami PBS du kartus visiškai pašalinti skatinančiais agentais, resuspenduotos visiškai RPMI terpėje 10 6 ląstelių /ml, prieš bendro inkubacijos. AGS ląstelės buvo padengtas į 6-duobučių lėkštelėse prieš 24 valandas iki bendro auginimo, kaip 60 - 70%, susiliejantis AGS ląstelių 1 ml baigtas, F-12K vidutinio buvo inkubuojami 10 6 sukeltų ir nuplauti EBV LCL ląstelių 1 ml baigti RPMI. po 24 valandų, 2 ml serumo neturinčioje F-12K terpėje buvo įtraukta į kiekvieną šulinėlį sumažinti FBS koncentraciją iki 5%, kad būtų išvengta ląstelių sąžalynus. 3 dienų po to, kai bendro inkubacijos, EBV-LCL ląstelės buvo pašalintas nuo bendro kultūrų ir AGS ląstelės buvo kruopščiai nuplauti PBS bent 5 kartus pašalinti bet kurį iš donoro EBV-LCL ląstelių. tada užkrėstus AGS ląstelės buvo inkubuojami su šviežia "F-12K terpėje su 10% FBS ir 100 mikrogramų /ml higromicino B ir atrankos terpę buvo keičiami kas 2 iki 3 dienų iki infekuotų AGS ląstelių susidaro HYG B atrankos kolonijų su GFP išraiška (paprastai nuo 3 iki 4 savaičių po bendradarbiavimo auginimas). Tuomet atrankos kolonijos buvo sujungtos ir išbandyti EBNA1 saviraiškos ir EBV genomo kopijų skaičiaus prieš atsižvelgiant į eksperimentus. AGS-EBV ląstelės buvo prižiūrimi "F-12K terpėje su 10% FBS ir 100 mikrogramų /ml higromicino B.
plu-EBNA1 lentivirus ekspresijos vektorių, buvo apskaičiuota PGR amplifikacija EBNA1 su pradmenimis (GCGGGATCCTCTGACGAGGGGCCAGGTACAGGACCT ir ATCGTCGACTCACTCCTGCCCTTCCTCACCCTCATC) Įvedus 5" BamH I ir 3 "Sal Aš svetainė klonuotas rėmo plu-TCMV-ŽSC-pPURO. AGS arba MKN74 ląstelės buvo užsikrėtę lentivirus išreiškiant plu-EBNA1 ar plu valdymo vektorių, gaunamų šviežiai iš 293T ląstelių. Užkrėsti AGS arba MKN74 ląstelės tada buvo pasirinktas su 2,5 mikrogramai /ml puromicino nuo 10 iki 14 dienų. Pasirinktos ląstelės buvo sujungtos ir apdorojimo su arba be 5'-azacitidino 48 val tada, kurioms taikomas RT-PGR.
SiRNA prieš EBNA1 ir siRNA kontrolės (Kat. Nr D-001810-01-20) visi buvo įsigytas iš Dharmacon. siRNR nukreiptas prieš EBNA1 3'UTR srities susintetinti naudojant tikslinę seką CGGAGAUGACGGAGAUGAAUU. Transfekciją siRNA per du aukštus buvo atliktas naudojant Oligofectamine (Dharmacon), šių gamintojų specifikacijas.
Chromatino Imunoprecipitacijos (Chip) tyrimų nerodė
Chip tyrimai buvo atliekami taip, kaip aprašyta anksčiau [49]. Visi autoriai skaityti ir patvirtino galutinį rankraštį.

• Rimta ne kodavimo RNR išraiška aprašymą žmogaus skrandžio vėžio ir jos klinikinė significances
• Be Silico analizės Skrandžio vėžiu Serial analizė genų ekspresijos bibliotekų atskleidžia skirtingus profilius, susijusius su ethnicity