EBNA1 unión y la regulación epigenética de los genes supresores de tumores gastrokine en células de carcinoma gástrico

EBNA1 unión y la regulación epigenética de los genes supresores de tumores gastrokine en células de carcinoma gástrico
Resumen Antecedentes

virus de Epstein-Barr (VEB) infecta de forma latente ~ 10% de los carcinomas gástricos (GC). Epstein-Barr antígeno nuclear 1 (EBNA1) se expresa en GC asociado al EBV, y se puede unir ADN del huésped, en las que puede afectar la regulación génica celular. Aquí, mostramos que EBNA1 se une directamente al ADN aguas arriba de los genes supresores de tumores GC-específica de forma divergente transcritas gastrokine 1 (GKN1) y gastrokine 2 (GKN2).
Métodos
Nosotros utilizamos el chip-Sec, chip-qPCR, y EMSA para demostrar que EBNA1 se une directamente al promotor GKN1 y GKN2 locus. Generamos AGS-EBV, y las líneas celulares AGS-EBNA1 para estudiar los efectos de EBNA1 en la expresión GKN1 y GKN2 mRNA con o sin 5 'azacytidine tratamiento.
Resultados
Mostramos que los genes gastrokine están transcripcionalmente silenciados por la metilación del ADN . También muestran que la infección por VEB latente reduce aún más GKN1 y GKN2 la expresión en células de carcinoma gástrico AGS, y que el agotamiento de siRNA de EBNA1 alivia parcialmente esta represión. Sin embargo, la expresión ectópica de EBNA1 aumentó ligeramente los niveles de ARNm y GKN1 basal GKN2, pero redujo su capacidad de respuesta al agente de desmetilación.
Conclusiones
Estos hallazgos demuestran que EBNA1 se une al promotor divergente de los genes GKN1 y GKN2 en las células de GC, y sugieren que EBNA1 contribuye al complejo transcripcional y la desregulación epigenética de los genes supresores de tumores y GKN1 GKN2 en GC EBV positivo.
Palabras clave
EBV EBNA1 carcinoma gástrico Gastrokine chip-Sec epigenética Introducción
de Epstein-Barr virus ( EBV) es un herpesvirus gamma humano que se encuentra en una amplia gama de enfermedades malignas linfoides y células epiteliales, como el linfoma de Burkitt, enfermedad de Hodgkin, carcinoma nasofaríngeo (NPC), y la enfermedad linfoproliferativa postrasplante (revisado en [1, 2]). Más recientemente, EBV se ha encontrado en ~ 10% de todos los casos de carcinoma gástrico (GC) en todo el mundo [3, 4]. Asociado al EBV GC se ha demostrado ser una consecuencia monoclonal de las células epiteliales gástricas infectadas por EBV y se considera que es un subtipo diferente de GC [5, 6]. Debido a que la incidencia de CG se encuentra cerca de 900.000 personas por año [7], GC asociada con el EBV puede ser uno de los cánceres asociados a EBV más prevalentes.
En EBV células de carcinoma gástrico positivos, EBV establece un tipo de variante I latencia, donde transcripción EBV se limita al tipo canónico I genes EBNA1, EBERs, familia de BART ARN y miRNAs no codificante, pero con algo de expresión adicional de LMP2A [6, 8-11]. Entre estos genes de latencia, EBNA1 es la única proteína viral nuclear que se detecta en GC asociado al EBV. Se requiere EBNA1 para el establecimiento de la infección latente episomal y para la supervivencia a largo plazo de las células con infección latente [12-15]. EBNA1 es una proteína de unión a ADN que se une a ambos sitios cromosómicos virales y del huésped. Los sitios de unión en el genoma viral se han caracterizado para las funciones esenciales en la replicación y el control transcripcional de la expresión génica viral. Sin embargo, la función de EBNA1 secuencia específica de unión al cromosoma huésped es menos conocido. Mientras EBNA1 puede unirse a las regiones promotoras de varios genes del huésped, no queda claro si estos genes están sujetos a regulación EBNA1 [12, 16, 17]. La sobreexpresión del dominio de unión de ADN EBNA1, que funciona como un dominante negativo en células infectadas con EBV, pueden inhibir la viabilidad celular en las células no infectadas, lo que sugiere que se une a EBNA1 y regula genes celulares importantes para la supervivencia celular [18]. La expresión ectópica de EBNA1 se ha demostrado para efectuar la expresión del ARNm de la célula huésped [19], pero no está claro si estos efectos son directos o indirectamente relacionados con los sitios específicos de unión a EBNA1 en el genoma celular.
En un estudio anterior, hemos utilizado métodos de chip-ss para analizar los sitios de enriquecimiento de todo el genoma de EBNA1 en células de linfoma de Burkitt Raji de infección latente e identificaron numerosos sitios celulares vinculados por EBNA1 [17]. Entre los sitios de enriquecimiento celular EBNA1 hemos identificado un significativo pico de unión a EBNA1 situado en el gastrokine 1 (GKN1) y gastrokine 2 (GKN2, también conocido como factor trébol interacción de proteínas (TFIZ1)) el grupo de genes. GKN1 y GKN2 se han identificado en base a su frecuente pérdida de la expresión en células de carcinoma epiteliales gástricas neoplásicas, en comparación con el tejido normal gástrico [20-22] (revisado en [23]). Varios estudios recientes han descrito anti-proliferativa y la actividad anti-invasivo para GKN1 en las células epiteliales gástricas, que, junto con su pérdida de expresión frecuente en el cáncer, sugiere que funciona como supresor de tumor específico de epitelio gástrico [21, 24-28]. GKN1 puede inhibir la migración celular y la invasión en la cicatrización de heridas, transwell y ensayo de Matrigel, así como marcadores de células alter asociados con la transición epitelial-mesenquimal [26]. GKN1 y GKN2 genes se encuentran en estrecha proximidad y transcriben en direcciones opuestas, lo que sugiere que probablemente comparten un promotor bidireccional, y están sujetos a la regulación coordinada por factores reguladores de la transcripción compartida (revisado en [23]). En este
estudio, hemos demostrado la unión directa entre EBNA1 y loci GKN1-GKN2 y se investigaron GKN1 y GKN2 modulación de la expresión génica por la infección por VEB y la proteína EBNA1. Nuestros hallazgos sugieren que la infección por VEB puede inhibir aún más GKN1 y GKN2 expresión, y que la pérdida de EBNA1 puede facilitar la epigenética de la represión de la transcripción GKN2. También hemos observado niveles elevados de metilación del ADN en GKN1 y GKN2 regiones promotoras, y un posible papel de EBNA1 en la desregulación y la represión epigenética de este locus supresor de tumores.
Resultados
Identificación de un sitio de unión a EBNA1 GKN1 de alta ocupación locus -GKN2 de chip-Seq
Anteriormente publicó los datos de chip-Seq a partir de células Raji BL reveló un número limitado de sitios de unión a EBNA1 altamente enriquecido en base a las puntuaciones máximas y leer los números [17]. Además inspección reveló un fuerte sitio de unión a EBNA1 situado aguas arriba de los sitios de inicio para los genes GKN1 y GKN2 divergente transcritos (Figura 1A, pista superior). Un pico de unión a EBNA1 similar se observó en un experimento de chip-Sec separados realizados en la línea celular de carcinoma nasofaríngeo positivo EBV C666-1 (datos completos de chip-ss que se publicarán en otro lugar), lo que indica que se produce esta unión en tanto epiteliales, así como linfoide tipos de células (Figura 1A, pista inferior). El centro del pico se encuentra ~ 5 kb de GKN2 y ~ 15 kb de los sitios de inicio de transcripción GKN1. Chip-qPCR se utiliza para validar la unión a la región promotora GKN1-GKN2 tanto en células C666-1 (Figura 1B y C) y Raji EBNA1. qPCR indicó que EBNA1 unido al sitio GKN1-2 con eficiencia similar a un sitio de unión a EBNA1 previamente validado en el promotor PITPNB. qPCR también indicó que la unión a GKN1-GKN2 EBNA1 era específica ya que no había unión ya sea en el locus GAPDH celular o regiones de control EBV EBNA1 OriLyt detectable, como se esperaba (Figura 1B y C). El sitio de unión putativo EBNA1 en GKN1-GKN2 locus fue identificado por la alineación con un sitio de unión consenso de la familia de EBV de repeticiones región (FR), y después esta secuencia se ensayó para determinar la unión directa a EBNA1 por EMSA (Figura 1D). proteína DBD EBNA1 recombinante purificada se ensayó para la unión a sondas que contienen el sitio GKN1-GKN2 (GKN1 /2), FR, o una secuencia de control negativo que carece de un sitio de unión consenso EBNA1. Se encontró que EBNA1 DBD obligado de manera eficiente al sitio GKN1-GKN2, así como con el consenso FR, pero no se unió a la secuencia de control. Estos hallazgos sugieren que EBNA1 interactúa con GKN1-GKN2 región promotora a través del ADN de unión directa con la EBNA1 DBD. Figura 1 EBNA1 se une al promotor y GKN1 GKN2 locus. (A) La UCSC genoma navegador se utiliza para asignar el pico de unión a EBNA1 generada a partir de Raji y C666-1 chip-ss en los loci de genes GKN1 y GKN2. RefSeq anotado transcripciones se indican debajo del pico chip-Sec. (BC) de validación en tiempo real-PCR de los datos de chip-ss de sitio de unión a EBNA1 en la región promotora GKN1 /2 compartida: EBNA1 (barras rojas) o IgG control (barras azules) se analizaron por chip en Raji (B) o C666-1 las células (C) para el ADN de unión en el sitio GKN1 /2, promotor PITPNB, GAPDH, o EBV Ori-Lyt. análisis (D) de la EMSA marcado con 32P sondas que contienen de control, GKN1 /2 sitio, o FR de EBV. se utilizó una cantidad variable de la proteína EBNA1 DBD en la reacción (0, 100, 300, 900 ng) de unión. Las puntas de flecha representan complejos unidos-EBNA1 específica o sonda libre como se indica. La secuencia de la sonda de GKN1 /2 sitio y FR se indica con la secuencia de homólogos (letras rojas) entre GKN1 /2 y FR. La secuencia de control negativo (Ctrl) también se indica. Las barras de error indican la desviación estándar de la media (MDF) para n = 3.
GKN1 y mRNA GKN2 son altamente expresado en el tejido de estómago primario
A continuación mide los niveles de ARNm de GKN1 o GKN2 en diversas líneas de células de carcinoma gástrico y en primaria tejido gástrico normal mediante QRT-PCR (Figura 2). Se encontró que GKN1 y GKN2 se expresan en niveles mucho más altos (~ 3 × 10 4 veces) en el tejido del estómago primaria que en cualquiera de las líneas celulares ensayadas (Figura 2A). Aunque a niveles mucho más bajos que el tejido del estómago primario, GKN1 y GKN2 fueron ambos expresan a niveles medibles en las líneas celulares de carcinoma gástrico AGS, con GKN2 expresa en niveles más altos que todas las demás líneas celulares GC, o EBV de células B positivo o líneas celulares de la APN ( Figura 2B). Niveles muy bajos de GKN1 o GKN2 podría ser detectada en el tejido epitelial oral de primaria, lo que indica, además, que estos genes son específicos para los gástrica-tejido primario. Figura 2 GKN1 y mRNA GKN2 son altamente expresado en el tejido de estómago primario. RT-PCR se realizó para analizar el nivel de ARNm de GKN1 (barras azules) o GKN2 (barras rojas) en diferentes líneas celulares incluyendo GC derivado de GTL, MKN28, MKN74, SNU638, AGS, BL-deriva Raji, EBV inmortalizado LCL, EBV línea de la APN positivo C666-1, o células epiteliales bucales primaria comparan con (A) o sin (B) tejido del estómago primaria. Las barras de error indican la desviación estándar de la media (MDF) para n = 3. latencia
EBV reduce la expresión GKN1 y GKN2 ARNm en las líneas celulares de GC
a probar el efecto de la infección latente de EBV en la expresión GKN1 y GKN2, generamos una línea de células AGS contiene EBV B95.8 bácmido. La línea de células AGS fue seleccionado para resistencia a higromicina y la positividad de GFP para asegurar que contenía componentes bácmido. Para caracterizar la línea de células AGS-EBV, primero analiza el patrón de expresión génica VEB (Figura 3). Encontramos que las células AGS-EBV expresan niveles de ARNm detectables de EBNA1, BARF0, y LMP2A, pero no LMP1, EBNA2, o EBNA3C (Figura 3). Aunque bácmido EBV B95.8 carece el BART miRNAs, estos resultados son consistentes con células AGS-EBV adoptar un tipo de variante I latencia programa de la expresión de genes con una expresión de LMP2A, similar a la observada en EBV positivo tejido tumoral de carcinoma gástrico [8, 10 ]. Para caracterizar adicionalmente las células AGS-EBV, se analizó la expresión de proteína EBNA1 por Western blot (Figura 4A) y el ADN EBV número de copia por qPCR (Figura 4B). EBNA1 se detectó como una sola especie de baja abundancia en la masa molecular esperado (Figura 4A). número de copias de EBV se midió mediante la comparación de ADN EBV Ori-Lyt a GAPDH celular (Figura 4B). Se encontró que AGS-EBV contenía ~ 50% menos copias del genoma viral en comparación con LCLs EBV positivos. Para determinar si EBNA1 retuvo su actividad de unión a ADN en AGS-EBV, hemos realizado ensayos de chip convencionales (Figura 4C). Se encontró que EBNA1 unido al ADN EBV simetría palindrómica (DS), así como al sitio de unión GKN1-GKN2 en células AGS-EBV. A continuación pregunta si los niveles de ARNm o GKN1 GKN2 se vieron afectados por la infección latente de EBV en células AGS mediante la comparación de RT-qPCR niveles de expresión en relación con las células AGS AGS-EBV (Figura 4D). Se encontró que GKN1 y GKN2 fueron reprimidos ~ 3-8 veces en AGS-VEB respecto a las células AGS, lo que sugiere que la latencia del EBV promueve o se estabiliza la represión transcripcional de GKN1 y GKN2. Figura 3 Caracterización de la expresión génica VEB en líneas de células AGS-EBV. AGS, AGS-EBV positivo, y EBV-LCL se analizaron para determinar la expresión del ARNm de QRT-PCR con cebadores para EBNA1, BARF0, LMP2A, LMP1, EBNA2, o EBNA3C, tal como se indica. Las barras de error indican la desviación estándar de la media (MDF) para n = 3. Figura 4
infección por EBV de células AGS suprime GKN1 y GKN2 transcripción. (A) análisis de transferencia de Western de expresión de la proteína EBNA1 en las células AGS-EBV en comparación con las células AGS con EBV negativo se realizó usando anticuerpo para EBNA1 (parte superior) o actina (parte inferior). número (B) de copias de ADN se ensayó por PCR en tiempo real de EBV Ori-Lyt ADN en relación con el nivel de GAPDH celular en AGS, AGS-EBV, y las células EBV-LCL. (C) de chips y en tiempo real PCR análisis de EBNA1 (barras rojas) o IgG control (barras azules) para la unión al ADN en los sitios EBV incluyendo DS y Ori-Lyt o sitios celulares incluyendo GKN1 /2 y GAPDH en AGS-EBV Células. (D) RT-PCR se realizó para analizar el nivel de ARNm de GKN1 o GKN2 en AGS (barras azules) o células AGS-EBV (barras rojas). ** Indica p < .005. Las barras de error indican la desviación estándar de la media (MDF) para n = 3.
VEB aumenta la represión dependiente de la metilación del ADN de GKN1 y GKN2 ARNm en las líneas celulares GC
GKN1 y GKN2 pueden estar sujetos a la supresión epigenética en GC y el tejido líneas celulares de cultivo. Para explorar esta posibilidad, hemos probado si el tratamiento con desmetilación del ADN agente 5 'azacitidina (AZA) o agente deacetylating (NAB) en combinación con éster de forbol (TPA) activaría GKN1 o GKN2 en células AGS (Figura 5A). Se encontró que el tratamiento Aza condujo a un aumento pliegue ~ 10 en GKN2, y ~ 4 veces mayor en la transcripción en GKN1 AGS células tratadas. En contraste, el tratamiento NaB /TPA produce sólo ~ 2 veces la activación de la transcripción. Estos resultados sugieren que tanto GKN1 y GKN1 están bajo represión epigenética activo a través de la metilación del ADN. Para probar si el EBV tuvo ningún efecto sobre la activación inducida Aza de GKN1 o GKN2, se compararon los efectos del tratamiento sobre Aza AGS relación con las células AGS-EBV por QRT-PCR (Figura 5B). Se encontró que GKN1 y GKN2 se activaron de manera eficiente mediante el tratamiento Aza en células AGS, pero en menor medida en AGS-EBV. En estos experimentos, la activación inducida por Aza de GKN2 se eliminó por completo, mientras que la activación de GKN1 era sólo parcialmente atenuada. Aza-tratamiento también condujo al aumento pliegue ~ 8.4 en los niveles de ARNm de EBNA1, lo que sugiere que el tratamiento aza estimula la expresión de genes VEB lítico en líneas de células AGS-EBV. Estos resultados sugieren que los productos del gen EBV prevenir GKN2, y para una activación GKN1 menor medida después del tratamiento Aza. Figura 5 EBV refuerza la represión de la expresión génica y GKN1 GKN2 por la metilación del ADN. células AGS (A) se trataron con 10 mM Aza, o NaB 1 mM y 20 ng /ml de TPA durante 48 horas y se analizaron por RT-PCR para GKN1 o nivel de expresión GKN2, en comparación con AGS no tratados. (B) células AGS o células AGS-EBV fueron tratados o no tratados con 10 mM Aza durante 48 horas, luego ensayadas para GKN1, mRNA GKN2, o los niveles de ARNm de EBNA1. (C) MeDIP ensayo de AGS o células AGS-EBV tratadas o no tratadas con 10 mM Aza durante 48 horas en diferentes regiones de ADN de GKN1 y GKN2 loci. (D) MeDIP ensayo de células AGS o AGS-EBV no tratados o tratados con 10 mM Aza durante 48 horas a regiones celulares de globina alfa-2, GAPDH, CDC7, FOXP2, HDAC3, o MAP3KIP2. (E) Genoma posición de los cebadores utilizados para los ensayos de GKN1-GKN2 chip y MeDIP. * Indica p < 0,05, ** indica p < .005. Las barras de error indican SDM para n = 3.
Para comprender mejor el mecanismo de la represión GKN1 y GKN2 epigenética, se examinaron los niveles de metilación del ADN utilizando ensayo de metil-citosina específica anticuerpo dirigido inmunoprecipitación de ADN (MeDIP). Analizamos el enriquecimiento de ADN metilado en la región de control GKN1-GKN2 en células AGS y AGS-EBV con o sin tratamiento Aza (Figura 5C). Se observó un enriquecimiento relativo de CpG metilado en una región entre el sitio de unión a EBNA1 y el sitio de inicio de transcripción GKN2 (GKN2_A). tratamiento Aza condujo a una disminución de la señal MeDIP en la mayoría de regiones en las que se detecta una señal, lo que sugiere que el tratamiento Aza condujo a una reducción general de la metilación del ADN. se observó pérdida similar de metilación de CpG en el gen de alfa-globina (que no se une EBNA1), y en varios sitios de unión a EBNA1, incluyendo HDAC3 y MAP3K7IP (Figura 5D). Hemos observado también que las señales MeDIP eran generalmente más alta en EBV-AGS que en las células AGS, lo que sugiere que la infección latente de EBV puede promover o estabilizar la metilación del ADN en todo el genoma del huésped.
agotamiento EBNA1 activa la expresión GNK1 y GKN2 mRNA en las células epiteliales positivas EBV
para determinar si EBNA1 contribuyó a la represión transcripcional de GKN1 y GKN2, primero tratamos de agotar EBNA1 en las células AGS-EBV utilizando siRNA (Figura 6). Hemos generado un siRNA dirigidos a la 3 'UTR no codificante de mRNA EBNA1, que parcialmente agotada proteína EBNA1 en las células AGS-EBV (Figura 6B). El agotamiento de EBNA1 resultó en un ~ 5 veces de la activación GKN2, con poca activación detectable de GKN1 (Figura 6A). Estos hallazgos sugieren que EBNA1 puede funcionar como un represor transcripcional de GKN2 en células AGS-EBV. Figura 6 agotamiento de siRNA de EBNA1 causa de la represión de la GKN1 y GKN2 en células AGS-EBV. siCtrl o siEBNA1 transfectaron células AGS-EBV se ensayaron por RT-PCR para GKN1 o ARNm GKN2 nivel relativo a GAPDH celular (A). Las células se recogieron a las 72 horas después de la transfección con siRNA. blot mostrando EBNA1 Western (panel superior) y control de carga actina (panel inferior) en las células AGS-EBV (B). Las barras de error indican la desviación estándar de la media (MDF) para n = 3.
EBNA1 inhibe GKN1 y GKN2 la transcripción después de la desmetilación del ADN
Para explorar más a fondo la contribución de EBNA1 de regulación de la transcripción y GKN1 GKN2, hemos probado el efecto de la expresión ectópica de EBNA1 solo en niveles inducidos-Aza de GKN1 o GKN2 la transcripción en células de GC. células AGS fueron transducidas con un lentivirus que expresan EBNA1. Estable AGS-EBNA1 (PLU-EBNA1) o líneas celulares AGS- vector de control (PLU-Vec) fueron seleccionados y se analizaron para los niveles de ARNm y GKN1 GKN2. Hemos observado que las células AGS-EBNA1 tenían un 2-3 ~ veces mayor nivel basal de GKN1 y mRNA GKN2 relación con las células AGS parentales (Figura 7A). los niveles de mRNA Sin embargo, inducidos por Aza de GKN1 y GKN2 se atenuaron en AGS-EBNA1 comparación con las células AGS (Figura 7B). tratamiento Aza también dio lugar a un gran aumento en los niveles de ARNm de EBNA1 (Figura 7C). Para determinar si los efectos de EBNA1 en GKN1 y GKN2 eran específicos de células AGS, transduced otra línea celular GC negativo VEB EBNA1 MKN74 con lentivirus (Figura 7D-F). De manera similar a las células AGS, encontramos que EBNA1 aumentó los niveles basales de GKN1 y GKN2, pero inhibe la capacidad de Aza para inducir aún más los niveles de ARNm y GKN1 GKN2 (Figura 7D y E). Se confirmó que Aza-tratamiento fue eficaz mediante la medición de los niveles de ARNm de EBNA1, que aumentaron ~ 7 veces (Figura 7F). Estos hallazgos sugieren que la expresión ectópica de EBNA1 puede aumentar basal, pero inhibir niveles inducidos-Aza de GKN1 y GKN2 transcripción en líneas celulares EBV GC negativo. Figura 7 EBNA1 inhibe GKN1 y GKN2 la transcripción después de la desmetilación del ADN en las células de GC. células AGS (A) fueron transducidas con PLU-vectorial (Vec) o PLU-EBNA1 y luego tratar (Untr) o tratadas con 10 mM 5'-azacitidina (AZA) durante 48 horas. GKN1 y el ARNm se cuantificaron por GKN2 QRT-PCR con respecto a GAPDH. (B) Doblar la inducción del ARNm y GKN1 GKN2 por Aza se cuantificaron a partir del panel A. (C) QRT-PCR análisis de los niveles de ARNm de EBNA1 en células AGS. (D) Igual que en A, excepto por el uso MKN74 en lugar de células AGS. (E) Doblar la inducción del ARNm y GKN1 GKN2 cuantificados desde el panel de análisis D. (F) QRT-PCR de los niveles de mRNA en células EBNA1 MKN74. * Indica p < 0,05, ** indica p < .005. Las barras de error indican SDM para n = 3. Discusión

En este estudio, hemos identificado un sitio de unión de alta ocupación en la región EBNA1 el control del promotor 5 'de los genes GKN1 y GKN2 divergente transcritas. No se observaron sitios de unión a EBNA1 en dos conjuntos de datos ChIP-Seq independientes de EBV células linfoides positivas BL Raji y EBV positivo células de carcinoma nasofaríngeo epiteliales C666-1 (Figura 1A). Se confirmó estos sitios de unión convencional de chip-qPCR en ambas líneas celulares (Figura 1B y C). EBNA1 También se demostró que directamente en esos sitios por EMSA con purificado proteínas recombinantes EBNA1 DBD (Figura 1D). Se demuestra que los niveles de ARNm y GKN1 GKN2 son muy reprimidas en la mayoría de las líneas celulares en relación con el tejido gástrico primario (Figura 2). Para estudiar el papel potencial de EBV EBNA1 y en el control transcripcional de GKN1 y GKN2, hemos generado una línea celular de carcinoma de EBV positivo AGS gástrico. Se demuestra que EBV adopta un tipo de variante I latencia patrón en células AGS (Figura 3), y que EBNA1 se puede unir a la región promotora GKN1 /GKN2 en el cromosoma celular (Figura 4C). También se encontró que GKN1 y mRNA GKN2 se suprimieron más en EBV células AGS positivos en relación con las células de control AGS negativas EBV (Figura 4D). A continuación, mostró que Aza-tratamiento condujo al aumento de expresión de GKN1 y GKN2 (Figura 5A), y que la infección latente de EBV inhibe la activación de Aza GKN2 (Figura 5B). Se encontró que el siRNA agotamiento de EBNA1 en las células AGS positivas EBV conduce a la activación de la transcripción de GKN2 (Figura 6). También mostramos que la expresión ectópica EBNA1 aumenta moderadamente basales, pero inhibe los niveles inducidos-Aza de GKN1 y transcripción GKN2 (Figura 7). Tomados en conjunto, estos hallazgos indican que EBNA1 se une a la región de control del promotor GKN1-GKN2 en múltiples tipos de células, y plantean la posibilidad de que EBNA1 contribuye a la represión de la transcripción y epigenética de los genes supresores de tumores GKN1 y GKN2 en GC EBV positivo.
infección latente de EBV se sabe que aumenta el fenotipo tumorigénico de células de carcinoma gástrico [29-31]. GKN1 y GKN2 son reportados a funcionar como inhibidores del crecimiento celular y supresores de tumor en GC [20, 21, 23, 25-27]. Nuestros datos de expresión de ARNm que muestran la expresión de ARNm de alto nivel sólo en el tejido gástrica normal primaria son consistentes con un papel de GKN1 y GKN2 como un supresor de tumores. Sin embargo, no hemos podido demostrar que la sobre expresión de uno o ambos GKN1 o GKN2 en AGS o AGS-VEB causa una detención del ciclo celular o reducir la viabilidad (datos no mostrados). Esto sugiere que la función GKN1 y GKN2 en las primeras etapas de la evolución de las células tumorales, o en microambientes tumorales más complejos. Especulamos que EBNA1 puede tener un efecto más pronunciado sobre la expresión GKN1 y GKN2 en situaciones en las EBV puede infectar células gástricas primarias donde la expresión basal de GKN1 y GKN2 son altos y importante para la supresión de tumores.
Estudios publicados previos han demostrado que GKN1 y GKN2 transcripción está sujeta a la supresión epigenética por metilación del ADN en todas las formas de GC [21]. Nuestros estudios son consistentes con el papel de la metilación del ADN en la supresión epigenética de GKN1 y GKN2 en las células AGS. El tratamiento con Aza resultó en el aumento de 4-10 veces en la expresión GKN1 y GKN2 mRNA (Figura 5A), y MeDIP reveló enriquecimiento de ADN metilado en las regiones promotoras (Figura 5C). células AGS-EBV sí mostraron un aumento de la metilación del ADN en varios sitios celulares, incluyendo las regiones alrededor de los sitios en la región promotora GKN1 (Figura 5C) de unión a EBNA1, y los genes y HDAC3 map3k7ip2 (Figura 5D). Sin embargo, la presencia de EBNA1 en las células AGS-EBV no impidió desmetilación Aza-inducida en estos sitios. Esto sugiere que EBNA1 puede reprimir la transcripción de algunos promotores, como GKN2, a través de un mecanismo distinto de la metilación del ADN. Sin embargo, la expresión ectópica de EBNA1 sola produjo un fenotipo más complicado, haciendo que un pequeño aumento de la expresión basal, pero limitar los efectos de desmetilación inducida por Aza (Figura 7). Esto puede sugerir que EBNA1 que puede funcionar de manera diferente cuando se expresa ectópicamente, que cuando se expresa en el contexto del genoma viral. Sin embargo, nuestros hallazgos sugieren que EBNA1 perturba la regulación transcripcional de los genes normales y GKN1 GKN2.
La función precisa de EBNA1 en la regulación de la transcripción sigue siendo poco clara. EBNA1 se ha implicado en la activación de la transcripción y la represión de los genes virales y celulares [32, 33]. EBNA1 puede reprimir su propia expresión mRNA de la EBV Qp en el tipo III de latencia, donde la represión se ha relacionado con la interferencia estérica con la RNA polimerasa II de unión al sitio de iniciación de la transcripción [34]. Por otro lado, EBNA1 puede activar Cp y LMP1 promotores en el tipo III de latencia en el que puede funcionar como un factor potenciador-como [35-37]. EBNA1 se ha implicado en la activación de la transcripción de algunos genes celulares, incluyendo el gen Nox2 involucrado en la formación de especies reactivas de oxígeno [19]. EBNA1 también puede afectar a la transcripción de la célula huésped a través de una remodelación global del cromosoma huésped [38]. De este modo, EBNA1 puede alterar la transcripción celular a través de múltiples mecanismos directos e indirectos.
Modificaciones epigenéticas se sabe que juegan un papel importante en el carcinoma gástrico asociado al EBV [39]. Curiosamente, las células AGS que llevan genomas EBV bácmido tenían niveles más altos de ADN metilado en muchos sitios de prueba (Figura 5D). Esto es consistente con la función propuesta de EBV en la metilación de genes supresores de tumores host [40]. Esto también es consistente con los hallazgos de que el VEB GC positivo ha elevado la metilación del ADN en regiones promotoras de varios supresores tumorales clave GC, incluidos los genes gastrokine [39, 41-45]. Mientras EBNA1 unido cerca de las regiones de ADN metilado del GKN2, no hemos podido demostrar que EBNA1 modula la metilación del ADN en los sitios GKN1 y GKN2 (datos no mostrados). Sin embargo, es posible que EBNA1 en asociación con otro factor codificada o inducida viral puede estabilizar GKN1 y GKN2 la represión transcripcional a través de un mecanismo dependiente de la cromatina y estructural que refuerza la metilación del ADN. También es posible que EBNA1 puede regular GKN1 o GNK2 sólo en microambientes de tejido o tumor que no se recapitulan fácilmente en cultivo celular. Mientras que la función de unión para alojar sitios cromosoma de la célula EBNA1 sigue siendo un área importante de investigación, modelos de infección más sofisticados pueden ser necesarios para dilucidar su posible papel en la alteración de la expresión de genes de la célula huésped y la carcinogénesis.
Métodos
Células, plásmidos, y la infección por lentivirus
células Raji del linfoma de Burkitt, células C666-1 EBV carcinoma nasofaríngeo positivo EBV positivo, y las líneas celulares de carcinoma gástrico (un regalo del doctor Antonia R. Sepúlveda, Universidad de Columbia), incluyendo GTL, MKN28, MKN74, SNU638 se mantuvieron en RPMI que contiene 10% de FBS y suplementado con antibióticos (penicilina y estreptomicina). células de carcinoma gástrico AGS (ATCC No. CRL-1739) se mantuvieron en F-12K que contiene 10% de FBS. células epiteliales bucales primaria fueron proporcionados por el Dr. Manjunatha Benakanakere, Universidad de Pennsylvania y se cultivaron en medio de queratinocitos-SFM. EBV-LCL fue establecido por la infección primaria de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con viriones EBV BAC generados a partir de células estimuladas 293-EBV [46, 47]. EBV-LCL contiene un EBV resistente bácmido se mantuvieron en RPMI que contiene 10% de FBS, higromicina B (100 mg /ml), glutamax (Invitrogen), y los antibióticos higromicina B. células AGS-EBV se generaron a partir de células AGS co-cultivadas con EBV-LCL mediante la adaptación de un método descrito infección células AGS co-cultivo previamente publicado con rEBV a través del contacto de célula a célula [48] con algunas modificaciones. Brevemente, EBV-LCL fue inducida por 20 ng /ml 12-O
-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) y butirato de sodio 1 mM (NAB) 24 horas antes de co-cultivo. Las células EBV-LCL inducidos se lavaron con PBS dos veces para eliminar por completo los agentes inductores, se resuspendieron con medio completo RPMI en 10 6 células /ml antes de la co-incubación. células AGS se sembraron en placas de 6 pocillos 24 horas antes de co-cultivo, a continuación, 60 a 70% de células AGS confluentes en 1 ml de medio completo F-12K se incubaron con 10 6 células EBV-LCL inducidos y se lavaron en 1 ml RPMI completo. 24 horas más tarde, se añadieron 2 ml de medio libre de suero F-12K a cada pocillo para reducir la concentración de FBS al 5% para evitar el crecimiento excesivo de células. 3 días después de co-incubación, las células EBV-LCL se retiraron de los co-cultivos y las células AGS se lavaron a fondo con PBS al menos 5 veces para eliminar cualquiera de los donantes de células EBV-LCL. Después, las células AGS infectadas se incubaron con medio F-12K fresco con 10% de FBS y 100 mg /ml de higromicina B y el medio de selección se cambió cada 2 a 3 días hasta que las células AGS infectados formadas colonias de selección Hyg B con expresión de GFP (por lo general 3 a 4 semanas después del co-cultivo). Las colonias de selección fueron reunidas después y se ensayaron para la expresión EBNA1 y el número de copias del genoma EBV antes sujetos a experimentos. Se mantuvieron las células AGS-EBV en medio F-12K con 10% de FBS y 100 mg /ml de higromicina B.
vector de expresión PLU-EBNA1 Lentivirus se construyó mediante amplificación por PCR de EBNA1 con cebadores (GCGGGATCCTCTGACGAGGGGCCAGGTACAGGACCT y ATCGTCGACTCACTCCTGCCCTTCCTCACCCTCATC) la introducción de un 5 ' BamH I y 3 'Sal I sitio de clonado en el marco de plu-CTVM-fmcs-pPURO. células AGS o MKN74 fueron infectadas con lentivirus que expresan PLU-EBNA1 o PLU vector de control generada recién a partir de células 293T. AGS infectadas o células MKN74 fueron seleccionados con 2,5 mg /ml de puromicina durante 10 a 14 días. Las células seleccionadas se combinaron y se trataron con o sin 5'-azacitidina durante 48 horas después se sometieron a RT-PCR.
SiRNA contra EBNA1 y Control de siRNA (Cat. No. D-001810-01-20) fueron todos adquiridos de Dharmacon. siRNA dirigido contra EBNA1 3'UTR se sintetizaron utilizando la secuencia diana CGGAGAUGACGGAGAUGAAUU. La transfección de ARNsi dúplex se llevó a cabo mediante el uso de Oligofectamine (Dharmacon), siguiendo las especificaciones del fabricante.
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) ensayos
Chip ensayos se realizaron como se describe anteriormente [49]. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

• perfil de expresión de ARN no codificante de largo en el cáncer gástrico humano y su no codificante perfil clínico a largo significances
• Análisis in silico de carcinoma gástrico serie Análisis de las bibliotecas de expresión genética revela distintos perfiles asociados a ethnicity