vezavo EBNA1 in epigenetsko regulacijo gastrokine zaviralnih genov v želodcu zavezujoč karcinom cells

EBNA1 in epigenetske ureditev gastrokine zaviralnih genov v želodčnih celic karcinoma
Abstract
Ozadje
Epstein-Barr virus (EBV) latentno okuži ~ 10 % želodčnih karcinomov (GC). Epstein-Barr Nuclear Antigen 1 (EBNA1) je izražena v-EBV povezana GC, in lahko veže DNK gostitelja, kjer se lahko vplivale mobilnega regulacijo genov. Tukaj bomo pokazali, da EBNA1 veže neposredno na DNK gorvodno od divergently kopiranih GC-specifične zaviralnih genov gastrokine 1 (GKN1) in gastrokine 2 (GKN2).
Metode
Uporabljamo čip naslednje, chip-qPCR, in EMSA dokazati, da EBNA1 veže neposredno na GKN1 in GKN2 promotorja lokus. Mi ustvarjanje AGS-EBV in AGS-EBNA1 celičnih linij, naj preuči učinke EBNA1 na GKN1 in GKN2 mRNA izražanja z ali brez 5 'azacitidin zdravljenja.
Rezultati
Pokazali smo, da se gastrokine geni transkripcijsko zatrejo metilacije DNA . Prav tako kažejo, da je latentna EBV okužba dodatno zmanjšuje GKN1 in GKN2 izraz v AGS želodčnih celic karcinoma, in da je izčrpavanje siRNA od EBNA1 delno blaži to represijo. Vendar zunajmaternične izraz EBNA1 nekoliko povečane ravni GKN1 in GKN2 bazalni mRNK, vendar zmanjšana odzivnost na demetiliranjem agenta.
Sklepi
Te ugotovitve kažejo, da je EBNA1 veže na različno promotor genov GKN1 in GKN2 v GC celicah, in kažejo, da EBNA1 prispeva k kompleksne transkripcijskih in epigenetske deregulacijo GKN1 in GKN2 zaviralnih genov v EBV pozitivno GC.
Ključne besede
EBV EBNA1 želodca karcinom Gastrokine čip Zap epigensko Uvod
Epstein-Barr virus ( EBV) je človeški gammaherpesvirus najdemo v številnih limfni in epitelijskih celic raka, tudi Burkittovega limfoma, Hodgkinove bolezni, nazofaringealnega karcinoma (NPC), in po presaditvi limfoproliferativne bolezni (pregledali v [1, 2]). V zadnjem času, EBV je bilo ugotovljeno v ~ 10% vseh karcinom želodca (GC) primerih po svetu [3, 4]. EBV povezano GC je pokazala, da je monoklonsko izrastek želodčnih epitelnih celic z EBV okuženi in se šteje za ločen podtip GC [5, 6]. Ker je pojavnost GC blizu 900.000 ljudi na leto [7], lahko-EBV povezana GC je med najbolj razširjenimi raka EBV povezanih.
V EBV pozitivne želodčne karcinomske celice, EBV vzpostavlja vrsto varianto I latenco, kjer EBV prepisu je omejena na kanonični tipa I geni EBNA1, Ebers, BART družina nekodiranih RNA in miRNAs, vendar z nekaj dodatnimi izražanje LMP2A [6, 8-11]. Med temi latenco genov, EBNA1 edina virusna jedrska protein, ki je prisoten v-EBV povezana GC. EBNA1 je za vzpostavitev latentno okužbo z episomsko in za dolgoročno preživetje latentno okuženih celic [12-15] potrebno. EBNA1 je zavezujoč DNA protein, ki se veže na oba virusne in gostiteljske kromosomske straneh. So vezavna mesta v virusnem genomu so označena za bistvenih funkcij za replikacijo in transkripcijsko kontrolo virusne genske ekspresije. Vendar pa je funkcija EBNA1 sekvenčno specifično veže na gostiteljski kromosoma manj dobro razume. Medtem ko lahko EBNA1 veže na promotor regije več gostiteljskih genov, ostaja nejasno, ali so ti geni velja ureditev EBNA1 [12, 16, 17]. Čezmernim vezavne domene EBNA1 DNA, ki deluje kot prevladujoče negativno v okuženih celicah EBV, lahko zavira sposobnost celic v neokuženih celicah, ki kažejo, da je EBNA1 veže in ureja celičnih genov, ki so pomembni za preživetja celice [18]. Ektopična ekspresija EBNA1 Dokazano je za izvedbo gostiteljska celica mRNA ekspresije [19], vendar pa ni jasno, ali so ti učinki neposredno ali posredno povezan s posebnimi vezavo EBNA1 mestih v celičnem genomu.
V prejšnji študiji smo uporabili čip naslednje metode za analizo spletnih mest genoma vsej obogatitev EBNA1 v latentno okuženih celicah limfoma Raji Burkittovega in opredeliti številne mobilnih spletnih mest, ki jih EBNA1 [17] vezani. Med temi EBNA1 straneh celični bogatitvijo smo identificirali pomemben zavezujoča EBNA1 vrh, ki se nahaja na gastrokine 1 (GKN1) in gastrokine 2 (GKN2, znan tudi kot deteljast dejavnik v stiku beljakovin (TFIZ1)) genov grozda. GKN1 in GKN2 so bile opredeljene glede na njihovo pogosto izgubo izražanja v neoplasticnih želodčnega karcinoma epitelijskih celic, v primerjavi z normalno želodčnega tkiva [20-22] (preveri na [23]). Številne nedavne študije so opisane antiproliferativne in anti-invazivno dejavnost GKN1 v želodčnih epitelijskih celic, ki skupaj s svojo pogosto izgubo izražanja raka, nakazuje, da deluje kot zaviralnih posebne želodčnemu epitela [21, 24-28]. GKN1 lahko ovirajo migracijo celic in invazijo na celjenje ran, transwell in Matrigelove testu, kot tudi alter označevalce celic, povezane z epitelno-mezenhimskih prehodu [26]. GKN1 in GKN2 geni se nahajajo v neposredni bližini in prepisane v nasprotnih smereh, kar pomeni, da bodo verjetno delijo dvosmerne promotor, in veljajo za usklajevanje zakonodaje z deljeno prepisovanje regulatornih faktorjev (pregleda v [23]).
V tem študija, smo dokazali neposredno vezavo med EBNA1 in GKN1-GKN2 lokusov in raziskovali GKN1 in GKN2 izražanje genov modulacijo s okužbe EBV in EBNA1 beljakovin. Naše ugotovitve kažejo, da lahko okužba EBV zavirati GKN1 in GKN2 izraz, in da izguba EBNA1 lahko olajša epigenetsko de-zatiranje GKN2 transkripcijo. Opazili smo tudi raven povišana DNA metilacije na GKN1 in GKN2 promotor regijah, in potencialne vloge EBNA1 na deregulacijo in epigenetske zatiranju te zaviralnih locus.
Rezultati
Identifikacija visoke zasedenosti EBNA1 vezavno mesto na GKN1 -GKN2 locus s chip-Zap PODJETJA
Prej objavljeni čip Zap podatke iz Raji BL celice so pokazale omejeno število visoko obogateni EBNA1 vezavnih mest, ki temeljijo na najvišjih ocen in brati številke [17]. Nadaljnji pregled je pokazala močno EBNA1 vezavno mesto, ki se nahaja gorvodno od začetnih straneh za divergently kopiranih GKN1 in GKN2 genov (Slika 1A, zgornja tirov). Podoben EBNA1 vezavo vrh opazili v ločenem čipu-Seq eksperiment izvedli v EBV pozitivna nazofaringealni karcinom linije C666-1 (natančne podatke čip naslednje treba objavljena drugje), kar kaže, da je ta zavezujoč pojavlja v obeh epitelnih, kakor tudi limfni tipi celic (slika 1A, nižji tir). Središče vrha se je nahajala ~ 5 kb iz GKN2 in ~ 15 kb iz začetnih mestih GKN1 prepisu. Chip-qPCR je bil uporabljen za potrditev EBNA1 vezavo na GKN1-GKN2 promotorja regiji tako Raji in C666-1 celic (Slika 1B in C). qPCR je navedeno, da je EBNA1 vezan na mestu GKN1-2 s podobno učinkovitostjo na predhodno potrjenim EBNA1 vezave mestu na promotor PITPNB. qPCR je tudi navedel, da je bila EBNA1 vezavo na GKN1-GKN2 specifična, saj ni bilo zaznati EBNA1 vezavo bodisi mobilnega GAPDH lokusu ali EBV OriLyt kontrolnih območjih, kot je bilo pričakovano (slika 1B in C). Domnevni EBNA1 vezavno mesto na GKN1-GKN2 locus smo identificirali s poravnavo s soglasno vezavno mesto v družini EBV ponovitev (FR) regije, in ta sekvenca je bila nato testiramo na direktno vezavo na EBNA1 EMSA (Slika 1D). Prečiščen rekombinantni EBNA1 DBD protein smo testirali za vezavo sonde, ki vsebujejo spletne strani GKN1-GKN2 (GKN1 /2), FR, ali negativno kontrolo zaporedja ji primanjkuje soglasje EBNA1 vezavno mesto. Ugotovili smo, da EBNA1 DBD učinkovito veže na mestu GKN1-GKN2, kot tudi konsenza FR, vendar pa ne veže na sekvenco nadzora. Te ugotovitve kažejo, da EBNA1 komunicira z GKN1-GKN2 promotorja regiji z neposrednim DNK-vezave z EBNA1 DBD. Slika 1 EBNA1 veže na GKN1 in GKN2 promotorja lokus. (A) Genom brskalnik UCSC je bil uporabljen za preslikavo EBNA1 zavezujoč višek proizvedene iz Raji in C666-1 čip naslednjih letih na GKN1 in GKN2 genski lokusi. RefSeq označeni prepisi so navedene v nadaljevanju čip-Zap vrha. (BC) Realtime-PCR potrditev podatkov čip naslednje za EBNA1 vezivnega mesta na GKN1 /2 skupni promotorja regiji: EBNA1 (rdeči stolpci) ali nadzor IgG (modra barov) smo testirali s čipom v Raji (B) ali C666-1 celice (C) za DNA vezavo na /2 mestu GKN1, PITPNB promotor, GAPDH ali EBV Ori-Lyt. (D) EMSA analiza 32P označena sond, ki vsebujejo Control, GKN1 /2 mesto, ali EBV FR. Različno količino EBNA1 DBD proteina smo uporabili vezavo reakcijo (0, 100, 300, 900 ng). Puščice predstavljajo EBNA1 specifično vezane komplekse ali brezplačno sondo, kot je navedeno. Zaporedje sonda GKN1 /2 strani in FR označuje zaporedje homolog (rdečimi črkami) med GKN1 /2 in FR. Negativna kontrola (Ctrl) zaporedje je prav tako navedena. Napaka palice kažejo standardni odklon od srednje vrednosti (SDM) za n = 3.
so GKN1 in GKN2 mRNA zelo izražene v primarnem želodcu tkivu
smo poleg izmerjene vrednosti GKN1 ali GKN2 mRNA v različnih želodčnih karcinom celičnih linij in primarnih normalna želodca tkivo s QRT-PCR (slika 2). Ugotovili smo, da so GKN1 in GKN2 izražena na precej višjih nivojih (~ 3 x 10 4-kratno) v osnovnem želodcu tkivu kot v katerem koli izmed celičnih linij testiranih (slika 2A). Čeprav je na precej nižji ravni kot primarno želodcu tkiva, GKN1 in GKN2 sta bila izražena na merljive koncentracije v AGS želodčnega karcinoma celičnih linijah, s GKN2 izražena pri višjih vrednostih od vseh ostalih GC celičnih linijah, ali EBV pozitiven B-celic ali celične linije NPC ( Slika 2B). Zelo nizke stopnje GKN1 ali GKN2 bilo mogoče odkriti v primarnem oralno epitelijskega tkiva, nadalje kaže, da so ti geni specifični za primarno želodčno-tkivu. Slika 2 GKN1 in GKN2 mRNA so zelo izražene v primarnem želodcu tkiva. RT-PCR smo izvedli analizirati raven mRNA za GKN1 (modri stolpci) ali GKN2 (rdeči stolpci) v različnih celičnih linij, vključno z-GC izhaja GTL, MKN28, MKN74, SNU638, AGS, BL-izpeljana Raji, EBV ovekovečena LCL, EBV pozitiven NPC linija C666-1 ali epitelnih celic primarni ustih primerjali z (A) ali brez njega (B) primarnega želodca tkiva. Napaka palice kažejo standardni odklon od srednje vrednosti (SDM) za n = 3.
EBV latence zmanjšuje GKN1 in GKN2 mRNA izražanja v celičnih linijah GC PODJETJA
Za preizkušanje učinkov EBV latentne okužbe na GKN1 in GKN2 izražanja, smo ustvarili celica linije AGS vsebuje EBV B95.8 bacmid. Celična linija AGS bil izbran za odpornost higromicin in GFP pozitivnosti, da se zagotovi, da vsebuje bacmid komponent. Okarakterizirati celične linije AGS-EBV, smo najprej analizirali izraz vzorec EBV genov (slika 3). Ugotovili smo, da AGS-EBV celice izražena zaznavne količine mRNA EBNA1, BARF0 in LMP2A, ne pa LMP1, EBNA2 ali EBNA3C (slika 3). Čeprav EBV B95.8 bacmid nima BART miRNAs, te ugotovitve so skladne z AGS-EBV celice sprejela vrsto varianto sem latentnem izražanja genov program z neko izražanje LMP2A, podobno kot pri EBV pozitivno želodčni rak tumorsko tkivo [8, 10 ]. Za nadaljnjo opredelitev AGS-EBV celic, smo analizirali EBNA1 protein izražanje Western blot (slika 4A) in EBV DNA kopirati številko qPCR (slika 4B). EBNA1 bil zaznan kot eno vrsto nizka številčnost na pričakovano molekulsko maso (slika 4A). Število EBV kopija je bila izmerjena s primerjavo EBV Ori-Lyt DNK na celični GAPDH (slika 4B). Ugotovili smo, da AGS-EBV vseboval ~ 50% manj kopije virusnega genoma v primerjavi z EBV pozitivnih LCLs. Če želite ugotoviti, EBNA1 ohranila vezavo aktivnost DNA v AGS-EBV, smo izvedli običajne čip teste (slika 4c). Ugotovili smo, da EBNA1 vezan na EBV diada Symmetry (DS) DNK, pa tudi, da je vezno mesto GKN1-GKN2 v AGS EBV celic. Naslednjič vprašal, ali so bile ravni GKN1 ali GKN2 mRNA vpliva EBV latentno okužbo v AGS celic s primerjavo ravni izražanja RT-qPCR v AGS glede na AGS EBV celic (Slika 4D). Ugotovili smo, da so bili GKN1 in GKN2 zatrta ~ 3-8 krat v AGS-EBV glede na AGS celic, kar kaže, da EBV latence spodbuja ali stabilizira transkripcijski zatiranje GKN1 in GKN2. Slika 3 Karakterizacija EBV izražanje genov v celičnih linijah AGS EBV. AGS, AGS-EBV je pozitiven in EBV-LCLs smo testirali za ekspresijo mRNA s QRT-PCR s primerji za EBNA1, BARF0, LMP2A, LMP1, EBNA2 ali EBNA3C, kot je navedeno. Napaka palice kažejo standardni odklon od srednje vrednosti (SDM) za n = 3.
Slika 4 okužbo EBV od AGS celic zavira GKN1 in GKN2 prepis. (A) Western blot analizo EBNA1 beljakovin izražanja v AGS EBV celic v primerjavi z AGS celic EBV-negativna je bila izvedena z protitelesa za EBNA1 (zgoraj) ali Actin (dno). številka (B) DNA kopija smo analizirali s PCR v realnem času z EBV Ori-Lyt DNK glede na stopnjo celične GAPDH v letnem pregledu rasti, AGS-EBV in EBV-LCL celic. (C) čip in v realnem času analize PCR EBNA1 (rdeče bar) in nadzor IgG (modre palice) za DNA vezavo na EBV mestih, vključno z DS in Ori-Lyt ali mobilnih lokacij, vključno GKN1 /2 in GAPDH v AGS-EBV celice. (D) RT-PCR smo izvedli analizirati raven mRNA za GKN1 ali GKN2 v AGS (modre palice) ali AGS-EBV celice (rdeče palice). ** Pomeni, p < 0,005. Napaka palice kažejo standardni odklon od srednje vrednosti (SDM) za n = 3.
EBV povečuje DNA metilacijo odvisno zatiranje GKN1 in GKN2 mRNA v celičnih linijah GC
GKN1 in GKN2 lahko predmet epigenetske zatiranju v PK in tkiva kulturi celične linije. Če želite raziskati to možnost, smo preizkusili, ali zdravljenje z DNA demetiliranjem agenta 5 'azacitidin (aza) ali deacetylating sredstvo (NAB) v kombinaciji s phorbol estra (TPA) bi aktivirali GKN1 ali GKN2 v AGS celic (slika 5A). Ugotovili smo, da je zdravljenje Aza privedlo do ~ 10 kratno povečanje GKN2, in ~ 4 povečanje krat v GKN1 prepisu v AGS zdraviti celice. V nasprotju s tem, zdravljenje NAB /TPA proizvaja le ~ 2 krat aktivacijo transkripcije. Te ugotovitve kažejo, da sta GKN1 in GKN1 dejavno epigenetske represije skozi metilacije DNA. Če želite preveriti, če EBV imelo nobenega učinka na Aza inducirane aktivacijo GKN1 ali GKN2, smo primerjali učinke zdravljenja aza o AGS glede na AGS EBV celic s QRT-PCR (slika 5B). Ugotovili smo, da so bili GKN1 in GKN2 učinkovito aktivira z obdelavo aza v AGS celic, vendar v manjšem obsegu v AGS-EBV. V teh poskusih smo aza-inducirano aktivacija GKN2 popolnoma odpraviti, medtem ko je aktivacija GKN1 le delno oslabljen. Aza zdravljenje pripeljalo tudi do ~ 8,4 kratno povečanje ravni EBNA1 mRNA, kar kaže, da zdravljenje aza spodbuja EBV litičen izražanje genov v celičnih linijah AGS EBV. Ti rezultati kažejo, da EBV genski produkti preprečevanje GKN2, in v manjšem obsegu aktivacije GKN1 po zdravljenju Aza. Slika 5 EBV krepi zatiranje GKN1 in GKN2 genske ekspresije z metilacije DNA. (A) AGS Celice smo obdelali z 10 iM aza ali 1 mM NaB in 20 ng /ml TPA 48 ur in analizirali z RT-PCR za GKN1 ali raven GKN2 izražanja, v primerjavi z nezdravljenimi AGS. (B) AGS celice ali AGS-EBV celice so bile obdelane ali neobdelane z 10 mikrometrov aza 48 ur, nato preizkusimo za GKN1, GKN2 mRNA ali ravni EBNA1 mRNA. (C) MeDIP vsebnosti AGS ali AGS EBV celicah, obdelanih ali neobdelanih z 10 mikrometrov aza za 48 ur v različnih regijah DNA GKN1 in GKN2 lokusov. (D) MeDIP vsebnosti AGS ali AGS EBV celicah, obdelanih ali neobdelanih z 10 mikrometrov aza 48 ur na mobilnih regij za alfa hemoglobina-2, GAPDH, CDC7, FOXP2, HDAC3 ali MAP3KIP2. (E) Genom položaj oligonukleotidov, ki se uporabljajo za GKN1-GKN2 čip in MeDIP testov. * Označuje p < 0,05, ** pomeni, p < 0,005. Napaka palice navedeno SDM za n = 3.
Da bi bolje razumeli mehanizem GKN1 in GKN2 epigenetske represije, smo pregledali ravni DNA metilacije uporabo metil citozin specifično protitelo, usmerjeno DNA imunoprecipitacije (MeDIP) testom. testirali smo obogatitev metiliranega DNK v kontrolni regiji GKN1-GKN2 v AGS in AGS EBV celic z ali brez zdravljenja aza (slika 5C). Ugotovili smo relativno obogatitev metiliranega CPG na območju med EBNA1 vezavnega mesta in GKN2 prepis začetnem mestu (GKN2_A). Zdravljenje Aza privedlo do zmanjšanja MeDIP signala v večini regij, kjer je bila odkrita signal, kar kaže, da zdravljenje aza pripeljala do splošnega zmanjšanja metilacije DNA. Podobno izguba CpG metiliranja opazili v genu-alfa globin (kar ne veže EBNA1), in na več vezavo EBNA1 mest, vključno HDAC3 in MAP3K7IP (Slika 5D). Opazili smo tudi, da so bile MeDIP signali EBV-letnem pregledu rasti na splošno višje kot v AGS celicah, kar pomeni, da lahko EBV latentna okužba spodbuja ali stabilizacijo DNA metilacije v celotni genom gostitelja.
izčrpavanje EBNA1 aktivira GNK1 in GKN2 mRNA izražanja v EBV pozitivnih epitelijskih celic
če želite ugotoviti, EBNA1 prispevala k transkripcijske zatiranju GKN1 in GKN2, smo najprej poskušali tanjšajo EBNA1 v AGS EBV celic z uporabo siRNA (Slika 6). ustvarili smo siRNA ciljanje 3 'ne-kodirni UTR za EBNA1 mRNA, ki je delno osiromašenega EBNA1 protein v AGS EBV celic (slika 6b). Izčrpavanje EBNA1 povzročilo ~ 5 aktivacijo-krat na GKN2, z malo zaznavno aktivacijo GKN1 (slika 6A). Te ugotovitve kažejo, da lahko EBNA1 deluje kot transkripcijski represorju za GKN2 v AGS EBV celic. Slika 6 izčrpavanje siRNA od EBNA1 povzroča de-zatiranje GKN1 in GKN2 v AGS EBV celic. siCtrl ali siEBNA1 transfektirali AGS-EBV celice smo testirali z RT-PCR za GKN1 ali GKN2 mRNA nivo glede na celično GAPDH (A). Celice smo zbrali po 72 urah po transfekciji s siRNA. Western blot prikazuje EBNA1 (zgornja slika) in nadzor nakladanje aktina (nižji plošča) v AGS EBV celice (B). Napaka palice kažejo standardni odklon od srednje vrednosti (SDM) za n = 3.
EBNA1 zavira GKN1 in GKN2 transkripcijo po DNA demetilacijo
Da bi še dodatno raziskati prispevek EBNA1 do GKN1 in GKN2 uredbe prepisu smo testirali učinek zunajmaternične izražanje samega EBNA1 na aza-induciranih ravni GKN1 ali GKN2 transkripcijo v GC celicah. AGS celice smo transduciramo z EBNA1 izražanje lentivirusom. Stabilno AGS-EBNA1 (plu-EBNA1) ali AGS- nadzor nad prenašalci (plu-Vec) celične linije so bili izbrani in testirali na ravni GKN1 in GKN2 mRNA. Opazili smo, da so imeli AGS-EBNA1 celice A ~ 2-3 krat višjo bazalno raven GKN1 in GKN2 mRNA glede na starševski AGS celic (slika 7A). Vendar pa je Aza-induciranih ravni mRNA za GKN1 in GKN2 bile oslabljene v AGS-EBNA1 primerjavi z AGS celice (Slika 7b). Zdravljenje Aza povzročila tudi veliko povečanje ravni EBNA1 mRNA (slika 7c). Če želite ugotoviti, ali so bili učinki EBNA1 na GKN1 in GKN2 specifičen za AGS celic, smo transduciramo še EBV negativno GC celične linije MKN74 z EBNA1 lentivirusom (Slika 7D-F). Podobno AGS celic, smo ugotovili, da EBNA1 poveča bazalni ravni GKN1 in GKN2, vendar zaviral sposobnost aza nadalje povzroči GKN1 in GKN2 mRNA ravni (Slika 7D in E). Potrdili smo, da je Aza-obdelava učinkovita z merjenjem EBNA1 mRNA ravni, kar je povečalo ~ 7-krat (slika 7F). Te ugotovitve kažejo, da lahko ektopična ekspresija EBNA1 poveča bazalno, temveč inhibira aza-induciranih raven GKN1 in GKN2 transkripcije v EBV-negativnih GC celičnih linijah. Slika 7 EBNA1 zavira GKN1 in GKN2 transkripcijo po demetilacijo DNK v GC celicah. (A) AGS celice transduciramo s plu-Vector (Vec) ali plu-EBNA1 in nato neobdelane (Untr) ali obdelana z 10 mikrometrov 5-azacitidin (aza) za 48 ur. GKN1 in GKN2 mRNA so ovrednoteni s QRT-PCR glede na GAPDH. (B) Zložite indukcijo GKN1 in GKN2 mRNA s aza so količinsko iz plošče A. (C) QRT-PCR analizo ravni EBNA1 mRNA v AGS celicah. (D) Enako kot v A, razen za uporabo MKN74 namesto AGS celic. (E) zložite indukcijo GKN1 in GKN2 mRNA količinsko iz plošče D. (F) QRT-PCR analizi ravni EBNA1 mRNA v MKN74 celicah. * Označuje p < 0,05, ** pomeni, p < 0,005. Napaka palice navedeno SDM za n = 3.
Razprava
V tej študiji smo ugotovili visoko zasedenost EBNA1 vezno mesto na 5 'nadzorni promotor območju od divergently kopiranih GKN1 in GKN2 genov. V dveh neodvisnih čip Zap podatkovnih nizov so opazili EBNA1 vezavnih mest z EBV pozitivne limfatičnega BL celice Raji in EBV pozitiven epitelijskih nazofaringealni karcinom celic C666-1 (slika 1A). Potrdili smo te veznih mest z običajnimi chip-qPCR v obeh celičnih linijah (Slika 1B in C). EBNA1 je pokazala tudi, da se neposredno veže na teh spletnih straneh, ki jih EMSA z očiščen rekombinantni EBNA1 DBD proteina (slika 1D). Pokazali smo, da se GKN1 in GKN2 mRNA zelo zatrta v večini celičnih linijah glede na primarno želodčnega tkiva (slika 2). Za študij potencialno vlogo EBV in EBNA1 v transkripcijsko kontrolo GKN1 in GKN2, smo ustvarili z EBV pozitivno AGS želodčni rak celično linijo. Pokazali smo, da EBV sprejme vrsto varianto I latenca vzorec v AGS celic (slika 3), in da EBNA1 lahko veže na GKN1 /GKN2 promotorski regiji v celični kromosom (slika 4C). tudi Ugotovili smo, da so bili GKN1 in GKN2 mRNA zanemarili v EBV pozitivnih AGS celic glede na nadzor EBV negativne AGS celice (Slika 4d). Nato smo pokazali, da Aza ravnanje privedlo do povečanja ekspresije GKN1 in GKN2 (slika 5A), in da EBV latentna okužba zavira aza aktivacijo GKN2 (slika 5B). Ugotovili smo, da izčrpavanje siRNA od EBNA1 v EBV pozitivnih AGS celic vodi do aktivacije transkripcije GKN2 (slika 6). Prav tako kažejo, da EBNA1 zunajmaternične izraz zmerno povečuje bazalno, vendar zavira Aza-induciranih ravni GKN1 in GKN2 transkripcije (slika 7). Skupaj, te ugotovitve kažejo, da EBNA1 veže na GKN1-GKN2 nadzorni promotor regije na več tipov celic v in dvigniti možnost, da EBNA1 prispeva k transkripcijske in epigenetske zatiranju GKN1 in GKN2 zaviralnih genov v EBV pozitivno GC.
EBV latentna okužba je znano, da poveča tumorogeno fenotip želodčnih celic karcinoma [29-31]. GKN1 in GKN2 so poročali, da delujejo kot zaviralci rasti celic in tumorjev razbijal v GC [20, 21, 23, 25-27]. Naši mRNA izraz podatki kažejo mRNA ekspresije visoki ravni le v osnovnem normalnem želodčnega tkiva so skladne z vlogo GKN1 in GKN2 kot zaviralnih. Vendar pa ni bilo mogoče dokazati, da prekomerno ekspresijo ene ali obeh GKN1 ali GKN2 v letnem pregledu rasti ali AGS-EBV povzročila aretacijo mobilni cikla ali zmanjša sposobnost (podatki niso prikazani). To kaže, da je GKN1 in GKN2 funkcijo v zgodnejših fazah razvoja tumorskih celic, ali v bolj zapletenih tumorskih mikrookolje. Mi špekulirajo, da bi lahko EBNA1 bolj izrazit vpliv na GKN1 in GKN2 izražanja v primerih, ko lahko EBV okužijo primarne želodčnih celic, kjer so bazalni izraz GKN1 in GKN2 visoka in pomembna za zatiranje tumorjev.
Prejšnje objavljene študije so pokazale, da GKN1 in GKN2 prepisu je predmet epigenetske zatiranja s metilacije DNA v vseh oblikah GC [21]. Naše raziskave so v skladu z vlogo metilacije DNA v epigenetske zatiranju GKN1 in GKN2 v AGS celicah. Zdravljenje z Aza povzročilo 4-10-kratno povečanje GKN1 in GKN2 ekspresijo mRNA (slika 5A), in MeDIP pokazala obogatitev metiliranega DNK na promotorja regijah (slika 5C). AGS-EBV celice pokazali povečanje metilacije DNA na več mobilnih enot, vključno z regijami, ki obdajajo EBNA1 zavezujoč mest na GKN1 promotorja regiji (slika 5C), ter HDAC3 in MAP3K7IP2 genov (Slika 5d). Vendar prisotnost EBNA1 v AGS EBV celicah ni preprečil aza-inducirano demetilacijo na teh mestih. To pomeni, da lahko EBNA1 zatirajo transkripcijo od nekaterih predlagateljev, kot GKN2, s pomočjo mehanizma, ki se razlikuje od metilacije DNA. Vendar ektopična ekspresija EBNA1 sam izdelal bolj zapleteno fenotipa, kar povzroča majhno povečanje bazalnih izražanja, temveč omejuje učinke aza-inducirane demetilacijo (slika 7). To lahko pomeni, da je lahko ta EBNA1 delujejo drugače, če je izražen ectopically, razen ko je bil izražen v kontekstu virusnega genoma. Kljub temu, naše ugotovitve kažejo, da EBNA1 perturbs normalno ureditev transkripcijski genov GKN1 in GKN2.
Natančno funkcijo EBNA1 pri regulaciji transkripcije ostaja nejasna. EBNA1 je vpletena v transkripcijsko aktivacijo in zatiranju obeh virusnih in celičnih genov [32, 33]. EBNA1 lahko zatre svojo mRNA izraz iz EBV QP v tip III zakasnitve, kjer je bila represija, povezane z steričnega motenj z RNA polimerazo II veže na mestu prepis začetek [34]. Po drugi strani pa lahko EBNA1 aktiviranje promotorjev CP LMP1 tipa III latenco kjer lahko deluje kot ojačevalec podobnega faktorja [35-37]. EBNA1 bil vpleten v aktivacijo transkripcije nekaterih celičnih genov, vključno Nox2 gen vključen reaktivnim postavitev kisik vrste [19] V. EBNA1 lahko vpliva tudi gostitelj celic transkripcijo z globalno preoblikovanje gostiteljskega kromosoma [38]. Tako lahko EBNA1 spremeni celično transkripcijo skozi več mehanizmov neposredne in posredne.
Epigenetske spremembe, je znano, da imajo pomembno vlogo pri-EBV povezana rakom želodca [39]. Zanimivo je, da AGS celice, ki izvajajo EBV bacmid genome imeli višjo stopnjo metiliranega DNK na mnogih preizkušenih lokacijah (Slika 5D). To je v skladu s predlagano vlogo EBV v metitiranjem gostiteljice zaviralnih genov [40]. To je tudi v skladu z ugotovitvami, da je EBV pozitiven GC povišane DNA metilacije na promoter regije več ključnih GC tumorskih razbijal, vključno gastrokine genov [39, 41-45]. Medtem ko EBNA1 vezan bližini regijah DNA metiliramo v GKN2, nismo mogli dokazati, da EBNA1 modulira DNA metilacije na mestih GKN1 in GKN2 (podatki niso prikazani). Vendar pa je mogoče, da EBNA1 v povezavi z drugo virusno kodirane ali izzvanega faktorjem stabilizacijo GKN1 in GKN2 transkripcijsko represije skozi kromatin odvisni in strukturno mehanizma, ki krepi DNA metilacijo. Možno je tudi, da lahko EBNA1 regulacijo GKN1 ali GNK2 le v tkivo ali tumorskih mikrookolje, ki niso takoj ponavljati v celični kulturi. Medtem ko je funkcija EBNA1 zavezujoče za gostitelja mobilni kromosomskih mest ostaja pomembno področje preiskave, je mogoče treba uporabiti bolj zapletene modele okužba osvetliti njeno morebitno vlogo pri spreminjanju celice gostiteljice izražanje genov in rakotvornost.
Metode
Celice, plazmidi, in lentivirusni okužba
EBV-pozitiven Burkittovega limfoma Raji celice, EBV pozitiven nazofaringealni karcinom C666-1 celice, in želodčni rak celične linije (darilo dr Antonia R. Sepulveda, Columbia University), vključno z GTL, MKN28, MKN74, SNU638 so se ohranili v RPMI vsebuje 10% FBS in dopolnjena z antibiotiki (penicilin in streptomicin). Želodčne karcinom AGS celice (ATCC št CRL-1739) so bili vzdrževani v F-12K, ki vsebuje 10% FBS. epitelne celice primarno v ustih so bili zagotovljeni dr Manjunatha Benakanakere, University of Pennsylvania in kultivirani v keratinocitov-SFM mediju. EBV-LCL je bil ustanovljen s primarno okužbo enojedrnih celicah periferne krvi (PBMC) z EBV BAC virionov, pridobljenih iz stimuliranih 293 EBV celic [46, 47]. EBV-LCL vsebuje higromicin B odporen EBV bacmid smo vzdrževali v RPMI, ki vsebuje 10% FBS, higromicin B (100 mg /ml), glutamax (Invitrogen) in antibiotike. AGS-EBV celice so bili ustvarjeni iz AGS celic co-gojenih z EBV-LCL s prilagajanjem že objavljen co-gojenje metodo, opisano AGS celice okužbe z rEBV skozi celično-to-celic stik [48] z nekaterimi spremembami. Na kratko smo EBV-LCL induciran z 20 ng /ml 12-O
-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) in 1 mM natrijev butirat (NAB) 24 ur pred co-gojenje. Inducirani EBV-LCL celice speremo s PBS dvakrat popolnoma odstraniti snovi, ki povzročajo, resuspendirali s popolno RPMI mediju pri 10 6 celic /ml pred co-inkubacije. AGS celice zasadimo v 6 vdolbinami 24 ur pred co-gojenja, nato pa 60-70% Strnjena AGS celic v 1 ml bila končana F-12K medij inkubirali pri 10 6 induciranih ter speremo EBV-LCL celic v 1 ml dokončanje RPMI. 24 ur kasneje smo 2 ml Serum prostega F-12K mediju dodamo v vsako vdolbino, da se zmanjša koncentracija FBS do 5%, da se prepreči celic razraščanje. 3 dni po sočasni inkubaciji smo EBV-LCL celice odstranijo iz pomožnih kultur in AGS celice smo temeljito sprali s PBS vsaj 5-krat, da odstranimo katero koli od darovalca EBV-LCL celice. Okuženih AGS Celice smo potem inkubirali s svežim F-12K mediju z 10% FBS in 100 ug /ml higromicin B in selekcijskega medija smo spremenili vsake 2 do 3 dni, dokler okužene AGS celice tvorijo izbirnih kolonij Hyg B z GFP izražanja (običajno 3 do 4 tedne po tem, ko so-gojenje). Izbirni kolonije smo nato zbrali in testirali za EBNA1 izražanja in EBV genoma številu kopij, preden je predmet poskusov. AGS-EBV celice smo vzdrževali v F-12K mediju z 10% FBS in 100 ug /ml higromicin B.
plu-EBNA1 lentivirusom ekspresijskega vektorja je konstruirana tako pomnoževanje EBNA1 s primerji (GCGGGATCCTCTGACGAGGGGCCAGGTACAGGACCT in ATCGTCGACTCACTCCTGCCCTTCCTCACCCTCATC) uvaja 5 ' BamH I in 3 'Sal I site klonirali v okvirju za plu-TCMV-FMC-pPURO. AGS ali MKN74 celice so bili okuženi z lentivirusom izraža plu-EBNA1 ali plu nadzorni vektorja ustvarjenega sveže iz 293T celic. Okuženi AGS ali MKN74 celice so nato izbrali z 2,5 pg /ml puromicina za 10 do 14 dni. Izbrane celice zberemo in obdelamo z ali brez 5-azacitidin 48 ur, nato podvržene RT-PCR.
SiRNA proti EBNA1 in siRNA nadzor (kat. Št D-001810-01-20) so bili vsi kupljeni iz Dharmacon. siRNA usmerjena proti EBNA1 3'UTR smo sintetizirali z uporabo ciljno sekvenco CGGAGAUGACGGAGAUGAAUU. Transfekcija siRNA dupleksov je bila izvedena s pomočjo Oligofectamine (Dharmacon), naslednji proizvajalci specifikacijami.
Kromatina imunoprecipitacije (čip) teste
čip teste so izvedli kot prej [49] opisano. Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• Long nekodiran RNA izraz profil v človeškega raka želodca in njenih kliničnih pomenov
• Silico analizo želodca karcinoma Serijska analiza izražanja genov knjižnic razkriva različne profile, povezane z narodnostjo