EBNA1 viazanie a epigenetické regulácia gastrokine nádorových supresorových génov u karcinómu žalúdka cells

EBNA1 záväzný a epigenetické regulácia gastrokine nádorových supresorových génov v bunkách karcinómu žalúdka
abstraktné
pozadia
Epstein-Barrovej (EBV) latentne infikuje ~ 10 % žalúdočných karcinómov (GC). Epstein-Barr jadrový antigén 1 (EBNA1) je vyjadrený v EBV-súvisiace GC, a môže viazať hostiteľskú DNA, kde to môže mať vplyv na bunkovú reguláciu génu. Tu ukazujeme, že EBNA1 sa viaže priamo na DNA proti prúdu z odlišne transkribovaných nádorových supresorových génov GC-špecifické gastrokine 1 (GKN1) a gastrokine 2 (GKN2).
Metódy
Používame chip-Seq, čipových-qPCR experimentu, a EMSA preukázať, že EBNA1 sa viaže priamo na GKN1 a GKN2 promótorom lokuse. Generujeme AGS-EBV, a AGS-EBNA1 bunkových línií na štúdium účinkov EBNA1 na GKN1 a GKN2 mRNA s alebo bez 5 'azacytidine liečby.
Výsledky
Ukázali sme, že gastrokine gény sú transkripčný umlčané podľa metylácie DNA , Tiež sme ukázať, že latentná EBV infekcia ďalej znižuje GKN1 a GKN2 expresiu v AGS buniek karcinómu žalúdka, a že siRNA vyčerpania EBNA1 čiastočne zmierňuje túto represiu. Avšak, ektopická expresia EBNA1 mierne zvýšenej GKN1 a GKN2 bazálnej mRNA úrovne, ale zníženie ich reakcie na demethylačním agent.
Závery
Tieto zistenia ukazujú, že EBNA1 sa viaže na divergentné promótor génov GKN1 a GKN2 v GC buniek, a naznačujú, že EBNA1 prispieva ku komplexnej transkripciu a epigenetické deregulácii tumor supresorových génov GKN1 a GKN2 v EBV pozitívne GC.
Kľúčové
EBV EBNA1 karcinóm žalúdka Gastrokine Chip-Seq epigenetické Úvod
vírus Epstein-Barrovej ( EBV) je ľudský gammaherpesvirus nájsť v celej rade lymfoidné a epiteliálnych bunkových malignít vrátane Burkittovho lymfómu, Hodgkinovej choroby, nazofaryngálne karcinóm (NPC), a po transplantácii lymfoproliferatívne ochorenia (prehľad pozri [1, 2]). V poslednej dobe, EBV bola nájdená v ~ 10% všetkých prípadov karcinómu žalúdka (GC) po celom svete [3, 4]. EBV-súvisiace GC bolo preukázané, že monoklonálne následok žalúdočných epiteliálnych buniek EBV-infikované a je považovaný za odlišný subtyp GC [5, 6]. Vzhľadom k tomu, výskyt GC sa nachádza v blízkosti 900.000 ľudí ročne [7], EBV-súvisiace GC môže byť medzi najčastejšie EBV-súvisiace rakoviny. Br &EBV pozitívne karcinomové bunky žalúdka, EBV zavádza typu Variant I latenciu, kde EBV transkripcie je obmedzená na kanonické typu I gény EBNA1, Ebers, BART rodina nekódujúca RNA a miRNA, ale s niektorými ďalšími expresie LMP2 [6, 8-11]. Medzi týmito gény latencie, EBNA1 je jediný vírusový jadrový proteín, ktorý je detekovaný v EBV-súvisiace GC. EBNA1 je pre vytvorenie latentného epizomální infekcie a pre dlhodobé prežitie latentne infikovaných buniek [12-15] potreby. EBNA1 je viažuci DNA proteín, ktorý sa viaže k obom vírusových a hostiteľských chromozomálnych miestach. Väzbové miesta v genóme vírusu boli charakterizované pre základné funkcie v replikáciu a transkripčný kontrolou expresie vírusového génu. Avšak funkcie EBNA1 sekvenčne špecifické väzby na hostiteľského chromozómu je menej dobre rozumie. Kým EBNA1 môže viazať na promotorové oblasti niekoľkých hostiteľských génov, zostáva nejasné, či sú tieto gény sú predmetom regulácie EBNA1 [12, 16, 17]. Nadmerná expresia väzbovú doménu EBNA1 DNA, ktorá pôsobí ako dominantný negatívny v bunkách infikovaných EBV, môže inhibovať životaschopnosť buniek v neinfikovaných buniek, čo naznačuje, že sa viaže na EBNA1 a reguluje bunkových génov dôležitých pre prežívanie buniek [18]. Ektopická expresia z EBNA1 bolo preukázané, že vplyv expresie mRNA buniek hostiteľa [19], ale nie je jasné, či tieto účinky sú priame alebo nepriamo v spojení s špecifických miest väzby EBNA1 v bunkového genómu.
V predchádzajúcej štúdii sme použili chip-nasl metódy na analýzu genómu-široký obohacovanie miest EBNA1 v latentne infikovaných buniek lymfómu Raji Burkitt a našiel rad bunkových lokalít viazané EBNA1 [17]. Medzi týmito EBNA1 bunkový pre obohacovanie miestach sme identifikovali významnú väzbu EBNA1 vrchol sa nachádza na gastrokine 1 (GKN1) a gastrokine 2 (GKN2, tiež známy ako faktor trojlístka interakciu (TFIZ1) proteín) zhluk génov. GKN1 a GKN2 boli identifikované na základe ich časté strate expresie v nádorových karcinóm epitelových buniek žalúdka, v porovnaní s normálnou žalúdočnej tkanive [20-22] (prehľad [23]). Niekoľko nedávnych štúdií opísalo antiproliferatívne a anti-invazívnej aktivitu GKN1 v žalúdočných epiteliálnych buniek, ktoré, spolu s jeho časté strate expresie pri rakovine, naznačuje, že funguje ako nádorový supresor špecifické pre žalúdočné epitel [21, 24-28]. GKN1 môže inhibovať migráciu a inváziu buniek pri hojení rán, transwell a Matrigel testu, rovnako ako sa zmeniť bunkových markerov spojených s epiteliálne-mezenchýmových prechodu [26]. GKN1 a GKN2 gény sú umiestnené v tesnej blízkosti a prepísaný v opačných smeroch, čo naznačuje, že pravdepodobne zdieľať obojsmerný promótor, a sú predmetom koordinovať regulácia prostredníctvom regulačných faktorov zdieľanej transkripcie (zhrnuté v [23]). V tomto
štúdie, my dokázaná priama väzba medzi EBNA1 a GKN1-GKN2 loci a vyšetroval GKN1 a GKN2 génovej expresie modulácie EBV infekcie a proteínu EBNA1. Naše zistenia naznačujú, že EBV infekcia môže ďalej brániť GKN1 a GKN2 výraz, a že strata EBNA1 môže uľahčiť epigenetické de-represie GKN2 transkripcie. Pozorovali sme tiež zvýšenú hladinu metylácie DNA v GKN1 a GKN2 promotorových oblastí a potenciálnej úlohe EBNA1 v deregulácii a epigenetické represie tohto nádorového supresor lokuse.
Výsledky
Identifikácia vysoko obsadenie EBNA1 väzobné miesto na GKN1 -GKN2 locus by chip-Seq
Skôr zverejnenej chip-Seq dáta z Raji BL buniek odhalilo obmedzený počet vysoko obohateného EBNA1 väzobných miest založených na špičke skóre a čítať čísla [17]. Ďalej prehliadka odhalila silnú EBNA1 väzobné miesto umiestnené pred štartovej miest pre odlišne prepísaných GKN1 a GKN2 génov (Obr 1A, horná stopa). Podobný EBNA1 väzby pík bol pozorovaný v samostatnej čipovej Seq experimentu vykonaného v EBV pozitívne, nazofaryngálne karcinóm línie C666-1 (plné triesok nasledujúce údaje boli zverejnené na inom mieste), čo ukazuje, že táto väzba dochádza v epitelu, ako aj lymfatické typy buniek (obrázok 1A, dolné dráhy). Stred vrchole sa nachádzala ~ 5 KB z GKN2 a ~ 15 kB zo štartovacích miest GKN1 transkripcie. Chip-qPCR bola použitá na overenie EBNA1 väzby v promotorové oblasti GKN1-GKN2 ako Raji a C666-1 bunkách (Obrázok 1B a C). qPCR ukázali, že EBNA1 viazaný na mieste GKN1-2 s podobnou účinnosťou k vopred potvrdených EBNA1-väzobné miesto na promótor PITPNB. qPCR tiež uvedené, že EBNA1 väzbu na GKN1-GKN2 bola špecifická, pretože neexistuje žiadny zistiteľný EBNA1 väzby buď v bunkovej GAPDH lokuse alebo kontrolných oblastí EBV OriLyt, ako sa očakávalo (obrázok 1B a C). Domnelý EBNA1 väzobné miesto na GKN1-GKN2 oku bol identifikovaný porovnaním s väzobné miesto konsenzu v rodine EBV opakovaní (FR) regiónu, a táto sekvencia potom bola testovaná na priame väzby na EBNA1 EMSA (obrázok 1D). Vyčistený rekombinantný EBNA1 DBD proteín bol testovaný na väzbu na sond, ktoré obsahujú namiesto GKN1-GKN2 (GKN1 /2), Francúzsku alebo záporný sekvenčné riadenie chýba väzobné miesto konsenzus EBNA1. Zistili sme, že EBNA1 DBD viazaný účinne na miesto GKN1-GKN2, ako aj FR konsenzu, ale neviaže na kontrolné sekvenciu. Tieto zistenia naznačujú, že interaguje s EBNA1 GKN1-GKN2 promotorové oblasti prostredníctvom priameho DNA-väzbové s EBNA1 DBD. Obrázok 1 EBNA1 sa viaže na GKN1 a GKN2 promótorom lokuse. (A) UCSC genóm prehliadač bola použitá na mapovanie EBNA1 záväzný vrchol vyrobené z Raji a C666-1 chip-nasl v géne loci GKN1 a GKN2. RefSeq komentovaný prepisy sú uvedené nižšie na čipovej Seq vrchole. (BC) Realtime-PCR validácia dát čipovej nasl pre EBNA1 väzbového miesta na GKN1 /2 Spoločné promotorové oblasti: EBNA1 (červené stĺpce) alebo kontrolným IgG (modré pruhy) boli testované čipom v Raji (B) alebo C666-1 bunky (C) pre viažuci DNA v /2 miesta GKN1, PITPNB promótor, GAPDH alebo EBV Ori-Lyt. (D) EMSA analýza 32P značené sondy, ktoré obsahujú Control, /site GKN1 2 alebo EBV FR. Rôzne množstvo EBNA1 DBD proteín bol použitý vo väzobnej reakcie (0, 100, 300, 900 ng). Šípky predstavujú EBNA1 špecifické viazané komplexy alebo voľný sondu, ako je uvedené. Sekvencie sondy GKN1 /2 mieste a FR je indikovaná sekvencia homológov (červenými písmenami) medzi GKN1 /2 a FR. Negatívna kontrola (CTRL) sekvencie je tiež uvedená. Čiarky označujúce chyby znamenajú štandardná odchýlka od strednej hodnoty (SDM) pre n = 3.
GKN1 a GKN2 mRNA je vysoko exprimovaný v primárnej žalúdočnej tkanive
Ďalej sme merali hladiny GKN1 alebo GKN2 mRNA v rôznych rakovina žalúdka bunkové línie a primárne normálne žalúdočné tkaniva pomocou QRT-PCR (obrázok 2). Zistili sme, že GKN1 a GKN2 sú vyjadrené na oveľa vyššej úrovni (~ 3 x 10 4 krát) v primárnom žalúdočnej tkanive ako v niektorej z testovaných bunkových líniách (obrázok 2A). Aj keď na oveľa nižšej úrovni ako primárne žalúdočné tkaniva, GKN1 a GKN2 boli obaja vyjadrené v merateľných koncentráciách v AGS karcinómu bunkových línií žalúdka, s GKN2 vyjadrené na vyššej úrovni, než všetky ostatné GC bunkových línií, alebo EBV pozitívne, B-bunky alebo bunkové línie NPC ( obrázok 2B). by mohli byť zistené veľmi nízkej úrovne GKN1 alebo GKN2 v primárnom orálny epitelové tkanivá, ďalej ukazuje, že tieto gény sú špecifické pre primárne žalúdočné tkaniva. Obrázok 2 GKN1 a GKN2 mRNA je vysoko exprimovaný v primárnej žalúdočnej tkanive. RT-PCR bola vykonaná analýza hladiny mRNA GKN1 (modré stĺpce) alebo GKN2 (červená barov) v rôznych bunkových líniách vrátane GC odvodené od GTL, MKN28, MKN74, SNU638, AGS, BL-odvodený Raji, EBV zvečnenie LCL EBV pozitívne NPC linka C666-1, alebo primárne ústach epitelové bunky v porovnaní s (a) alebo (B), bez toho, aby primárne žalúdočné tkaniva. Čiarky označujúce chyby znamenajú štandardná odchýlka od strednej hodnoty (SDM) pre n = 3.
EBV latencia znižuje expresiu GKN1 a GKN2 mRNA v bunkových líniách GC
Pre testovanie účinku EBV latentnej infekcie GKN1 a GKN2 výrazu, sme vytvorili bunka línia AGS obsahujúce EBV B95.8 bacmid. Bunková línia AGS bol vybraný pre rezistenciu k hygromycinu a GFP positivity, aby sa zabezpečilo, že obsahoval bacmid komponenty. Charakterizovať bunkové línie AGS-EBV, najprv analyzovali EBV génu exprimovaného vzorca (obrázok 3). Zistili sme, že AGS-EBV bunky exprimovali detekovateľné hladiny mRNA EBNA1, BARF0 a LMP2, ale nie LMP1, EBNA2, alebo EBNA3C (obrázok 3). Aj keď EBV B95.8 bacmid postráda Bart miRNA, tieto zistenia sú v súlade s AGS-EBV bunky prijíma typu Variant I latencie génovú expresiu program s nejakým výrazom LMP2, podobne ako u EBV pozitívne rakovina žalúdka nádorového tkaniva [8, 10 ]. Pre ďalšie charakterizáciu AGS-EBV bunky sme analyzovali expresiu proteínu EBNA1 metódou Western blot (obrázok 4A) a EBV DNA kopírovať číslo qPCR (obrázok 4B). EBNA1 bol detekovaný ako jediný druh v malom množstve na očakávané molekulovej hmotnosti (obr 4A). počet kópií EBV bola merať porovnávaním EBV Ori-Lyt DNA do bunkovej GAPDH (obrázok 4B). Zistili sme, že AGS-EBV obsahovala ~ 50% menej kópií vírusového genómu v porovnaní s EBV pozitívne LCLs. Ak chcete zistiť, či EBNA1 udržal jeho väzbovú aktivitu DNA v AGS-EBV, sme vykonali konvenčné čip testy (Obrázok 4C). Zistili sme, že EBNA1 viazaný na EBV dyády Symmetry (DS) DNA, ako aj na väzobné miesto GKN1-GKN2 v AGS-EBV buniek. Ďalej sme vyzvaní, či boli hladiny GKN1 alebo GKN2 mRNA ovplyvnený EBV latentnej infekcii v bunkách AGS porovnaním úrovne expresie RT-qPCR v AGS vzhľadom k AGS-EBV bunkách (Obrázok 4D). Zistili sme, že GKN1 a GKN2 boli potlačené natoľko ~ 3-8 krát v AGS-EBV vzhľadom k AGS buniek, čo naznačuje, že EBV latencia propaguje či stabilizuje transkripčný represiu GKN1 a GKN2. Obrázok 3 Charakterizácia génovej expresie EBV v bunkových líniách AGS-EBV. AGS, AGS-EBV pozitívne, a EBV-LCLs boli testované na expresiu mRNA pomocou QRT-PCR s priméry pre EBNA1, BARF0, LMP2, LMP1, EBNA2, alebo EBNA3C, ako je uvedené. Čiarky označujúce chyby znamenajú štandardná odchýlka od strednej hodnoty (SDM) pre n = 3.
Obrázok 4 EBV infekciu AGS buniek potláča GKN1 a GKN2 transkripciu. (A) Analýza Western blot expresie EBNA1 proteínu v AGS-EBV buniek v porovnaní s EBV-negatívne AGS buniek bola vykonávaná s použitím protilátky k EBNA1 (hore) alebo Actin (dole). číslo (B) DNA kópie bola testovaná pomocou real-time PCR z EBV Ori-Lyt DNA vo vzťahu k úrovni bunkovej GAPDH v AGS, AGS-EBV a EBV-LCL buniek. (C) Chip a real-time PCR analýzy EBNA1 (červené pruhy) alebo kontrolným IgG (modré pruhy) pre DNA viažuci sa na EBV miest, vrátane DS a Ori-Lyt alebo jemu miest, vrátane GKN1 /2 a GAPDH v AGS-EBV buniek. (D) RT-PCR bola vykonaná analýza hladiny mRNA GKN1 alebo GKN2 v AGS (modré pruhy) alebo AGS-EBV bunky (červené stĺpce). ** Znamená p lt; 0,005. Chybové úsečky ukazujú štandardnú odchýlku od priemeru (SDM) pre n = 3.
EBV zvyšuje metylácie DNA závislú na represiu GKN1 a GKN2 mRNA v bunkových líniách GC
GKN1 a GKN2 môžu byť predmetom epigenetické potlačenie v GC a tkanív kultúre bunkových línií. Ak chcete preskúmať túto možnosť, sme testovali, či je liečba s DNA demethylačním agenta 5 'azacytidin (AZA) alebo deacylaci činidlo (NAB) v kombinácii s forbolesterem (TPA) by aktivovala GKN1 alebo GKN2 v AGS bunkách (Obrázok 5A). Zistili sme, že liečba Aza viedlo k ~ 10 násobný nárast GKN2 a ~ 4-násobné zvýšenie GKN1 transkripciu v AGS ošetrené bunky. Na rozdiel od toho liečba NAB /TPA vyrába iba ~ 2 násobné aktiváciu transkripcie. Tieto zistenia naznačujú, že ako GKN1 a GKN1 sú aktívne epigenetické represie prostredníctvom metylácie DNA. Ak chcete otestovať, či EBV mal nejaký vplyv na Aza indukovanú aktiváciu GKN1 alebo GKN2 sme porovnávali účinky liečby Aza na AGS vzhľadom k AGS-EBV buniek QRT-PCR (obrázok 5B). Zistili sme, že GKN1 a GKN2 boli účinne aktivuje spracovaním Aza v AGS bunkách, ale v menšej miere v AGS-EBV. V týchto experimentoch, Aza-indukovaná aktivácia GKN2 sa úplne odstránila, zatiaľ čo aktivácia GKN1 bola len čiastočne zoslabené. Aza-ošetrenie tiež viedlo k ~ 8,4 násobné zvýšenie hladín EBNA1 mRNA, čo naznačuje, že liečba aza stimuluje EBV lytickú génovej expresie v bunkových líniách AGS-EBV. Tieto výsledky naznačujú, že EBV génové produkty predchádzať GKN2, a v menšej miere aktivácie GKN1 po liečbe Aza. Obrázok 5 EBV posilňuje represiu génovej expresie GKN1 a GKN2 od metylácie DNA. (A) AGS bunky boli ošetrené 10 uM Aza, alebo 1 mM NAB a 20 ng /ml TPA počas 48 hodín a analyzované pomocou RT-PCR pre GKN1 alebo úrovne expresie GKN2, v porovnaní s neliečenými AGS. (B) bunky alebo AGS AGS-EBV bunky boli ošetrené s alebo bez ošetrenia 10 uM Aza po dobu 48 hodín, potom sa testovali na GKN1, GKN2 mRNA alebo mRNA hladiny EBNA1. (C) MEDIPO test AGS alebo AGS-EBV bunkách ošetrených alebo neošetrených s 10 uM Aza po dobu 48 hodín pri rôznych oblastí DNA z GKN1 a GKN2 loci. (D) MEDIPO test AGS alebo AGS-EBV bunkách ošetrených alebo neošetrených s 10 uM Aza po dobu 48 hodín pri bunkovej regiónov pre alfa globínu-2, GAPDH, CDC7, Foxp2, HDAC3 alebo MAP3KIP2. (E) Genome pozíciám používaných pre GKN1-GKN2 čip a MEDIPO testy. * Označuje P < 0,05, ** znamená p lt; 0,005. Chybové úsečky uvedené SDM pre n = 3.
Pre lepšie pochopenie mechanizmu GKN1 a GKN2 epigenetické represie, sme skúmali hladinu metylácie DNA za použitia metyl-cytozín špecifická protilátka DNA Imunoprecipitácia (MEDIPO) testu. testovaná sme obohacovanie methylata DNA v kontrolnej oblasti GKN1-GKN2 v AGS a AGS-EBV buniek s alebo bez liečby Aza (obrázok 5C). Pozorovali sme relatívna obohatenie metylovaného CPG v oblasti medzi väzbového miesta EBNA1 a počiatku transkripcie GKN2 (GKN2_A). Liečba aza viedla k poklesu signálu MEDIPO vo väčšine regiónov, kde bol detekovaný signál, čo naznačuje, že liečba aza viedlo k všeobecnému zníženiu metylácie DNA. Podobne ako strata CPG metylácie bola pozorovaná pri génu alfa-globínu (ktorý neviaže EBNA1), a na niekoľkých väzba EBNA1 miest, vrátane HDAC3 a MAP3K7IP (obrázok 5D). Tiež poznamenať, že MEDIPO signály boli v EBV-AGS, vo všeobecnosti vyššie ako v AGS bunkách, čo naznačuje, že EBV latentnej infekcie môže podporovať alebo stabilizovať DNA metylácie v celom genóme hostiteľa.
Deplécia EBNA1 aktivuje expresiu GNK1 a GKN2 mRNA v EBV pozitívnych buniek epitelu
pre stanovenie, či EBNA1 prispel k transkripčný represiu GKN1 a GKN2, najprv pokúsili vyčerpať EBNA1 v AGS-EBV buniek s použitím siRNA (obrázok 6). sme dosiahli siRNA, ktoré cielia na 3 'nekódujúcej UTR EBNA1 mRNA, ktorá čiastočne vyčerpaného proteínu EBNA1 v AGS-EBV bunkách (Obrázok 6B). Vyčerpanie EBNA1 za následok ~ 5 násobné aktiváciu GKN2, s malou detekovateľné aktiváciou GKN1 (obrázok 6A). Tieto zistenia naznačujú, že EBNA1 môže fungovať ako transkripčný represor GKN2 v AGS-EBV buniek. Obrázok 6 siRNA vyčerpávanie EBNA1 spôsobuje de-represiu GKN1 a GKN2 v AGS-EBV buniek. siCtrl alebo siEBNA1 transfekovány AGS-EBV boli bunky testované pomocou RT-PCR na úrovni GKN1 alebo GKN2 mRNA v porovnaní s bunkovou GAPDH (A). Bunky boli zozbierané 72 hodín po transfekciu s siRNA. Western blot ukazuje EBNA1 (horný panel) a na kontrolu zaťaženia aktínu (dolný panel) v AGS-EBV buniek (B). Chybové úsečky ukazujú štandardnú odchýlku od priemeru (SDM) pre n = 3.
EBNA1 inhibuje GKN1 a GKN2 transkripciu po DNA demetylácia
cieľom ďalej preskúmať prínos EBNA1 na GKN1 a GKN2 reguláciu transkripcie, sme testovali vplyv ektopická expresia samotného EBNA1 na Aza-indukovaných úrovňou GKN1 alebo GKN2 transkripcie v GC buniek. AGS bunky boli transdukovány s EBNA1 exprimujúce lentivirus. Stabilné AGS-EBNA1 (plu-EBNA1) alebo AGS- vektorové riadenie (plu-Vec) bunkové línie boli vybrané a testované na úrovni GKN1 a GKN2 mRNA. Pozorovali sme, že AGS-EBNA1 bunky mal ~ 2-3 násobne vyššiu bazálnu hladiny GKN1 a GKN2 mRNA v porovnaní s rodičovským AGS buniek (obr 7a). Avšak, Aza-indukovanej hladiny mRNA GKN1 a GKN2 boli oslabené AGS-EBNA1 v porovnaní s AGS bunkami (obrázok 7b). Liečba Aza tiež viedlo k veľkému zvýšeniu hladiny EBNA1 mRNA (obr 7c). Pre stanovenie, či účinky EBNA1 na GKN1 a GKN2 boli špecifické pre AGS buniek, sme transdukovány ďalšie EBV negatívne GC bunkové línie MKN74 sa EBNA1 lentivirus (obrázok 7D-F). Podobne ako u AGS buniek, sme zistili, že EBNA1 zvýšenej bazálnej hladiny GKN1 a GKN2, ale inhibuje schopnosť Aza ďalej indukovať GKN1 a GKN2 mRNA hladiny (obr 7D a E). Potvrdilo sa, že Aza-liečba bola účinná meraním hladín EBNA1 mRNA, čo zvýšilo ~ 7 krát (obr 7F). Tieto zistenia naznačujú, že ektopická expresia EBNA1 môže zvýšiť bazálnu, ale inhibujú Aza-indukovanej úrovne GKN1 a GKN2 transkripcie v EBV-negatívne GC bunkových línií. Obrázok 7 EBNA1 inhibuje GKN1 a GKN2 transkripciu DNA po demetyláciu v GC buniek. (A) AGS bunky boli transdukovány PLU Vector (Vec) alebo PLU EBNA1 a potom neošetrené (Untr), alebo liečení 10 uM 5'-azacytidinu (AZA) po dobu 48 hodín. GKN1 a GKN2 mRNA boli kvantifikované pomocou QRT-PCR vo vzťahu k GAPDH. (B) ohýbanie indukcii GKN1 a GKN2 mRNA Aza boli kvantifikované z panelu A. (C) QRT-PCR analýza hladín EBNA1 mRNA v bunkách AGS. (D) Rovnaké ako v A, s výnimkou použitia MKN74 skôr ako AGS buniek. (E) ohýbanie indukcii GKN1 a GKN2 mRNA kvantifikovaná z panela D. (F) QRT-PCR analýza hladín EBNA1 mRNA v bunkách MKN74. * Označuje P < 0,05, ** znamená p lt; 0,005. Chybové úsečky uvedené SDM pre n = 3.
Diskusia
V tejto štúdii sme zistili väzobné miesto s vysokou obsadenosť EBNA1 na ovládacom promotorovou oblasť 5 'z odlišne transkribovaných GKN1 a GKN2 génov. EBNA1 väzbové miesta bola pozorovaná u dvoch nezávislých dátových sád čipov Seq z EBV pozitívne lymfatické BL buniek Raji a EBV pozitívne epitelu nosohltana bunky karcinómu C666-1 (obr 1A). Potvrdili sme tieto väzbové miesta konvenčné chip-qPCR v oboch bunkových líniách (obr 1B a C). EBNA1 bolo tiež preukázané, že sa viažu priamo s týmito zariadeniami podľa EMSA sa purifikovaný rekombinantný proteín EBNA1 DBD (obrázok 1D). Ukázali sme, že GKN1 a GKN2 mRNA úrovne sú veľmi potlačená vo väčšine bunkových línií v porovnaní s primárnou žalúdočné tkaniva (obrázok 2). Pre štúdium potenciálnu úlohu EBV EBNA1 a v transkripčný kontrolou GKN1 a GKN2, generované sme EBV pozitívne AGS karcinómu žalúdka bunkové línie. Ukázali sme, že EBV prijíma typu Variant I latencie vzor v AGS bunkách (obrázok 3), a že EBNA1 sa môže viazať na oblasti promotora GKN1 /GKN2 v bunkovej chromozóme (obrázok 4C). Tiež sme zistili, že GKN1 a GKN2 mRNA boli ďalej potlačené v EBV pozitívne AGS buniek v porovnaní s kontrolou EBV negatívne AGS buniek (Obrázok 4D). Potom sme ukázali, že Aza-liečba viedla k zvýšeniu expresie a GKN1 GKN2 (obrázok 5A), a že EBV latentnej infekcie inhibuje aktiváciu aza GKN2 (obrázok 5B). Zistili sme, že siRNA vyčerpávanie EBNA1 v EBV pozitívne AGS bunkách vedie k aktivácii transkripcie GKN2 (Obrázok 6). Tiež ukazujú, že EBNA1 ektopická expresia mierne zvyšuje bazálny, ale inhibuje Aza-indukovanej úrovne GKN1 a GKN2 transkripcie (Obrázok 7). Dohromady tieto výsledky naznačujú, že EBNA1 sa viaže na kontrolnej oblasti promotora GKN1-GKN2 v rôznych typoch buniek, a zvýšiť možnosť, že EBNA1 prispieva k transkripčný a epigenetické represie GKN1 a GKN2 tumor supresorových génov v EBV pozitívne GC.
EBV latentnej infekcie je známe, že zvyšuje tumorogénnu fenotyp buniek karcinómu žalúdka [29-31]. GKN1 a GKN2 sa uvádza, že fungujú ako inhibítory rastu buniek a nádorových supresor v GC [20, 21, 23, 25-27]. Naše expresie mRNA údaje ukazujúce expresiu mRNA na vysokej úrovni iba v primárnej normálnej žalúdočnej tkaniva sú v súlade s úlohou GKN1 a GKN2 ako nádorový supresor. Avšak sme neboli schopní preukázať, že zvýšená expresia jednej alebo oboch GKN1 alebo GKN2 v AGS alebo AGS-EBV spôsobujú zástavu bunkového cyklu alebo zníženie životaschopnosti (dáta nie sú uvedené). To naznačuje, že funkcia GKN1 a GKN2 v skorších fázach vývoja nádorových buniek, alebo v zložitejších nádorové mikroprostredie. Domnievame sa, že EBNA1 môže mať väčší vplyv na GKN1 a GKN2 prejavu v situáciách, keď sa môžu infikovať EBV primárna žalúdočných buniek, kde sú vysoké a dôležité pre potlačovanie nádorov bazálnu expresie GKN1 a GKN2.
Skôr publikované štúdie ukázali, že GKN1 a GKN2 transkripcie je predmetom epigenetické potlačenie metylácie DNA vo všetkých formách GC [21]. Naše štúdie sú v súlade s úlohou metylácie DNA v epigenetické potlačenie GKN1 a GKN2 v AGS bunkách. Liečba Aza malo za následok 4-10 násobné zvýšenie GKN1 a GKN2 expresie mRNA (Obrázok 5A) a MEDIPO odhalila obohatenie methylata DNA v promotorových oblastí (obrázok 5C). AGS-EBV bunky vykazovali nárast metylácie DNA v niekoľkých bunkových miestach, vrátane regiónov obklopujúcich EBNA1 väzobné miesta na tlačidlo GKN1 promotorové oblasti (obrázok 5C) a HDAC3 a MAP3K7IP2 gény (Obrázok 5d). Avšak, prítomnosť EBNA1 v AGS-EBV buniek nezabránil Aza-indukovanej demetyláciu v týchto miestach. To naznačuje, že EBNA1 môžu potláčať transkripciu z niektorých promotorov, ako GKN2, prostredníctvom mechanizmu odlišný od metylácie DNA. Avšak, ektopická expresia EBNA1 sám produkoval zložitejšie fenotyp, čo spôsobuje malé zvýšenie bazálnej expresii, ale obmedzenie účinkov Aza-indukovanej demetylácie (obrázok 7). Toto môže navrhnúť, že EBNA1 môže fungovať inak, ak sú vyjadrené ektopicky, než pokiaľ je exprimovaný v kontexte vírusového genómu. Avšak, naše zistenia naznačujú, že EBNA1 narúša normálne regulácia transkripcie génov GKN1 a GKN2.
Presná funkcie EBNA1 v regulácii transkripcie zostáva nejasný. EBNA1 je zapojený v transkripčný aktiváciu a potlačenie oboch vírusových a bunkových génov [32, 33]. EBNA1 môže potlačiť svoju vlastnú expresiu mRNA z EBV Qp v typu III latencie, kde represie boli spojené s stéricky interferencie s RNA polymerázy II väzbe na iniciačného miesta transkripcie [34]. Na druhej strane, EBNA1 môže aktivovať CP a LMP1 promótory v typu III latencie, kde môže fungovať ako faktor zosilňovacieho podobné [35-37]. EBNA1 sa podieľa na transkripčný aktiváciu niekoľkých bunkových génov, vrátane génu Nox2 podieľajú na tvorbe reaktívne kyslíkové druhy [19]. EBNA1 môže tiež ovplyvniť hostiteľ-buniek transkripciu prostredníctvom celosvetovej remodeláciu hostiteľského chromozómu [38]. Tak, EBNA1 môže meniť bunkovú transkripciu cez niekoľko priamych a nepriamych mechanizmov.
Epigenetických modifikácií je známe, že hrajú dôležitú úlohu v EBV-súvisiace karcinómu žalúdka [39]. Je zaujímavé, že AGS bunky nesúce EBV bacmid genómy mali vyššie hladiny methylata DNA na mnohých testovaných miestach (Obrázok 5d). To je v súlade s predpokladanou úlohu EBV v metylácii hostiteľskej nádorových supresorových génov [40]. To je tiež v súlade so zisteniami, že EBV pozitívne GC povýšila metylácie DNA v promotorových oblastí niekoľkých kľúčových GC nádorových supresor, vrátane gastrokine génov [39, 41-45]. Kým EBNA1 viazaný v blízkosti DNA methyluje regiónoch GKN2, sme neboli schopní preukázať, že EBNA1 moduluje metylácie DNA v miestach GKN1 a GKN2 (dáta nie sú uvedené). Avšak, je možné, že EBNA1 v spojení s iným vírusovým kódovaného alebo indukovaného faktora môže stabilizovať GKN1 a GKN2 transkripčný represiu cez chromatín-závislé a štrukturálne mechanizmus, ktorý posilňuje metylácie DNA. Je tiež možné, že EBNA1 môže regulovať GKN1 alebo GNK2 iba v tkanive alebo nádorové mikroprostredie, ktoré nie sú ľahko zhrnutý v bunkovej kultúre. Zatiaľ čo funkcia EBNA1 väzby na chromozóme hostiteľskej bunky miesta zostáva dôležitou oblasťou vyšetrovania, môže byť potrebné viac sofistikované modely infekcie k objasneniu potenciálnu úlohu zmenou génovej expresie a karcinogenéze hostiteľskej bunky.
Metódy
Cells, plazmidy, a lentivirus infekcie
EBV pozitívnych lymfómu Raji bunky Burkittovho, EBV pozitívne nosohltana karcinómu C666-1 bunky a karcinóm žalúdka bunkové línie (dar od Dr. Antonia R. Sepulveda, Columbia University), vrátane GTL, MKN28, MKN74, SNU638 boli udržiavané v médiu RPMI obsahujúcom 10% FBS a s prídavkom antibiotík (penicilín a streptomycín). Karcinómu žalúdka AGS bunky (ATCC No. CRL-1739) boli udržiavané v F-12K obsahujúci 10% FBS. Primárne ústach epitelové bunky boli poskytnuté Dr. Manjunath Benakanakere, University of Pennsylvania, a kultivované v keratinocytov-SFM médiu. EBV-LCL bola založená primárnej infekcie z mononukleárnych buniek periférnej krvi (PBMC) s EBV BAC viriónov získaných z stimulovaných 293-EBV bunkách [46, 47]. EBV-LCL obsahuje hygromycinu B rezistentné EBV bacmid udržiavali v médiu RPMI obsahujúcom 10% FBS, hygromycinu B (100 ug /ml), glutamaxem (Invitrogen), a antibiotiká. AGS-EBV bunky boli generované z AGS bunkách, ktoré spoločne kultivovaných s EBV-LCL prispôsobením skôr publikované ko-kultivačné metóda opísaná AGS buniek infekcii rEBV kontaktom bunky do bunky [48] s niekoľkými úpravami. Stručne povedané, EBV-LCL sa získalo 20 ng /ml 12-O
-tetradecanoylphorbol-13-acetát (TPA) a 1 mM butyrátu sodného (NAB) 24 hodín pred kokultivace. Indukovanej EBV-LCL boli bunky premyté PBS, dvakrát úplne odstrániť indukujú činidiel, resuspendované s kompletným RPMI médiu pri teplote 10 6 buniek /ml pred ko-inkubácie. AGS bunky boli nanesené na 6-jamkové doštičky 24 hodín pred kokultivace, potom 60-70% konfluentní AGS buniek v 1 ml kompletnej F-12K médium boli inkubované s 10 6 indukovaných a premyje EBV-LCL buniek v 1 ml kompletným RPMI. O 24 hodín neskôr bolo pridané 2 ml bezsérového F-12K média do každej jamky a znižuje koncentrácia FBS do 5%, aby sa zabránilo prerastanie buniek. 3 dni po ko-inkubácii s EBV-LCL bunky boli odstránené z spoločných kultúrach a bunky AGS boli dôkladne premyté PBS aspoň 5 krát odstrániť niektoré z darcu EBV-LCL buniek. Infikované bunky AGS sa potom inkubujú s čerstvým F-12K médiu s 10% FBS a 100 ug /ml hygromycinu B a selekčný médium bolo menené každé 2 až 3 dni až do infikovanej AGS buniek vytvorených hyg B pre výber kolónií s expresia GFP (zvyčajne 3 až 4 týždne po ko-kultivácie). Výberové kolónie boli potom spojené a testované na expresiu EBNA1 a EBV genómu počtu kópií, než je viazaný na experimenty. AGS-EBV bunky boli udržiavané v médiu F-12K s 10% FBS a 100 ug /ml hygromycinu B.
PLU-EBNA1 lentivirus expresný vektor bol konštruovaný pomocou PCR amplifikácie s primermi EBNA1 (GCGGGATCCTCTGACGAGGGGCCAGGTACAGGACCT a ATCGTCGACTCACTCCTGCCCTTCCTCACCCTCATC), ktorým sa zavádza 5 ' BamH i a 3 'Sal aj webu klonovaný do rámu PLU TCMV-FMC-pPURO. Bunky AGS alebo MKN74 boli infikované lentivirus vyjadrujúcim PLU EBNA1 alebo kontrolným vektorom plu generovaného čerstvo z 293T buniek. Infikované AGS alebo MKN74 bunky potom boli vybrané s 2,5 ug /ml puromycinu po dobu 10 až 14 dní. Vybrané bunky sa spoja a spracuje sa s alebo bez 5'-azacytidinu po dobu 48 hodín, potom sa podrobí RT-PCR.
Sírne proti EBNA1 a siRNA kontrolu (kat. Č D-001810-01-20) boli všetky zakúpené od Dharmacon. siRNA namierená proti EBNA1 3 'UTR boli syntetizované za použitia cieľovej sekvencie CGGAGAUGACGGAGAUGAAUU. Transfekcia duplex siRNA bola vykonaná za použitia Oligofectamine (Dharmacon), podľa inštrukcií výrobcu.
Chromatin Imunoprecipitácia (čipu) testy
čip test bol vykonaný ako bolo opísané skôr [49]. Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Dlhá nekódujúca RNA profil expresie v ľudskom žalúdku rakoviny a jej klinické významov
• In silico analýzy karcinóm žalúdka Sériová analýza génovej expresie knižníc odhaľuje rôzne profily spojené s etnickou príslušnosť