la liaison EBNA1 et la régulation épigénétique des gènes suppresseurs de tumeurs gastrokine dans des cellules de carcinome gastrique

la liaison EBNA1 et la régulation épigénétique des gènes suppresseurs de tumeurs gastrokine dans des cellules de carcinome gastrique
Résumé
fond
virus Epstein-Barr (EBV) infecte de manière latente ~ 10% des carcinomes gastriques (GC). Epstein-Barr antigène nucléaire 1 (EBNA1) est exprimée en GC associée à l'EBV, et peut se lier à l'ADN de l'hôte, où il peut influer sur la régulation des gènes cellulaires. Ici, nous montrons que EBNA1 se lie directement à l'ADN en amont des gènes suppresseurs de tumeur spécifique à GC divergeant transcrites gastrokine 1 (GKN1) et gastrokine 2 (GKN2).
Méthodes
Nous utilisons ChIP-Seq, ChIP-qPCR, et EMSA pour démontrer que EBNA1 se lie directement au locus promoteur GKN1 et GKN2. Nous générons AGS-EBV et des lignées de cellules AGS-EBNA1 pour étudier les effets de EBNA1 sur l'expression GKN1 et GKN2 ARNm avec ou sans 5 'azacytidine traitement. Résultats de
Nous montrons que les gènes de gastrokine sont transcriptionnellement réduits au silence par méthylation de l'ADN . Nous montrons également que l'infection latente à EBV et réduit encore GKN1 GKN2 l'expression dans des cellules de carcinome gastrique AGS et que l'épuisement des ARNsi EBNA1 pallie en partie cette répression. Conclusions de Toutefois, l'expression ectopique de EBNA1 légèrement augmenté les niveaux GKN1 et GKN2 basale ARNm, mais réduit leur capacité de réponse à l'agent de déméthylation.
Ces résultats démontrent que EBNA1 se lie au promoteur divergent des gènes GKN1 et GKN2 dans les cellules du GC, et suggèrent que EBNA1 contribue à la transcription complexe et la dérégulation épigénétique des gènes suppresseurs de tumeur GKN1 et GKN2 en EBV GC positive.
Mots-clés
carcinome EBV EBNA1 gastrique Gastrokine ChIP-Seq épigénétique Présentation
Epstein-Barr virus ( EBV) est un gammaherpesvirus humain trouvé dans un large éventail de lymphoïdes et des tumeurs malignes de cellules épithéliales, y compris le lymphome de Burkitt, la maladie de Hodgkin, le carcinome nasopharyngé (NPC) et post-transplantation syndrome lymphoprolifératif (revue dans [1, 2]). Plus récemment, l'EBV a été trouvé dans ~ 10% de tous les carcinomes gastriques (GC) cas dans le monde [3, 4]. Il a été démontré associée à l'EBV GC comme une excroissance monoclonale de cellules épithéliales gastriques infectées par l'EBV et est considéré comme un sous-type distinct de GC [5, 6]. Parce que l'incidence de la GC est proche de 900.000 personnes par an [7], GC associée à l'EBV peut être parmi les cancers les EBV associés les plus répandues.
Dans EBV cellules de carcinome gastrique positifs, EBV établit un type de variante I de latence, où EBV transcription est limitée au type canonique I gènes EBNA1, Ebers, famille BART ARN et miARN non codante, mais avec une certaine expression supplémentaire de LMP2A [6, 8-11]. Parmi ces gènes de latence EBNA1 est la seule protéine nucléaire virale qui est détectée par CG associée à l'EBV. EBNA1 est nécessaire pour la mise en place de l'infection latente épisomique et pour la survie à long terme des cellules infectées de façon latente [12-15]. EBNA1 est une protéine de liaison à l'ADN qui se lie aux deux sites virales et de l'hôte chromosomique. Les sites de liaison dans le génome viral ont été caractérisées par des fonctions essentielles dans la replication et le contrôle transcriptionnel d'expression des gènes viraux. Cependant, la fonction de EBNA1 séquence spécifique de liaison au chromosome hôte est moins bien compris. Bien que EBNA1 peut se lier à des régions promotrices de plusieurs gènes de l'hôte, on ne sait pas si ces gènes sont soumis à une réglementation EBNA1 [12, 16, 17]. La surexpression du domaine de liaison à l'ADN EBNA1, qui fonctionne comme un dominant négatif dans les cellules infectées par l'EBV, peuvent inhiber la viabilité cellulaire dans les cellules non infectées, ce qui suggère que EBNA1 se lie à et régule des gènes cellulaires importantes pour la survie de la cellule [18]. L'expression ectopique de EBNA1 a été montré pour effectuer l'expression de la cellule hôte de l'ARNm [19], mais on ne sait pas si ces effets sont directement ou indirectement liés à des sites de liaison de EBNA1 spécifiques dans le génome cellulaire.
Dans une étude précédente, nous avons utilisé méthodes ChIP-seq pour analyser les sites d'enrichissement du génome entier de EBNA1 dans les cellules de lymphome de Burkitt Raji infectés de manière latente et identifié de nombreux sites cellulaires liés par EBNA1 [17]. Parmi ces sites d'enrichissement cellulaire EBNA1, nous avons identifié un pic significatif de liaison EBNA1 situé à l'gastrokine 1 (GKN1) et gastrokine 2 (GKN2, aussi connu comme facteur trifolié interacting protein (TFIZ1)) gene cluster. GKN1 et GKN2 ont été identifiés en fonction de leur perte fréquente d'expression dans les cellules de carcinome épithéliales gastriques néoplasiques, par rapport à un tissu normal gastrique [20-22] (revue dans [23]). Plusieurs études récentes ont décrit antiproliferative et une activité anti-invasive pour GKN1 dans les cellules epitheliales gastriques, qui, en même temps que sa perte d'expression fréquente dans le cancer suggère qu'il fonctionne comme suppresseur de tumeur spécifique à l'épithélium gastrique [21, 24-28]. GKN1 peut inhiber la migration et l'invasion cellulaire dans la cicatrisation des plaies, et un essai transwell Matrigel, ainsi que des marqueurs de cellules alter associés à la transition épithéliale-mésenchymateuse [26]. gènes GKN1 et GKN2 sont situés à proximité et transcrites dans des directions opposées, ce qui suggère qu'ils partagent probablement un promoteur bi-directionnel, et sont sujets à coordonner la régulation par des facteurs réglementaires de transcription partagé (revue dans [23]). Dans ce
étude, nous avons démontré la liaison directe entre EBNA1 et GKN1-GKN2 loci et étudié GKN1 et GKN2 expression génique modulation par l'infection à EBV et de la protéine EBNA1. Nos résultats suggèrent que l'infection EBV peut en outre inhiber GKN1 et GKN2 expression, et que la perte de EBNA1 peut faciliter épigénétique de-répression de GKN2 transcription. Nous avons également observé des niveaux élevés de méthylation de l'ADN au niveau des régions de promoteur GKN1 et GKN2, et un rôle potentiel pour EBNA1 dans la déréglementation et de la répression épigénétique de ce locus suppresseur de tumeur.: Résultats
Identification d'un site de liaison à GKN1 EBNA1 haute d'occupation numéros locus -GKN2 par ChIP-Seq
données publiées antérieurement ChIP-Seq à partir de cellules Raji BL a révélé un nombre limité de sites de liaison de EBNA1 hautement enrichi sur la base des scores de pointe et lire [17]. Une inspection plus poussée a révélé un site de liaison de EBNA1 forte située en amont des sites de départ pour les gènes GKN1 et GKN2 transcrits de manière divergente (Figure 1A, la piste supérieure). Un pic de liaison EBNA1 similaire a été observée dans une expérience ChIP-Seq distincte réalisée dans la lignée cellulaire de carcinome EBV positif nasopharynx C666-1 (données complètes ChIP-seq à publier ailleurs), ce qui indique que cette liaison se produit dans les deux épithéliale, ainsi que lymphoïde les types de cellules (figure 1A, la piste inférieure). Le centre du pic a été localisé ~ 5 kb de GKN2 et ~ 15 kb à partir des sites de début de transcription GKN1. ChIP-PCR quantitative a été utilisée pour valider la liaison à la région promotrice-GKN1 GKN2 dans les deux Raji et les cellules C666-1 (figure 1B et C) EBNA1. qPCR a indiqué que EBNA1 lié au site GKN1-2 avec une efficacité similaire à un site EBNA1 liaison précédemment validé au niveau du promoteur PITPNB. qPCR a également indiqué que la liaison à GKN2 GKN1-EBNA1 était spécifique car il y avait de liaison, soit au locus du GAPDH cellulaire ou des régions de contrôle EBV OriLyt pas EBNA1 détectable, comme prévu (figure 1B et C). Le site de liaison de EBNA1 putative au locus GKN1-GKN2 a été identifié par l'alignement sur un site de liaison de consensus au sein de la famille EBV de répétitions (FR) région, et cette séquence a ensuite été testé pour la liaison directe à EBNA1 par EMSA (figure 1D). EBNA1 protéine recombinante purifiée a été testée DBD pour la liaison à des sondes contenant le site GKN1-GKN2 (GKN1 /2), FR, ou une séquence témoin négatif dépourvu d'un site de liaison consensus EBNA1. Nous avons constaté que EBNA1 liée DBD efficacement au site GKN1-GKN2, ainsi que le FR consensus, mais ne se lie pas à la séquence de contrôle. Ces résultats suggèrent que EBNA1 interagit avec GKN1-GKN2 région promotrice par directe liaison à l'ADN avec le EBNA1 DBD. La figure 1 EBNA1 se fixe au niveau du locus du promoteur et GKN1 GKN2. (A) Le navigateur de génome UCSC a été utilisé pour cartographier pic de liaison EBNA1 générée à partir Raji et C666-1 ChIP-seq au locus du gène et GKN1 GKN2. RefSeq annotée transcriptions sont indiquées en dessous du pic de ChIP-Seq. (BC) de validation en temps réel-PCR des données ChIP-seq pour le site de liaison de EBNA1 à la région du promoteur GKN1 /2 partagé: EBNA1 (barres rouges) ou de contrôle IgG (barres bleues) ont été analysés par ChIP dans Raji (B) ou C666-1 cellules (C) pour l'ADN de liaison au /2 sites GKN1, promoteur PITPNB, GAPDH ou EBV Ori-Lyt. analyse (D) EMSA de 32P sondes marquées contenant de contrôle, GKN1 2 /site, ou EBV FR. Faire varier la quantité de protéines EBNA1 DBD a été utilisé dans la réaction (0, 100, 300, 900 ng) de liaison. Arrowheads représentent complexes liés spécifiques EBNA1 ou sonde libre comme indiqué. La séquence de la sonde de GKN1 /2 place et FR est indiquée avec la séquence homolog (lettres rouges) entre GKN1 /2 et FR. La séquence contrôle négatif (Ctrl) est également indiqué. Les barres d'erreur indiquent l'écart type de la moyenne (SDM) pour n = 3.
GKN1 et GKN2 ARNm sont fortement exprimés dans les tissus de l'estomac primaire
Nous avons ensuite mesuré les niveaux GKN1 ou GKN2 ARNm dans différentes cellules de carcinome gastrique lignes et dans le primaire le tissu gastrique normale par qRT-PCR (figure 2). Nous avons constaté que GKN1 et GKN2 sont exprimés à des niveaux beaucoup plus élevés (~ 3 x 10 4 fois) dans les tissus de l'estomac primaire que dans l'une des lignées cellulaires testées (figure 2A). Bien que les niveaux beaucoup plus faibles que les tissus de l'estomac primaire, GKN1 et GKN2 ont tous deux été exprimés à des niveaux mesurables dans des lignées cellulaires de carcinome gastrique AGS, avec GKN2 exprimé à des niveaux plus élevés que toutes les autres lignées cellulaires de GC, ou des cellules B positives EBV ou des lignées cellulaires NPC ( La figure 2B). Très faibles niveaux de GKN1 ou GKN2 n'a pu être détectée dans le tissu épithélial primaire par voie orale, ce qui indique en outre que ces gènes sont spécifiques pour un tissu gastrique primaire. Figure 2 GKN1 et GKN2 ARNm sont fortement exprimés dans les tissus de l'estomac primaire. La RT-PCR a été réalisée pour analyser le niveau d'ARNm de GKN1 (barres bleues) ou GKN2 (barres rouges) dans des lignées cellulaires différentes, y compris GC dérivé GTL, MKN28, MKN74, SNU638, AGS, BL-dérivé Raji, VEB immortalisée LCL EBV ligne NPC positif C666-1, ou de la bouche primaire des cellules épithéliales comparant avec (A) ou sans (B) des tissus de l'estomac primaire. Les barres d'erreur indiquent l'écart type de la moyenne (SDM) pour n = 3.
EBV réduit la latence expression GKN1 et GKN2 ARNm dans des lignées cellulaires de GC
Pour tester l'effet de l'infection latente EBV sur GKN1 et GKN2 expression, nous avons généré une lignée de cellules AGS contenant EBV B95.8 bacmide. La lignée de cellules AGS a été sélectionnée pour la résistance à l'hygromycine et la positivité de GFP pour s'assurer qu'elle contenait des composants bacmide. Pour caractériser la lignée de cellules AGS EBV, nous avons analysé le premier motif d'expression du gène de l'EBV (figure 3). Nous avons trouvé que les cellules AGS-EBV ont exprimé des niveaux d'ARNm détectable de EBNA1, BARF0 et LMP2A, mais pas LMP1 EBNA2 ou EBNA3C (figure 3). Bien que EBV B95.8 bacmide n'a pas le BART miARN, ces résultats sont cohérents avec les cellules AGS-EBV adoptant un type de variante I latence de programme d'expression génique avec une certaine expression de LMP2A, similaire à celle observée dans le tissu EBV positif gastrique de tumeur de carcinome [8, 10 ]. Pour caractériser davantage les cellules AGS EBV, nous avons analysé l'expression des protéines EBNA1 par Western Blot (figure 4A) et du nombre de copies d'ADN d'EBV par qPCR (figure 4B). EBNA1 a été détecté comme une seule espèce de faible abondance à la masse moléculaire attendue (figure 4A). nombre de copies de EBV a été mesurée par comparaison de l'ADN d'EBV ori-Lyt à la GAPDH cellulaire (figure 4B). Nous avons constaté que l'AGS-VEB contenait environ 50% de moins de copies du génome viral positif par rapport à LCLs VEB. Pour déterminer si EBNA1 a conservé son activité de liaison ADN dans AGS-EBV, nous avons effectué des essais ChIP classiques (Figure 4C). Nous avons constaté que EBNA1 liée à l'ADN VEB symétrie dyadique (DS), ainsi que le site de liaison GKN1-GKN2 dans les cellules AGS VEB. Nous avons ensuite demandé si les niveaux GKN1 ou GKN2 ARNm ont été affectés par une infection latente EBV dans les cellules AGS en comparant les niveaux d'expression RT-qPCR dans AGS par rapport aux cellules AGS-EBV (Figure 4D). Nous avons constaté que GKN1 et GKN2 ont été réprimées ~ 3-8 fois dans AGS-EBV par rapport aux cellules AGS, ce qui suggère que l'EBV latence favorise ou stabilise la répression de la transcription de GKN1 et GKN2. Figure 3: Caractérisation de l'expression des gènes d'EBV dans des lignées cellulaires AGS-VEB. AGS, AGS-EBV positive et EBV-LCLs ont été analysés pour l'expression de l'ARNm par qRT-PCR avec des amorces pour EBNA1, BARF0, LMP2A, LMP1, EBNA2 ou EBNA3C, comme indiqué. Les barres d'erreur indiquent l'écart type de la moyenne (SDM) pour n = 3.
Figure 4 infection à EBV des cellules AGS supprime GKN1 et GKN2 transcription. (A) Analyse par transfert Western de l'expression de la protéine EBNA1 dans les cellules AGS VEB par rapport aux cellules AGS EBV-négatifs a été réalisée en utilisant un anticorps pour EBNA1 (en haut) ou actine (en bas). numéro (B) de la copie d'ADN a été analysée par PCR en temps réel de l'EBV ori-Lyt ADN par rapport au niveau de la GAPDH cellulaire dans AGS, AGS EBV et des cellules EBV-LCL. (C) ChIP et analyse en temps réel PCR de EBNA1 (barres rouges) ou de contrôle IgG (barres bleues) pour la liaison d'ADN sur les sites de EBV, y compris DS et Ori-Lyt, ou de sites cellulaires, y compris GKN1 /2 et GAPDH dans AGS-EBV cellules. (D) RT-PCR a été réalisée pour analyser le niveau d'ARNm de GKN1 ou GKN2 AGS (barres bleues) ou des cellules AGS-VEB (barres rouges). ** Indique p < .005. Les barres d'erreur indiquent l'écart type de la moyenne (SDM) pour n = 3.
EBV augmente méthylation de l'ADN répression dépendante de GKN1 et GKN2 ARNm dans des lignées cellulaires de GC
GKN1 et GKN2 peuvent être soumis à la répression épigénétique dans GC et de tissus des lignées cellulaires de culture. Pour explorer cette possibilité, nous avons testé si le traitement avec de l'ADN déméthylation agent de 5 'azacytidine (Aza) ou un agent désacétylation (NaB) combiné avec l'ester de phorbol (TPA) activerait GKN1 ou GKN2 dans les cellules AGS (Figure 5A). Nous avons constaté que le traitement Aza a conduit à une augmentation de ~ 10 fois dans GKN2 et ~ 4 augmentation de pli dans GKN1 transcription dans les cellules traitées AGS. En revanche, le traitement NaB /TPA produit seulement ~ 2 fois l'activation de la transcription. Ces résultats suggèrent que les deux GKN1 et GKN1 sont sous la répression épigénétique active par méthylation de l'ADN. Pour tester si EBV avait un effet sur l'activation induite par Aza de GKN1 ou GKN2, nous avons comparé les effets du traitement sur Aza AGS par rapport aux cellules AGS-EBV par qRT-PCR (figure 5B). Nous avons constaté que GKN1 et GKN2 ont été activés par un traitement efficace dans les cellules AGS Aza, mais dans une moindre mesure, dans AGS VEB. Dans ces expériences, l'activation induite par Aza de GKN2 a été complètement éliminé, tandis que l'activation de GKN1 n'a été que partiellement atténué. Aza-traitement a également conduit à l'augmentation d'un facteur 8,4 ~ dans les niveaux d'ARNm EBNA1, ce qui suggère que le traitement aza stimule l'expression du gène VEB lytique dans des lignées cellulaires AGS-VEB. Ces résultats suggèrent que les produits du gène VEB empêchent GKN2 et, dans une moindre mesure, l'activation du GKN1 après le traitement Aza. Figure 5 EBV renforce la répression des GKN1 et GKN2 expression des gènes par méthylation de l'ADN. (A) Les cellules AGS ont été traitées avec 10 uM Aza ou 1 mM de NaB et 20 ng /ml de TPA pendant 48 heures et analysés par RT-PCR pour GKN1 ou le niveau d'expression de GKN2, par rapport à l'AGS non traitées. (B) cellules AGS ou des cellules AGS-EBV ont été traitées ou non traitées avec 10 uM Aza pendant 48 heures, puis analysés pour les niveaux d'ARNm de EBNA1 GKN1, GKN2 ARNm, ou. (C) MeDIP analyse de l'AGS ou des cellules AGS EBV traitées ou non traitées avec 10 uM Aza pendant 48 heures à différentes régions d'ADN de GKN1 et GKN2 locus. (D) MeDIP dosage des AGS ou des cellules AGS-EBV traitées ou non traitées avec 10 uM Aza pendant 48 heures au niveau des régions cellulaires pour alpha-globine-2, GAPDH, CDC7, FOXP2, HDAC3 ou MAP3KIP2. (E) Genome position des amorces utilisées pour GKN1-GKN2 ChIP et MeDIP essais. * Indique p < .05, ** Indique p < .005. Les barres d'erreur indiqué sdm pour n = 3.
Pour mieux comprendre le mécanisme de GKN1 et GKN2 répression épigénétique, nous avons examiné les niveaux de méthylation d'ADN à l'aide de méthyle anticorps dirigé ADN immunoprécipitation (MeDIP) dosage spécifique de la cytosine. Nous avons mesuré l'enrichissement de l'ADN méthylé de la région de contrôle GKN1-GKN2 dans les cellules AGS et AGS EBV avec ou sans traitement Aza (figure 5C). Nous avons observé un enrichissement relatif de CpG méthylé dans une région située entre le site de liaison EBNA1 et GKN2 site d'initiation de la transcription (GKN2_A). traitement Aza a conduit à une diminution du signal MeDIP dans la plupart des régions où un signal a été détecté, ce qui suggère que le traitement Aza a conduit à une réduction générale de la méthylation de l'ADN. une perte similaire de méthylation CpG a été observée au niveau du gène alpha-globine (qui ne se lie pas EBNA1), et plusieurs sites de liaison EBNA1, y compris HDAC3 et MAP3K7IP (figure 5D). Nous avons également constaté que les signaux MeDIP étaient généralement plus élevés dans les EBV-AGS que dans les cellules AGS, ce qui suggère que l'infection latente EBV peut favoriser ou stabiliser méthylation de l'ADN dans le génome hôte.
EBNA1 déplétion active l'expression GNK1 et GKN2 ARNm dans les cellules épithéliales positives EBV
pour déterminer si EBNA1 a contribué à la répression de la transcription de GKN1 et GKN2, nous avons d'abord tenté d'épuiser EBNA1 dans les cellules AGS-EBV utilisant siRNA (Figure 6). Nous avons généré un siRNA ciblant l'extrémité 3 'non codante UTR de l'ARNm EBNA1, qui a partiellement appauvrie protéine EBNA1 dans les cellules AGS-EBV (figure 6B). Déplétion de EBNA1 a entraîné une activation de pliage GKN2 ~ 5, avec peu d'activation détectable GKN1 (figure 6A). Ces résultats suggèrent que EBNA1 peut fonctionner comme un répresseur transcriptionnel de GKN2 dans les cellules AGS-EBV. Figure 6 siRNA épuisement des EBNA1 provoque de-répression de l'GKN1 et GKN2 dans les cellules AGS-EBV. siEBNA1 siCtrl ou transfecté les cellules AGS-EBV ont été analysés par RT-PCR pour l'ARNm GKN2 GKN1 ou niveau par rapport à la GAPDH cellulaire (A). Les cellules ont été récoltées 72 heures après la transfection avec le siRNA. blot montrant Western EBNA1 (panneau supérieur) et le contrôle de chargement actine (panneau inférieur) dans les cellules AGS-EBV (B). Les barres d'erreur indiquent l'écart type de la moyenne (SDM) pour n = 3.
EBNA1 inhibe GKN1 et GKN2 transcription après déméthylation de l'ADN
Pour explorer davantage la contribution de EBNA1 à la régulation de la transcription GKN1 et GKN2, nous avons testé l'effet de l'expression ectopique de EBNA1 seul sur les niveaux Aza-induits de GKN1 ou GKN2 transcription dans les cellules du GC. les cellules AGS ont été transduites avec un lentivirus exprimant EBNA1. Stable AGS-EBNA1 (PLU-EBNA1) ou d'un vecteur de commande AGS- (PLU-Vec) lignées cellulaires ont été sélectionnés et analysés pour déterminer les niveaux GKN1 et GKN2 ARNm. Nous avons constaté que les cellules AGS-EBNA1 avaient une ~ 2-3 fois le niveau basal plus élevé de GKN1 et GKN2 ARNm par rapport aux cellules parentales AGS (Figure 7A). Cependant les taux d'ARNm, Aza-induits de GKN1 et GKN2 ont été atténués chez AGS-EBNA1 par rapport aux cellules AGS (figure 7b). traitement Aza a également conduit à une forte augmentation des niveaux d'ARNm EBNA1 (Figure 7C). Pour déterminer si les effets de EBNA1 sur GKN1 et GKN2 étaient spécifiques aux cellules AGS, nous transduites une autre lignée cellulaire négative de GC EBV MKN74 avec lentivirus EBNA1 (Figure 7D-F). Semblables aux cellules AGS, nous avons constaté que EBNA1 a augmenté les taux basaux de GKN1 et GKN2, mais a inhibé la capacité à induire Aza davantage les niveaux d'ARNm GKN1 et GKN2 (figure 7D et E). Nous avons confirmé que Aza-traitement a été efficace en mesurant les niveaux d'ARNm de EBNA1, qui ont augmenté ~ 7 fois (Figure 7F). Ces résultats suggèrent que l'expression ectopique de EBNA1 peut augmenter de base, mais inhiber les niveaux Aza-induits de GKN1 et GKN2 transcription dans des lignées cellulaires de GC EBV-négatif. Figure 7 EBNA1 inhibe GKN1 et GKN2 transcription après déméthylation de l'ADN dans les cellules du GC. (A) les cellules AGS ont été transduites avec PLu-Vector (Vec) ou PLU-EBNA1 et non traitée (Untr) ou traitées avec 10 uM 5'-azacytidine (Aza) pendant 48 heures. GKN1 et GKN2 ARNm ont été quantifiées par qRT-PCR par rapport à GAPDH. (B) Plier l'induction de GKN1 et GKN2 ARNm par Aza ont été quantifiés à partir du panneau A. (C) qRT-PCR analyse des niveaux EBNA1 ARNm dans les cellules AGS. (D) Identique à A, excepté l'utilisation MKN74 plutôt que les cellules AGS. (E) Plier l'induction de GKN1 et GKN2 ARNm quantifiées à partir du panneau d'analyse D. (F) qRT-PCR des niveaux EBNA1 ARNm dans les cellules MKN74. * Indique p < .05, ** Indique p < .005. Les barres d'erreur indiqué sdm pour n = 3.
Discussion
Dans cette étude, nous avons identifié un site de liaison à occupation EBNA1 dans la région 5 'de contrôle du promoteur des gènes GKN1 et GKN2 transcrits de manière divergente. des sites de liaison d'EBNA1 ont été observées dans les deux ensembles de données de copeau Seq indépendantes à partir de cellules lymphoïdes BL positifs et EBV EBV Raji positif des cellules de carcinome du nasopharynx epitheliales C666-1 (figure 1A). Nous avons confirmé ces sites de liaison par des moyens classiques ChIP-PCR quantitative dans les deux lignées cellulaires (figure 1B et C). EBNA1 a été également montré pour se lier directement à ces sites par EMSA avec EBNA1 protéine recombinante purifiée DBD (figure 1D). Nous montrons que les niveaux GKN1 et GKN2 ARNm sont fortement réprimées dans la plupart des lignées cellulaires par rapport au tissu gastrique primaire (Figure 2). Pour étudier le rôle potentiel de l'EBV et EBNA1 dans le contrôle transcriptionnel de GKN1 et GKN2, nous avons généré une ligne AGS positive EBV gastrique de cellules de carcinome. Nous montrons que l'EBV adopte un type de la variante I latence de motif dans les cellules AGS (figure 3), et que EBNA1 peut se lier à la région promotrice GKN1 /de GKN2 dans le chromosome cellulaire (figure 4C). Nous avons également constaté que GKN1 et GKN2 ARNm ont encore été supprimés dans EBV cellules AGS positives par rapport au témoin EBV cellules AGS négatives (Figure 4D). Nous avons ensuite montré que Aza-traitement a conduit à l'augmentation de l'expression de GKN1 et GKN2 (figure 5A), et que l'EBV infection latente inhibe l'activation Aza de GKN2 (figure 5B). Nous avons constaté que l'épuisement des ARNsi EBNA1 dans les cellules AGS positives EBV conduit à l'activation de la transcription d'GKN2 (figure 6). Nous montrons également que EBNA1 expression ectopique augmente modérément basale, mais inhibe les niveaux Aza-induits de GKN1 et GKN2 transcription (figure 7). Pris ensemble, ces résultats indiquent que EBNA1 se lie à la région de contrôle du promoteur GKN1-GKN2 dans plusieurs types de cellules, et soulèvent la possibilité que EBNA1 contribue à la répression de la transcription et épigénétique des gènes suppresseurs de tumeurs GKN1 et GKN2 dans VEB GC positif.
une infection latente par EBV est connu pour augmenter le phénotype tumorigène des cellules de carcinome gastrique [29-31]. GKN1 et GKN2 sont rapportés à fonctionner comme des inhibiteurs de croissance cellulaire et les suppresseurs de tumeurs chez GC [20, 21, 23, 25-27]. Nos données d'expression d'ARNm montrant l'expression de l'ARNm de haut niveau uniquement dans le tissu gastrique normale primaire sont compatibles avec un rôle et GKN1 GKN2 comme un suppresseur de tumeur. Cependant, nous avons été incapables de montrer que la surexpression de l'un ou les deux GKN1 ou GKN2 dans AGS ou AGS-EBV provoque un arrêt du cycle cellulaire ou de réduire la viabilité (données non présentées). Ceci suggère que la fonction et GKN1 GKN2 aux premiers stades de l'évolution des cellules tumorales ou dans des micro-environnements tumorales plus complexes. Nous spéculer que EBNA1 peut avoir un effet plus prononcé sur GKN1 et GKN2 expression dans des situations où EBV peut infecter les cellules gastriques primaires où l'expression basale de GKN1 et GKN2 sont élevés et importants pour la suppression tumorale.
Études publiées antérieures ont montré que GKN1 et GKN2 transcription est soumise à une suppression épigénétique par méthylation de l'ADN dans toutes les formes de GC [21]. Nos études sont en accord avec le rôle de méthylation de l'ADN dans la suppression épigénétique de GKN1 et GKN2 dans les cellules AGS. Le traitement par Aza a donné lieu à l'augmentation d'un facteur 4 à 10 de l'expression et GKN1 GKN2 ARNm (figure 5A) et MeDIP a révélé un enrichissement de l'ADN méthylé au niveau des régions de promoteur (figure 5C). cellules AGS-EBV ont fait apparaître une augmentation de la méthylation de l'ADN sur plusieurs sites cellulaires, y compris les régions entourant le sites de la région du promoteur de GKN1 (Figure 5C) de liaison EBNA1 et les HDAC3 et MAP3K7IP2 gènes (Figure 5D). Cependant, la présence d'EBNA1 dans les cellules AGS-EBV n'a pas empêché aza-déméthylation induit sur ces sites. Ceci suggère que EBNA1 peut réprimer la transcription de certains promoteurs, comme GKN2, par l'intermédiaire d'un mécanisme distinct de méthylation de l'ADN. Cependant, l'expression ectopique d'EBNA1 seul produit un phénotype plus compliqué, ce qui provoque une légère augmentation de l'expression de base, mais en limitant les effets de déméthylation aza-induite (figure 7). Cela peut suggérer que cette EBNA1 peut fonctionner différemment quand il est exprimé de manière ectopique, que lorsqu'elle est exprimée dans le contexte du génome viral. Néanmoins, nos résultats suggèrent que EBNA1 perturbe la régulation de la transcription normale des gènes GKN1 et GKN2.
La fonction précise de EBNA1 dans la régulation de la transcription reste incertaine. EBNA1 a été impliquée dans l'activation de la transcription et de la répression des deux gènes viraux et cellulaires [32, 33]. EBNA1 peut réprimer sa propre expression de l'ARNm de l'EBV dans Qp latence de type III, où la répression a été liée à une interférence stérique avec de l'ARN polymérase II se liant au site d'initiation de transcription [34]. D'autre part, EBNA1 peut activer Cp et LMP1 promoteurs en latence de type III où il peut fonctionner comme un facteur d'activateur-like [35-37]. EBNA1 a été impliquée dans l'activation de la transcription de certains gènes cellulaires, y compris le gène impliqué dans Nox2 réactif formation d'espèces d'oxygène [19]. EBNA1 peut également affecter la transcription de la cellule hôte par un remodelage global du chromosome de l'hôte [38]. Ainsi, EBNA1 peut modifier la transcription cellulaire par des mécanismes directs et indirects multiples.
Modifications épigénétiques sont connus pour jouer un rôle important dans l'estomac cancer associée à l'EBV [39]. Fait intéressant, les cellules AGS transportant génomes EBV Bacmid avaient des niveaux plus élevés de l'ADN méthylé dans de nombreux sites testés (Figure 5D). Ceci est cohérent avec le rôle proposé VEB dans la méthylation des gènes suppresseurs de tumeur de l'hôte [40]. Ceci est également cohérent avec les résultats que l'EBV GC positif a élevées méthylation de l'ADN au niveau des régions promotrices de plusieurs suppresseurs clés GC tumorales, y compris les gènes gastrokine [39, 41-45]. Bien que EBNA1 lié à proximité des régions d'ADN méthylé du GKN2, nous avons été incapables de montrer que EBNA1 modulant méthylation de l'ADN sur les sites GKN1 et GKN2 (données non présentées). Cependant, il est possible que EBNA1 en association avec un autre facteur encodée ou induite virale peut stabiliser GKN1 et la répression transcriptionnelle GKN2 par un mécanisme dépendant de la chromatine et qui renforce la structure méthylation de l'ADN. Il est également possible que EBNA1 peut réguler GNK2 GKN1 ou seulement dans microenvironnements de tissu ou d'une tumeur qui ne sont pas facilement récapitulées dans la culture cellulaire. Alors que la fonction de liaison pour héberger des sites chromosomiques des cellules EBNA1 reste un domaine important de l'enquête, les modèles d'infection plus sophistiqués peuvent être nécessaires pour élucider son rôle potentiel dans la modification de l'expression des gènes de la cellule hôte et la carcinogenèse.
Méthodes
cellules, plasmides, et l'infection lentivirus
lymphome des cellules Raji de Burkitt, les cellules C666-1 de carcinome nasopharyngé positif EBV EBV-positifs, et des lignées cellulaires de carcinome gastrique (un don du Dr Antonia R. Sepulveda, Université de Columbia), y compris GTL, MKN28, MKN74, SNU638 ont été maintenues dans du RPMI contenant 10% de FBS et additionné d'antibiotiques (pénicilline et streptomycine). cellules de carcinome gastrique AGS (ATCC N ° CRL-1739) ont été maintenues dans F-12K contenant 10% de FBS. les cellules épithéliales de la bouche primaire ont été fournies par le Dr Manjunatha Benakanakere, Université de Pennsylvanie et cultivées dans un milieu kératinocytes-SFM. LCL EBV a été établi par la primo-infection de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) avec des virions EBV BAC générées à partir de cellules stimulées par l'EBV 293 [46, 47]. LCL EBV contient un hygromycine B EBV résistant bacmide ont été maintenues dans du RPMI contenant 10% de FBS, à l'hygromycine B (100 ug /ml), de Glutamax (Invitrogen) et des antibiotiques. les cellules AGS-EBV ont été générées à partir de cellules AGS de co-cultivées avec des LCL EBV en adaptant un procédé de co-culture décrite AGS infection des cellules précédemment publiées avec rEBV à travers la cellule à cellule contact [48] avec certaines modifications. En bref, LCL EBV a été induite par 20 ng /ml de 12-O
-tetradecanoylphorbol-13-acétate (TPA) et le butyrate de sodium 1 mM (NAE) 24 heures avant la co-culture. Les cellules EBV-LCL induites ont été lavées avec du PBS deux fois pour éliminer complètement les agents d'induction, remises en suspension avec du milieu RPMI complet à 10 6 cellules /ml avant la co-incubation. les cellules AGS ont été étalées dans 6 puits Plaques 24 heures avant la co-culture, puis 60 - 70% de cellules AGS confluentes dans 1 ml milieu complet F-12K ont été incubés avec 10 6 cellules EBV-LCL induites et lavées dans 1 ml RPMI complet. 24 heures plus tard, 2 ml de milieu sans sérum F-12K a été ajouté à chaque puits pour réduire la concentration de FBS à 5% pour éviter la prolifération cellulaire. 3 jours après co-incubation, les cellules EBV-LCL ont été retirés des co-cultures et les cellules AGS ont été soigneusement lavées avec du PBS au moins 5 fois pour éliminer tout donneur de cellules EBV-LCL. Les cellules AGS infectées ont été ensuite mises en incubation avec du milieu frais F-12K avec 10% de SVF et 100 ug /ml d'hygromycine B et le milieu de sélection a été changé tous les 2 à 3 jours jusqu'à ce que les cellules AGS infectées forment des colonies de sélection Hyg B avec une expression de GFP (habituellement 3 à 4 semaines après la co-culture). Les colonies de sélection ont ensuite été rassemblées et testées pour l'expression EBNA1 et du génome de l'EBV nombre de copies avant l'objet d'expériences. les cellules AGS-EBV ont été maintenues dans du milieu F-12K avec 10% de SVF et 100 ug /ml d'hygromycine B.
vecteur d'expression EBNA1-Plu lentivirus a été construit par amplification par PCR avec des amorces EBNA1 (et de GCGGGATCCTCTGACGAGGGGCCAGGTACAGGACCT ATCGTCGACTCACTCCTGCCCTTCCTCACCCTCATC) l'introduction d'une extrémité 5 ' BamH I et site 3 'Sal I cloné dans le cadre de PLu-CTVM-SFMC-pPURO. les cellules AGS ou MKN74 ont été infectées par le lentivirus exprimant PLu-EBNA1 ou vecteur de commande généré PLu fraîchement à partir de cellules 293T. AGS infectées ou des cellules MKN74 ont ensuite été sélectionnés avec 2,5 pg /ml de puromycine pendant 10 à 14 jours. Les cellules sélectionnées ont été rassemblées et traitées avec ou sans 5'-azacytidine pendant 48 heures puis soumis à une RT-PCR.
ARNsi contre EBNA1 et le contrôle de l'ARNsi (Cat. N ° D-001810-01-20) ont tous été achetés auprès Dharmacon. siRNA dirigé contre la 3'UTR EBNA1 ont été synthétisés en utilisant la séquence cible CGGAGAUGACGGAGAUGAAUU. La transfection des duplex de cARNi a été réalisée à l'aide d'oligofectamine (Dharmacon), en suivant les spécifications du fabricant. Le plus Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) Essais
essais ChIP ont été effectuées comme décrit précédemment [49]. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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