EBNA1 sitova ja epigeneettiset sääntelyn gastrokine tuumorisuppressorigeeneille mahalaukun karsinooma cells

EBNA1 sitova ja epigeneettiset sääntelyn gastrokine tuumorisuppressorigeeneille in mahakarsinoo- soluissa
tiivistelmä
tausta
Epstein-Barrin virus (EBV) piilevänä tarttuu ~ 10 % of mahakarsinoomat (GC). Epstein-Barr tuma-antigeeni 1 (EBNA1) ilmaistaan ​​EBV-GC, ja voi sitoutua isännän DNA, jossa se voi vaikuttaa solun geenisäätelyn. Tässä osoitamme, että EBNA1 sitoutuu suoraan DNA ylävirtaan divergentisti puhtaaksi GC-erityisiä tuumorisuppressorigeeneille gastrokine 1 (GKN1) ja gastrokine 2 (GKN2). Tool Menetelmät
Käytämme chip Seq, siru-qPCR, ja EMSA osoittaa, että EBNA1 sitoutuu suoraan GKN1 ja GKN2 promoottori lokuksessa. Tuotamme AGS-EBV, ja AGS-EBNA1 solulinjojen tutkia vaikutuksia EBNA1 on GKN1 ja GKN2 mRNA: n ilmentymisen kanssa tai ilman 5 'atsasytidiini hoitoon.
Tulokset
Osoitamme, että gastrokine geenit transkriptionaalisesti vaiennetaan DNA: n metylaatio . Samalla osoitetaan, että piilevä EBV-infektio vähentää edelleen GKN1 ja GKN2 ilmaisun AGS mahasyöpä soluja, ja että siRNA ehtyminen EBNA1 osittain lievittää tätä tukahduttamisen. Kuitenkin ektooppinen ilmentyminen EBNA1 hieman lisääntynyt GKN1 ja GKN2 pohjapinta mRNA-tasoja, mutta vähensivät vastata demetyloivan agentti.
Johtopäätökset
Nämä havainnot osoittavat, että EBNA1 sitoutuu toisistaan ​​poikkeavia promoottori GKN1 ja GKN2 geenien GC soluissa, ja viittaavat siihen, että EBNA1 edistää monimutkaisten transkription ja epigeneettiset sääntelyn purkamista GKN1 ja GKN2 tuumorisuppressorigeeneille EBV positiivinen GC.
avainsanat
EBV EBNA1 mahakarsinoo- Gastrokine chip Seq epigeneettiset Johdanto
Epstein-Barrin virus ( EBV) on ihmisen gammaherpesvirus löytyy monenlaisia ​​imukudoksen ja epiteelisolujen maligniteetteja, mukaan lukien Burkittin lymfooma, Hodgkinin tauti, nenänielun karsinooma (NPC) ja elinsiirron jälkeinen lymfoproliferatiivinen tauti (katsaus [1, 2]). Viime aikoina, EBV on löydetty noin 10% kaikista mahakarsinooman (GC) tapauksessa maailmanlaajuisesti [3, 4]. EBV-GC: n on osoitettu olevan monoklonaalinen outgrowth EBV-tartunnan mahalaukun epiteelisolujen ja pidetään erillinen alatyypin GC [5, 6]. Koska esiintyvyys GC on lähes 900.000 ihmistä vuodessa [7], EBV-GC voi olla eräs kaikkein tärkeimmistä EBV: hen liittyvien syöpien.
EBV positiivinen mahasyöpä soluja, EBV perustetaan variantti tyypin I latenssi, jossa EBV transkriptio rajoittuu kanoninen tyypin I geenit EBNA1, Ebers, Bart perhe ei-koodaavat RNA ja miRNA, mutta joitakin muita ilmentymistä LMP2A [6, 8-11]. Näistä latenssi geenit, EBNA1 on ainoa viruksen ydin- proteiini, joka havaitaan EBV-GC. EBNA1 tarvitaan perustamiseen piilevä episomaalisen infektio ja pitkällä aikavälillä säilyttämään piilevänä tartunnan saaneiden solujen [12-15]. EBNA1 on DNA: ta sitova proteiini, joka sitoutuu sekä viruksen ja isännän kromosomi sivustoja. Sitoutumiskohdat virusgenomissa on tunnettu välttämättömiin toimintoihin replikaatiota ja transkriptiota ohjaa viruksen geenin ilmentymisen. Kuitenkin toiminta EBNA1-sekvenssin-spesifistä sitoutumista isännän kromosomiin on ymmärretä hyvin. Vaikka EBNA1 voi sitoutua promoottorialueissa useiden isäntägeenejä, jää epäselväksi, onko nämä geenit voivat EBNA1 asetuksen [12, 16, 17]. Yliekspressio EBNA1 DNA: ta sitovan domeenin, joka toimii dominantti negatiivinen EBV-infektoituneissa soluissa, voi estää solujen elinkelpoisuutta infektoitumattomiin soluihin, mikä viittaa siihen, että EBNA1 sitoutuu ja säätelee solujen geenien tärkeä solujen eloonjäämistä [18]. Ektooppinen ilmentyminen EBNA1 on osoitettu aikaan isäntäsolun mRNA: n ilmentymisen [19], mutta se ei ole selvää, ovatko nämä vaikutukset suoria tai välillisesti liittyviä erityisiä EBNA1 sitoutumiskohdat solun genomiin.
Aikaisemmassa tutkimuksessa käytimme ChIP-seq menetelmiä analysoida genominlaajuisten rikastaminen sivustoja EBNA1 vuonna piilevänä tartunnan Raji Burkittin lymfooma solujen ja tunnistettu lukuisia solujen sivustoja sitovat EBNA1 [17]. Joukossa EBNA1 solujen rikastumista sivustoja tunnistettu merkittävä EBNA1 sitova huippu sijaitsee gastrokine 1 (GKN1) ja gastrokine 2 (GKN2, joka tunnetaan myös apilatekijän vuorovaikutuksessa proteiinin (TFIZ1)) geeniklusterista. GKN1 ja GKN2 on tunnistettu perustuen niiden usein menetys ilmaisun neoplastisten mahasyöpä epiteelisolujen, verrattuna normaaliin mahalaukun kudokseen [20-22] (katsaus [23]). Useat viimeaikaiset tutkimukset ovat kuvanneet antiproliferatiivisia ja anti-invasiivisen toiminnan GKN1 mahalaukun epiteelisolujen, joka yhdessä sen usein ilmaisua menetys syöpä, viittaa se toimii tuumorisuppressoriproteiinia ominaisia ​​mahalaukun epiteelin [21, 24-28]. GKN1 voi estää solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen haavan paranemista, siirtokuoppaan ja Matrigel määritys sekä alter solumarkkerien liittyvä epiteelin-mesenkymaalitransitioon [26]. GKN1 ja GKN2 geenit sijaitsevat lähellä toisiaan ja transkriptoidaan vastakkaisiin suuntiin, mikä viittaa siihen, että ne todennäköisesti jakavat kaksisuuntainen promoottori, ja ne saattavat koordinoida sääntelyn yhteiset transkription sääntelyn tekijöitä (tarkistetaan [23]).
Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet suoran sitoutumisen välillä EBNA1 ja GKN1-GKN2 loci ja tutkitaan GKN1 ja GKN2 geeniekspression modulaatiota EBV-infektio ja EBNA1 proteiinia. Tulosten perusteella näyttää, että EBV-infektio voi edelleen estää GKN1 ja GKN2 ilmaisun, ja että menetys EBNA1 voi helpottaa epigeneettisellä de-tukahduttamisesta GKN2 transkription. Havaitsimme myös kohonnut DNA metylaatiotasoilla klo GKN1 ja GKN2 promoottorialueille, ja mahdollinen rooli EBNA1 avautumisessa ja epigeneettiset tukahduttaminen tämän tuumorisuppressorin lokuksessa.
Tulokset
tunnistaminen korkean käyttöasteen EBNA1 sitoutumispaikasta GKN1 -GKN2 lokuksen Chip-Seq
Aiemmin julkaistut chip Seq tietoja Raji BL soluista paljasti rajoitetun määrän korkeasti rikastetun EBNA1 sitoutumiskohtia perustuu huippu Palaa ylös numerot [17]. Lisäksi tarkastus paljasti vahvan EBNA1 sitoutumiskohta sijaitsee ylävirtaan alku sivustoja divergentisti puhtaaksi GKN1 ja GKN2 geenien (kuvio 1A, ylempi kappale). Samanlainen EBNA1 sitova huippu havaittiin erillisessä ChIP-Seq koe suoritetaan EBV positiivinen nenänielun masolulinjassa C666-1 (koko chip seuraavat tiedot julkaistaan ​​muualla), mikä osoittaa, että tämä sitoutuminen tapahtuu sekä epiteelin, sekä imukudoksen solutyyppejä (kuvio 1A, alempi kappale). Keskellä huippu sijaitsi ~ 5 kb GKN2 ja ~ 15 kb alkaen GKN1 transkription aloituspaikkoja. ChIP-qPCR käytettiin validoimiseksi EBNA1 sitoutumisesta GKN1-GKN2 promoottorialue sekä Raji ja C666-1-soluja (kuvio 1 B ja C). qPCR osoitti, että EBNA1 sitoutuneen GKN1-2 sivuston samanlainen tehokkuus aiemmin validoitu EBNA1-sitoutumispaikasta PITPNB promoottori. qPCR ilmoitti myös, että EBNA1 sitoutuminen GKN1-GKN2 oli erityinen, koska ei ollut havaittavissa EBNA1 sitovaa joko solu- GAPDH lokuksen tai EBV OriLyt ohjaus alueilla, odotetusti (kuvio 1 B ja C). Oletetun EBNA1 sitoutumiskohdan GKN1-GKN2 lokukseen tunnistettiin linjassa yksimielisyys sitoutumiskohtaan EBV perheen toistoja (FR) alueella, ja tämä sekvenssi testattiin sitten suoraan sitoutumisen EBNA1 EMSA (kuvio 1 D). Puhdistettu rekombinantti-EBNA1 DBD-proteiini määritettiin sitoutuminen koettimia, jotka sisältävät GKN1-GKN2 päällä (GKN1 /2), FR, tai negatiivinen kontrolli sekvenssin, josta puuttuu konsensus EBNA1 sitoutumiskohdan. Olemme havainneet, että EBNA1 DBD sidottu tehokkaasti kuin GKN1-GKN2 päällä, samoin kuin FR-konsensuksen, mutta ei sitoudu ohjaukseen. Nämä havainnot viittaavat siihen, että EBNA1 vuorovaikutuksessa GKN1-GKN2 promoottorialueen suoralla DNA: ta sitova kanssa EBNA1 DBD. Kuvio 1 EBNA1 toutuu GKN1 ja GKN2 promoottorin lokukseen. (EN) UCSC genomi selainta käytettiin kartoittamaan EBNA1 sitova huippu tuotetaan Raji ja C666-1 chip seuraavissa klo GKN1 ja GKN2 geenilokukset. RefSeq selityksin selostukset esitetään alla chip-Seq huippu. (BC) Realtime-PCR validointi ChIP-seuraavissa tiedot EBNA1 sitoutumispaikasta GKN1 /2 yhteistä promoottorialue: EBNA1 (punaiset palkit) tai kontrolli-lgG (siniset palkit) analysoitiin siru Raji (B) tai C666-1 soluja (C) DNA: ta sitovan klo GKN1 /2 päällä, PITPNB promoottori, GAPDH tai EBV Ori-Lyt. (D) EMSA-analyysi 32P leimattujen koettimien sisältävä Control GKN1 /2 päällä, tai EBV FR. Vaihtelevat määrä EBNA1 DBD proteiinia käytettiin sitova reaktiossa (0, 100, 300, 900 ng). Arrowheads edustavat EBNA1-erityiseksi sidotuksi kompleksit tai vapaa koetin kuten on osoitettu. Koetin sekvenssi GKN1 /2 päällä ja FR on merkitty sekvenssin homologi (punaisin kirjaimin) välillä GKN1 /2 ja FR. Negatiivinen kontrolli (Ctrl) sekvenssi on myös merkitty. Virhe palkit osoittavat keskihajonta keskiarvosta (SDM) n = 3.
GKN1 ja GKN2 mRNA ovat erittäin ilmaistaan ​​ensisijaisesti vatsassa kudosten
Seuraavaksi me mitata GKN1 tai GKN2 mRNA-tasoja erilaisissa mahakarsinoo- solujen linjat ja perusterveydenhuollossa normaali mahalaukun kudosta qRT-PCR: llä (kuvio 2). Olemme havainneet, että GKN1 ja GKN2 ilmennetään huomattavasti suuremmat (~ 3 x 10 4 kertaisesti) ensisijainen mahan kudoksessa kuin missään testatuista solulinjoista (kuvio 2A). Vaikka paljon matalammalla tasolla kuin ensisijainen vatsa kudos, GKN1 ja GKN2 molemmat ilmentyvät mitattavia tasoilla AGS mahalaukun sinoomasolulinjoja, jossa GKN2 ilmaisi korkeammalla tasolla kuin kaikki muut GC solulinjoihin tai EBV positiivinen B-solu- tai NPC solulinjoja ( Kuvio 2B). Hyvin alhainen GKN1 tai GKN2 voitiin havaita ensisijaisesti suun epiteelikudos, joka lisäksi osoittaa, että nämä geenit ovat spesifisiä ensisijaisesti mahan-kudosta. Kuvio 2 GKN1 ja GKN2 mRNA ovat erittäin ilmaistaan ​​ensisijaisesti vatsassa kudoksessa. RT-PCR suoritettiin analysoida mRNA taso GKN1 (siniset palkit) tai GKN2 (punainen palkit) eri solulinjojen GC-johdetut GTL, MKN28, MKN74, SNU638, AGS, BL-johdettu Raji EBV immortalized LCL, EBV positiivinen NPC line C666-1 tai ensisijainen suun epiteelisolut verrataan (A) tai ilman (B) ensisijainen vatsan kudosta. Virhepylväät osoittavat standardipoikkeaman keskiarvosta (SDM), kun n = 3.
EBV latenssi vähentää GKN1 ja GKN2 mRNA: n ekspression GC solulinjoissa
vaikutuksen testaamiseksi EBV piilevien tartuntojen GKN1 ja GKN2 ilmaisun, muodostimme AGS solulinja, joka sisältää EBV B95.8 bakmidi. AGS solulinja valittiin hygromysiiniresistenssin ja GFP positiivisuus sen varmistamiseksi, että se sisälsi bacmid komponentteja. Luonnehtia AGS-EBV-solulinja, ensin analysoidaan EBV geeniekspressiomalli (kuvio 3). Olemme havainneet, että AGS-EBV-solut ilmensivät havaittavissa mRNA-tasoja ja EBNA1, BARF0, ja LMP2A, mutta ei LMP1, EB- NA2, tai EBNA3C (kuvio 3). Vaikka EBV B95.8 bakmidi puuttuu Bart miRNA, nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​AGS-EBV-solujen antamiseksi variantti tyypin I latenssi geenin ilmentymisen ohjelma joidenkin ilmaisua LMP2A, samankaltainen kuin EBV positiivinen mahakarsinoo- kasvainkudoksen [8, 10 ]. Edelleen karakterisoimiseksi AGS-EBV-soluja, analysoitiin EBNA1-proteiinin ekspression Western blot (kuvio 4A) ja EBV-DNA: n kopioluvun mukaan qPCR (kuvio 4B). EBNA1 havaittiin yhtenä vähäisessä määrin lajien odotettu molekyylimassa (kuvio 4A). EBV kopiomäärä mitattiin vertaamalla EBV Ori-Lyt DNA solujen GAPDH (kuva 4B). Olemme havainneet, että AGS-EBV sisälsi ~ 50% vähemmän kopioita virusgenomin verrattuna EBV positiivinen LCL. Sen määrittämiseksi, onko EBNA1 säilyttänyt DNA: ta sitova aktiivisuus AGS-EBV, teimme tavanomaisen ChIP määrityksissä (kuvio 4C). Olemme havainneet, että EBNA1 sidottu EBV Dyad Symmetry (DS) DNA, samoin kuin sen GKN1-GKN2 sitoutumiskohdan AGS-EBV-soluja. Me seuraavaksi kysytään GKN1 tai GKN2 mRNA vaikutti EBV piilevä infektio AGS soluissa vertaamalla RT-qPCR ekspressiotasot AGS suhteessa AGS-EBV-solut (kuvio 4D). Huomasimme, että GKN1 ja GKN2 oli tukahdutettu ~ 3-8 kertaisesti AGS-EBV suhteessa AGS soluihin, mikä viittaa siihen, että EBV latenssi edistää tai stabiloi transkription tukahduttaminen GKN1 ja GKN2. Kuvio 3 karakterisointi EBV geeniekspression AGS-EBV solulinjoissa. AGS, AGS-EBV positiivinen, ja EBV-LCL määritettiin mRNA ilmentyminen qRT-PCR alukkeilla EBNA1, BARF0, LMP2A, LMP1, EB- NA2 tai EBNA3C, kuten on osoitettu. Virhepylväät osoittavat standardipoikkeaman keskiarvosta (SDM), kun n = 3.
Kuvio 4 EBV-infektio AGS solujen estää GKN1 ja GKN2 transkription. (A) Western blot-analyysi EBNA1 proteiinin ilmentymisen AGS-EBV-solujen verrattuna EBV-negatiivisten AGS soluihin suoritettiin käyttämällä vasta-ainetta EBNA1 (ylhäällä) tai Actin (alhaalla). (B) DNA kopiomäärä määritettiin reaaliaikaisella PCR EBV Ori-Lyt DNA suhteessa tasoon solujen GAPDH AGS, AGS-EBV, ja EBV-LCL-solujen. (C) siru ja reaaliaikainen PCR-analyysi EBNA1 (punaiset palkit) tai kontrolli-lgG (siniset palkit) DNA sitoutumisesta EBV sivustoja kuten DS ja Ori-Lyt, tai solu sivustot kuten GKN1 /2 ja GAPDH AGS-EBV solut. (D) RT-PCR suoritettiin analysoida mRNA tasoa GKN1 tai GKN2 in AGS (siniset palkit) tai AGS-EBV-solut (punaiset palkit). ** Osoittaa p < 0,005. Virhe palkit osoittavat keskihajonta keskiarvosta (SDM) n = 3.
EBV lisää DNA: n metylaatio riippuvainen tukahduttaminen GKN1 ja GKN2 mRNA GC solulinjoissa
GKN1 ja GKN2 voidaan tehdä epigeneettiset tukahduttaminen GC ja kudosten kulttuuri solulinjoja. Tutkia tätä mahdollisuutta, testasimme onko hoito DNA demetyloivan agentti 5 'atsasytidiini (atsa) tai deasetyloimalla agentti (NaB) yhdistettynä forboliesterin (TPA) aktivoisi GKN1 tai GKN2 in AGS soluissa (kuvio 5A). Olemme havainneet, että Aza hoito johti ~ 10 kertainen lisäys GKN2, ja ~ 4 kertainen nousu GKN1 transkription AGS käsitellyissä soluissa. Sen sijaan, NaB /TPA hoitoon tuotetaan vain ~ 2-kertainen aktivoituminen transkription. Nämä havainnot viittaavat siihen, että sekä GKN1 ja GKN1 ovat aktiivisesti epigeneettisellä sorron kautta DNA: n metylaatio. Sen testaamiseksi, EBV ollut vaikutusta Aza aiheuttama aktivointi GKN1 tai GKN2 vertasimme vaikutuksia Aza hoidon AGS suhteessa AGS-EBV solujen qRT-PCR (Kuva 5B). Huomasimme, että GKN1 ja GKN2 olivat tehokkaasti aktivoitiin Aza käsittely AGS soluissa, mutta vähemmässä määrin AGS-EBV. Näissä kokeissa, Aza-indusoidun aktivaation GKN2 oli täysin eliminoitu, kun taas aktivaatio GKN1 oli vain osittain heikennetty. Atsa-hoito johti myös ~ 8,4 kertainen lisäys EBNA1 mRNA-tasojen, mikä viittaa siihen, että Aza hoito stimuloi EBV lyyttinen geeniekspression AGS-EBV solulinjoissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, EBV-geenituotteiden estää GKN2, ja vähemmässä määrin GKN1 aktivoinnin jälkeen Aza hoidon. Kuva 5 EBV vahvistaa tukahduttaminen GKN1 ja GKN2 geeniekspressiota DNA: n metylaatio. (A) AGS-soluja käsiteltiin 10 uM Aza, tai 1 mM NaB ja 20 ng /ml TPA: ssa 48 tuntia ja analysoitiin RT-PCR: llä GKN1 tai GKN2 ilmentymisen tasolla verrattuna käsittelemättömään AGS. (B) AGS-soluja tai AGS-EBV-soluja käsiteltiin tai ei käsitelty 10 uM: Aza 48 tuntia, määritettiin sitten GKN1, GKN2 mRNA tai EBNA1 mRNA-tasoja. (C) MeDIP määritystä AGS tai AGS-EBV-solut, joita käsiteltiin tai ei käsitelty 10 uM: Aza 48 tunnin ajan eri DNA-alueita GKN1 ja GKN2 loci. (D) MeDIP määritystä AGS tai AGS-EBV käsiteltyjä soluja tai käsittelemättömiä 10pM Aza 48 tuntia solu- alueiden alpha globiini-2, GAPDH, Cdc7, FOXP2, HDAC3, tai MAP3KIP2. (E) Genome asema käytettyjen alukkeiden GKN1-GKN2 ChIP ja MeDIP määrityksissä. * Osoittaa p < 0,05, ** osoittaa p < 0,005. Virhepalkkeja merkitty SDM n = 3.
Jotta paremmin ymmärtää mekanismia GKN1 ja GKN2 epigeneettiset tukahduttaminen, tutkimme DNA metylaatiotasoilla käyttämällä metyyli sytosiini-spesifistä vasta-ainetta suunnatun DNA immunosaostuksella (MeDIP) määritys. Me testattiin rikastamista metyloitua DNA: GKN1-GKN2 säätelyalue AGS ja AGS-EBV-solujen kanssa tai ilman Aza hoitoa (kuvio 5C). Havaitsimme suhteellinen rikastuminen metyloitu CpG on alueella välillä EBNA1 sitoutumiskohdan ja GKN2 transkription aloituskohdasta (GKN2_A). Aza hoito johti vähenemiseen MeDIP signaali useimmilla alueilla, joilla signaali on havaittu, mikä viittaa siihen, että Aza hoito johti laskivat yleisesti DNA: n metylaatio. Variantit menetys CpG metylaatio havaittiin alfa-globiinigeenin (joka ei sido EBNA1), ja useita EBNA1 sitoutumiskohdista, mukaan lukien HDAC3 ja MAP3K7IP (kuvio 5D). Totesimme myös, että MeDIP signaalit olivat yleensä korkeampia EBV-AGS kuin AGS soluissa, mikä viittaa siihen, että EBV piilevä infektio voi edistää tai vakauttaa DNA: n metylaatio koko isännän genomiin.
EBNA1 ehtyminen aktivoi GNK1 ja GKN2 mRNA ilmaisun EBV positiiviset epiteelisolujen
sen määrittämiseksi EBNA1 osaltaan transkription tukahduttaminen GKN1 ja GKN2, ensin yrittänyt heikentävistä EBNA1 in AGS-EBV-soluissa käyttämällä siRNA (kuva 6). Olemme tuottaneet siRNA kohdistettu 3 'ei-koodaavat UTR EBNA1 mRNA, joka tyhjenee osittain EBNA1-proteiinin AGS-EBV-solut (kuvio 6B). Ehtyminen EBNA1 johti ~ 5-kertainen aktivoituminen GKN2, joilla on vain vähän havaittavissa aktivointi GKN1 (kuvio 6A). Nämä havainnot viittaavat siihen, että EBNA1 voi toimia transkription repressori GKN2 in AGS-EBV-soluja. Kuva 6 siRNA ehtyminen EBNA1 aiheuttaa de-tukahduttamisen GKN1 ja GKN2 in AGS-EBV soluissa. siCtrl tai siEBNA1 transfektoitu AGS-EBV-solut analysoitiin RT-PCR: llä GKN1 tai GKN2 mRNA-tasolla suhteessa solujen GAPDH (A). Solut kerättiin 72 tuntia transfektion jälkeen siRNA. Western blot, joka osoittaa EBNA1 (yläpaneeli) ja lastaus valvonta Actin (alempi paneeli) in AGS-EBV-solut (B). Virhe palkit osoittavat keskihajonta keskiarvosta (SDM) n = 3.
EBNA1 estää GKN1 ja GKN2 transkription jälkeen DNA demetylaatio
edelleen tutkia osuus EBNA1 jotta GKN1 ja GKN2 transkription sääntelyn testasimme vaikutus ektooppinen ilmentyminen EBNA1 yksin Aza aiheuttama tasoja GKN1 tai GKN2 transkription GC soluissa. AGS solut transdusoitiin kanssa EBNA1 ilmentävien lentiviruksen. Vakaa AGS-EBNA1 (PLU-EBNA1) tai AGS- kontrollivektorille (PLU-Vec) solulinjat valittiin ja analysoitiin GKN1 ja GKN2 mRNA-tasoja. Havaitsimme, että AGS-EBNA1 soluilla oli ~ 2-3 kertaa korkeampi pohjapinta taso GKN1 ja GKN2 mRNA suhteessa vanhempien AGS soluihin (kuvio 7A). Kuitenkin Aza aiheuttama mRNA tasot GKN1 ja GKN2 oli vaimentunut AGS-EBNA1 verrattuna AGS soluihin (kuvio 7B). Aza käsittely johti myös suuri lisäys EBNA1 mRNA (kuvio 7C). Voit selvittää vaikutukset EBNA1 on GKN1 ja GKN2 olivat ominaisia ​​AGS soluihin, me transdusoitu toinen EBV negatiivinen GC solulinjassa MKN74 kanssa EBNA1 lentiviruksen (Kuva 7D-F). Samanlaisia ​​AGS soluja, olemme huomanneet, että EBNA1 lisääntynyt pohjapinta tasoilla GKN1 ja GKN2, mutta esti kykyä Aza edelleen aiheuttaa GKN1 ja GKN2 mRNA-tasot (kuvio 7D ja E). Olemme vahvistaneet, että Aza-hoito oli tehokas mittaamalla EBNA1 mRNA, mikä lisäsi ~ 7-kertaiseksi (kuvio 7F). Nämä havainnot viittaavat siihen, että ektooppinen ilmentyminen EBNA1 voi lisätä pohjapinta, mutta estävät Aza aiheuttamaa tasoa GKN1 ja GKN2 transkriptio EBV-negatiivisten GC solulinjoissa. Kuva 7 EBNA1 estää GKN1 ja GKN2 transkription jälkeen DNA demetylaatio GC soluissa. (A) AGS-solut transdusoitiin PLU-Vector (Vec) tai PLU-EBNA1 ja sitten käsittelemätön (Untr) tai käsiteltiin 10 uM 5'-atsasytidiini (atsa) 48 tunnin ajan. GKN1 ja GKN2 mRNA kvantifioitiin qRT-PCR suhteessa GAPDH. (B) Taita induktio GKN1 ja GKN2 mRNA Aza kvantitoitiin keskukselta A. (C) qRT-PCR-analyysi EBNA1 mRNA tasojen AGS soluissa. (D) Sama kuin A, paitsi että käytettiin MKN74 sijaan AGS soluja. (E) Taita induktion GKN1 ja GKN2 mRNA kvantitoitiin keskukselta D. (F) qRT-PCR-analyysi EBNA1 mRNA tasojen MKN74 soluissa. * Osoittaa p < 0,05, ** osoittaa p < 0,005. Virhepalkkeja merkitty SDM n = 3.
Keskustelu
Tässä tutkimuksessa tunnistimme korkean käyttöasteen EBNA1 sitoutumiskohdan 5'promoottori valvonta alueella divergentisti puhtaaksi GKN1 ja GKN2 geenejä. EBNA1 sitoutumiskohtia havaittiin kaksi toisistaan ​​riippumatonta ChIP-Seq aineistoja EBV positiivinen lymfaattisessa BL Raji ja EBV positiivinen epiteelisolujen nenänielun karsinooman solut C666-1 (kuvio 1A). Olemme vahvistaneet nämä sitoutumiskohdat tavanomaisilla chip qPCR molemmissa solulinjoissa (kuvio 1 B ja C). EBNA1 osoitettiin myös sitoutuvan suoraan nämä sivustot EMSA puhdistetulla yhdistelmä-EBNA1 DBD-proteiinia (kuvio 1 D). Osoitamme, että GKN1 ja GKN2 mRNA-tasot ovat erittäin tukahdutettu useimmissa solulinjoissa suhteessa ensisijaisen mahalaukun kudoksen (kuvio 2). Tutkia mahdollinen rooli EBV ja EBNA1 in transkriptionaalisen säätelyn GKN1 ja GKN2, me tuotti EBV positiivinen AGS mahakarsinoo- solulinjassa. Osoitamme, että EBV tekee muunnoksen tyypin I latenssi kuvio AGS-soluissa (kuvio 3), ja että EBNA1 voi sitoutua GKN1 /GKN2 promoottorialueen solun kromosomissa (kuvio 4C). Olemme myös havainneet, että GKN1 ja GKN2 mRNA edelleen tukahdutettiin EBV positiiviset AGS solujen suhteen kontrolloida EBV negatiivinen AGS soluja (kuvio 4D). Sitten osoitti, että Aza-hoito johti kasvuun ilmentymisen GKN1 ja GKN2 (kuvio 5A), ja että EBV piilevä infektio estää Aza aktivoinnin GKN2 (kuvio 5B). Olemme havainneet, että siRNA ehtyminen EBNA1 EBV positiivinen AGS solujen johtaa transkription aktivoituminen GKN2 (kuvio 6). Osoitamme myös, että EBNA1 ektooppinen ilmentyminen lisää kohtalaisesti pohjapinta, mutta estää Aza-indusoidun tasot GKN1 ja GKN2 transkription (kuvio 7). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että EBNA1 sitoutuu GKN1-GKN2 promoottori säätelyalue useita solutyyppejä, ja nostaa mahdollisuus, että EBNA1 edistää transkription ja epigeneettiset tukahduttamisen GKN1 ja GKN2 tuumorisuppressorigeeneille EBV positiivinen GC.
EBV piilevä infektio tiedetään lisäävän kasvaimia fenotyyppi mahakarsinooman soluista [29-31]. GKN1 ja GKN2 raportoidaan toimia solujen kasvun estäjiä ja tuumorisuppressoreita GC [20, 21, 23, 25-27]. Meidän mRNA ilmaisu data osoittaa korkean tason mRNA-ekspression vain ensisijainen normaalissa mahalaukun kudoksesta ovat johdonmukaisia ​​roolin GKN1 ja GKN2 tuumorisuppressorina. Emme kuitenkaan pystyneet osoittamaan, että yli-ilmentyminen tai molempien GKN1 tai GKN2 in AGS tai AGS-EBV aiheuttaa solukierron pysähtymisen tai vähentää elinkelpoisuutta (tietoja ei esitetty). Tämä viittaa siihen, että GKN1 ja GKN2 toiminta aiemmissa vaiheissa kasvainsolun evoluutio, tai monimutkaisempia kasvain mikroympäristöihin. Spekuloida, että EBNA1 voi olla voimakkaampi vaikutus GKN1 ja GKN2 ilmentyminen tilanteissa, joissa EBV voi saastuttaa ensisijainen mahan soluihin, joissa perusilmennystä GKN1 ja GKN2 ovat korkeat ja tärkeitä tuumorin suppression.
Edellinen julkaistuissa tutkimuksissa on osoitettu, että GKN1 ja GKN2 transkriptio edellyttää epigeneettiset tukahduttaminen DNA metylaatio kaikissa muodoissa GC [21]. Meidän tutkimukset ovat yhdenmukaisia ​​roolia DNA metylaatio epigeneettiset tukahduttaminen GKN1 ja GKN2 in AGS soluissa. Hoito Aza johti 4-10-kertainen lisääntyminen GKN1 ja GKN2 mRNA: n ilmentymisen (kuvio 5A), ja MeDIP paljasti rikastaminen metyloitua DNA promoottorin alueet (kuvio 5C). AGS-EBV-solujen teki osoittavat kasvua DNA metylaatio useissa solun sivustoja, mukaan lukien alueet ympärillä EBNA1 sitova sivustoja GKN1 promoottorialue (kuvio 5C), sekä HDAC3 ja MAP3K7IP2 geenien (kuvio 5D). Kuitenkin läsnäolo EBNA1 in AGS-EBV solut eivät estä Aza aiheuttama demetylaation näillä paikoilla. Tämä viittaa siihen, että EBNA1 voi repressoida transkriptiota joidenkin promoottorien, kuten GKN2 kautta erilaista mekanismia DNA: n metylaation. Kuitenkin, ektooppinen ilmentyminen EBNA1 yksin tuotti monimutkaisempi fenotyyppi, mikä aiheuttaa pientä lisäystä perusilmentymisen, mutta rajoittaa vaikutuksia Aza-indusoidun demetylaatio (kuvio 7). Tämä saattaa viitata siihen, että EBNA1 voi toimia eri tavalla silloin, kun ilmaistaan ​​ektooppisesti, kuin silloin, kun on ilmaistu yhteydessä virusgenomin. Siitä huolimatta meidän havainnot viittaavat siihen, että EBNA1 häiritsee normaalia transkription säätelyn GKN1 ja GKN2 geenejä.
Tarkkaa vaikutusta EBNA1 transkription säätelyyn jää epäselväksi. EBNA1 on sekaantunut transkription aktivaation ja tukahduttaminen sekä virus- ja solun geenit [32, 33]. EBNA1 voi tukahduttaa oman mRNA lausekkeen EBV Qp tyypin III latenssi, jossa sorto on yhdistetty steerisen häiriön RNA-polymeraasia II sitoutumisesta transkription aloituskohtaan [34]. Toisaalta, EBNA1 voi aktivoida Cp ja LMP1 promoottorit tyypin III latenssin jossa se voi toimia tehostajan kaltainen tekijä [35-37]. EBNA1 on liitetty transkription aktivaation jonkin solun geenejä, mukaan lukien Nox2 osallistuvan geenin reaktiivisten happiradikaalien muodostumisen [19]. EBNA1 saattaa vaikuttaa myös isäntäsolun transkriptio kautta maailmanlaajuisen remontin isännän kromosomiin [38]. Siten EBNA1 voi muuttaa solun transkription läpi useita suoria ja epäsuoria mekanismeja.
Epigeneettiset muutoksia tiedetään olevan tärkeä rooli EBV-mahakarsinoo- [39]. Mielenkiintoista, AGS kantavien solujen EBV bakmidi genomeja oli korkeampi metyloitua DNA monissa testattu sivustoja (kuvio 5D). Tämä on yhdenmukainen ehdotetun rooli EBV metyloinnissa isännän tuumorisuppressorigeeneille [40]. Tämä on sopusoinnussa myös havaintoja, EBV positiivinen GC on kohonnut DNA metylaatio promoottorialueille useiden keskeisten GC tuumorisuppressorien, kuten gastrokine geenit [39, 41-45]. Vaikka EBNA1 sidottu kohteen DNA-metyloitu alueilla GKN2, emme kyenneet osoittamaan, että EBNA1 moduloi DNA: n metylaatio on GKN1 ja GKN2 sivustoja (tuloksia ei ole esitetty). On kuitenkin mahdollista, että EBNA1 yhdessä toisen viruksen koodatun tai aiheuttama tekijä voi vakauttaa GKN1 ja GKN2 transkription sorron kautta chromatin riippuvaisen ja rakenteellinen mekanismi, joka vahvistaa DNA: n metylaatio. On myös mahdollista, että EBNA1 voi säädellä GKN1 tai GNK2 ainoastaan ​​kudoksen tai kasvaimen mikroympäristöihin, jotka eivät ole helposti toisteta soluviljelmässä. Vaikka toiminta EBNA1 sitoutumisen isäntäsolun kromosomiin sivustoja on edelleen tärkeä ala tutkimuksen, kehittyneempiä -infektiomalleja voidaan vaatia selvittämään mahdollista asemaa muuttamalla isäntäsolun geenien ilmentymistä ja syövän syntymistä. Tool Menetelmät
Solut, plasmidit, ja lentivirus infektio
EBV-positiivinen Burkittin lymfooman Raji-soluja EBV-positiiviset nenä-nielun karsinooman C666-1 soluja, ja mahalaukun karsinooma solulinjoja (lahja Dr. Antonia R. Sepulveda, Columbia University), mukaan lukien GTL, MKN28, MKN74, SNU638 pidettiin yllä RPMI, joka sisälsi 10% FBS: ää ja jota on täydennetty antibiooteilla (penisilliini ja streptomysiini). Mahasyöpä AGS-solut (ATCC nro CRL-1739) ylläpidettiin F-12K, joka sisälsi 10% FBS: ää. Ensisijainen suun epiteelisolut saatiin Dr. Manjunathan Benakanakere, University of Pennsylvania ja viljeltiin keratinosyyttispesifisestä SFM väliaineessa. EBV-LCL perustettiin ensisijainen infektio perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC) kanssa EBV BAC virionien tuotetaan stimuloiduista 293-EBV-solujen [46, 47]. EBV-LCL sisältää hygromysiini B kestävä EBV bacmid pidettiin yllä RPMI, joka sisälsi 10% FBS: ää, hygromysiini B (100 ug /ml), glutamax (Invitrogen), ja antibiootteja. AGS-EBV-solut syntyvät AGS soluista viljeltiin yhdessä EBV-LCL sovittamalla aiemmin julkaistu yhteistyössä viljely kuvattua AGS solujen infektio rEBV läpi solusta soluun kontakti [48] kanssa joitakin muutoksia. Lyhyesti, EBV-LCL indusoitiin 20 ng /ml 12-O
-tetradecanoylphorbol-13-asetaatti (TPA) ja 1 mM natriumbutyraattia (NaB), 24 tuntia ennen yhteisviljelyyn. Indusoituneen EBV-LCL solut pestiin PBS: llä kahdesti kokonaan poistaa indusoivat aineet, suspendoitiin uudelleen täydelliseen RPMI-alustassa 10 6 solua /ml ennen koinkubaation. AGS-solut maljattiin 6-kuoppalevyillä 24 tuntia ennen co-viljely, sitten 60-70% konfluentteja AGS soluista 1 ml täydellistä F-12K väliaine inkuboitiin 10 6 aiheuttama ja pestään EBV-LCL solua 1 ml täydellinen RPMI. 24 tuntia myöhemmin, 2 ml seerumitonta F-12K väliainetta lisättiin kuhunkin kuoppaan vähentää FBS pitoisuus 5%, jotta solujen liikakasvua. 3 vuorokauden kuluttua koinkubaation, EBV-LCL solut poistettiin yhteistyössä kulttuureissa ja AGS solut pestiin perusteellisesti PBS: vähintään 5 kertaa poistaa kaikki luovuttajan EBV-LCL-solujen. Tartunnan AGS soluja inkuboitiin sitten tuoreella F-12K väliaineessa 10% FBS: ää ja 100 ug /ml hygromysiini B: n ja valinnan väliaine vaihdettiin joka 2-3 päivä, kunnes tartunnan AGS solut muodostivat Hyg B valinta pesäkkeet, joiden GFP: n ilmentymisen (yleensä 3-4 viikkoa sen jälkeen, kun co-viljely). Valinta pesäkkeet yhdistettiin sitten ja testattiin EBNA1 ilmaisun ja EBV genomin kopioluvun ennen kohteena kokeita. AGS-EBV-soluja ylläpidettiin F-12K väliaineessa 10% FBS: ää ja 100 ug /ml hygromysiini B:
PLU-EBNA1 Lentivirus ekspressiovektori rakennettiin PCR-monistuksella EBNA1 alukkeiden kanssa (GCGGGATCCTCTGACGAGGGGCCAGGTACAGGACCT ja ATCGTCGACTCACTCCTGCCCTTCCTCACCCTCATC) lisätään 5 ' BamHI- ja 3 'Sall-sivusto kloonattiin kehyksessä PLU-TCMV-FMC-pPURO. AGS tai MKN74 solut infektoitiin lentivirustartunnat ilmentävien PLU-EBNA1 tai PLU kontrollivektorille syntyy tuoreena 293T-soluihin. Tartunnan AGS tai MKN74 soluja valittiin sitten 2,5 ug /ml Puromysiini on 10-14 päivä. Valitut solut yhdistettiin ja käsiteltiin tai ilman 5'-atsasytidiini 48 tuntia altistettiin sitten RT-PCR.
SiRNA vastaan ​​EBNA1 ja siRNA valvonta (Cat. No. D-001810-01-20) olivat kaikki hankittiin Dharmacon. vastaan ​​suunnattu siRNA EBNA1 3'UTR syntetisoitiin käyttämällä kohdesekvenssiä CGGAGAUGACGGAGAUGAAUU. Transfektio siRNA dupleksit suoritettiin käyttäen Oligofectamine (Dharmacon), seuraavien valmistajien tekniset tiedot.
Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) määritykset
ChIP-määritykset suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [49]. Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Long ei-koodaavat RNA mentymisprofiili ihmisen mahasyövän ja sen kliinisten merkitykset
• In silico analyysi mahakarsinooman Serial analyysi Gene Expression kirjastojen paljastaa eri liittyviä profiileja etnisyys