EBNA1 bindende og epigenetisk regulering av gastrokine tumorsuppressorgener i mage carcinoma celler

EBNA1 bindende og epigenetisk regulering av gastrokine tumorsuppressorgener i mage carcinoma celler
Abstract
Bakgrunn
Epstein-Barr-virus (EBV) latent infiserer ~ 10% av mage karsinom (GC). Epstein-Barr Nuclear antigen 1 (EBNA1) er uttrykt i EBV-assosierte GC, og kan binde vert-DNA, hvor det kan påvirke cellulær genregulering. Her viser vi at EBNA1 binder direkte til DNA oppstrøms fra divergently transkribert GC-spesifikke tumorsuppressorgener gastrokine 1 (GKN1) og gastrokine 2 (GKN2).
Metoder
Vi bruker chip Seq Chip-qPCR, og EMSA å demonstrere at EBNA1 binder direkte til GKN1 og GKN2 promoter locus. Vi genererer AGS-EBV, og AGS-EBNA1 cellelinjer for å studere effekter av EBNA1 på GKN1 og GKN2 mRNA uttrykk med eller uten 5 'azacytidin behandling.
Resultater
Vi viser at gastrokine gener transcriptionally brakt til taushet av DNA metylering . Vi viser også at latent EBV infeksjon ytterligere reduserer GKN1 og GKN2 uttrykk i AGS magekarsinom celler, og at siRNA utarming av EBNA1 delvis lindrer denne undertrykkelsen. Men ektopisk uttrykk for EBNA1 noe økt GKN1 og GKN2 basal mRNA nivåer, men reduserte sin respons til demethylating agent.
Konklusjoner
Disse funnene viser at EBNA1 binder seg til avvikende formidler av de GKN1 og GKN2 gener i GC-celler, og foreslår at EBNA1 bidrar til kompliserte transcriptional og epigenetisk dereguleringen av GKN1 og GKN2 tumorsuppressorgener i EBV positiv GC.
nøkkelord
EBV EBNA1 magekarsinom Gastrokine ChIP-Seq epigenetisk Innledning
Epstein-Barr virus ( EBV) er en menneskelig gammaherpesvirus finnes i et bredt spekter av lymfoid og epiteliale celle maligniteter, inkludert Burkitt lymfom, Hodgkins sykdom, nasofaryngeal karsinom (NPC), og etter transplantasjon lymfoproliferativ sykdom (anmeldt i [1, 2]). Mer nylig EBV er blitt funnet i ~ 10% av alle gastrisk karsinom (GC) tilfeller over hele verden [3, 4]. EBV-assosiert GC har vist seg å være et monoklonalt utvekst av EBV-infiserte gastriske epitelceller og er ansett for å være en distinkt subtype av GC [5, 6]. Fordi forekomsten av GC er nær 900.000 personer per år [7], kan EBV-assosiert GC være blant de mest utbredte EBV-assosiert kreft.
I EBV positive magekarsinom celler, EBV etablerer en variant type I ventetid, der EBV transkripsjon er begrenset til den kanoniske type i-genene EBNA1, Ebers, BART familie ikke-kodende RNA og mirnas, men med noen ekstra ekspresjon av LMP2A [6, 8-11]. Blant disse tidsforsinkelses genene, er EBNA1 den eneste viruskjerneprotein som er oppdaget i EBV-assosierte GC. EBNA1 er nødvendig for etablering av latent infeksjon episomale og for langtidsoverlevelse av latent infiserte celler [12-15]. EBNA1 er et DNA-bindende protein som binder seg til både virale og vertens kromosomale steder. Bindingsstedene i det virale genomet har vært preget av viktige funksjoner i replikering og transkripsjonen kontroll av viral genekspresjon. Imidlertid er funksjonen av EBNA1 sekvens-spesifikk binding til vertskromosomet mindre godt forstått. Mens EBNA1 kan binde seg til promotorområdene av flere vertsgener, er det fortsatt uklart om disse genene er gjenstand for EBNA1 regulering [12, 16, 17]. Overekspresjon av EBNA1 DNA-bindende domene, som virker som en dominant negativ i EBV-infiserte celler, kan hemme celleviabilitet i ikke-infiserte celler, hvilket antyder at EBNA1 binder seg til og regulerer cellulære gener som er viktige for celleoverlevelse [18]. Ektopisk uttrykk for EBNA1 har vist seg å påvirke vertscelle mRNA uttrykk [19], men det er ikke klart om disse effektene er direkte eller indirekte relatert til spesifikke EBNA1 bindingsseter i den cellulære genomet.
I en tidligere studie, brukte vi chip-seq metoder for å analysere genom-wide berikelse områder av EBNA1 i latent infiserte Raji Burkitt lymfom celler og identifisert en rekke cellulære nettsider bundet av EBNA1 [17]. Blant disse EBNA1 mobil berikelse områder vi identifisert et betydelig EBNA1 bindende topp ligger ved gastrokine 1 (GKN1) og gastrokine 2 (GKN2, også kjent som trekløverfaktor samspill protein (TFIZ1)) genet klynge. GKN1 og GKN2 har blitt identifisert basert på deres hyppige tap av uttrykk i neoplastiske magekreft epitelceller, sammenlignet med normal mage vev [20-22] (anmeldt i [23]). Flere nyere studier har beskrevet anti-proliferativ og anti-invasiv aktivitet for GKN1 i gastriske epitel-celler, som, sammen med dens hyppig ekspresjon tap i kreft, antyder den fungerer som tumor-suppressor spesifikke for gastrisk epitelium [21, 24-28]. GKN1 kan hemme cellemigrering og invasjon i sårheling, transwell og Matrigel assay, samt endre cellemarkører i forbindelse med epitel-mesenkymale overgang [26]. GKN1 og GKN2 genene er plassert i umiddelbar nærhet og transkribert i motsatte retninger, noe som tyder på at de sannsynligvis har en toveis promoter, og er underlagt koordinere regulering av felles transkripsjons regulatoriske forhold (anmeldt i [23]).
I denne studien, viste vi den direkte binding mellom EBNA1 og GKN1-GKN2 loci og undersøkt GKN1 og GKN2 genuttrykk modulering av EBV infeksjon og EBNA1 protein. Våre funn tyder på at EBV infeksjon kan videre hemme GKN1 og GKN2 uttrykk, og at tap av EBNA1 kan lette epigenetisk de-undertrykkelse av GKN2 transkripsjon. Vi har også observert forhøyet DNA metylering nivåer på GKN1 og GKN2 promoter regioner, og en potensiell rolle for EBNA1 i dereguleringen og epigenetisk undertrykkelse av tumor suppressor locus.
Resultater
Identifisering av en high-occupancy EBNA1 bindingssete på GKN1 -GKN2 locus av chip-Seq
Tidligere publiserte chip-Seq data fra Raji BL-celler viste et begrenset antall av høyanriket EBNA1 bindingssteder basert på topp score og lese tall [17]. Ytterligere inspeksjon avdekket en sterk EBNA1 bindingssete ligger oppstrøms av startsider for divergently transkribert GKN1 og GKN2 gener (Figur 1A, øvre spor). En lignende bindings EBNA1 topp ble observert i en separat kretsbrikke-Seq eksperiment utført i EBV-positive nasofaryngeal karsinom-cellelinje C666-1 (fullt CHIP-seq data som skal brukes i andre), som indikerer at denne binding oppstår både i epitel, samt lymfoid celletyper (figur 1A, lavere spor). Sentrum av toppen ble plassert ~ 5 kb fra GKN2 og ~ 15 kb fra GKN1 transkripsjonsstartsider. Spon qPCR ble anvendt for å validere EBNA1 binding ved den GKN1-GKN2 promoter-regionen i både Raji og C666-1 celler (figur 1B og C). qPCR indikerte at EBNA1 bundet til GKN1-2 nettsted med lik effektivitet til en tidligere validert EBNA1-bindingssetet på PITPNB promoter. qPCR også indikert at EBNA1 binding til GKN1-GKN2 var spesifikk siden det var ingen påvisbar binding EBNA1 på enten den cellulære GAPDH-lokuset eller EBV OriLyt kontrollregioner, som forventet (figur 1 B og C). Den antatte EBNA1 bindingssetet ved GKN1-GKN2 locus ble identifisert ved justering med et konsensus-bindingssete i EBV-familien av gjentagelser (FR) region, og denne sekvens ble deretter testet for direkte binding til EBNA1 av EMSA (figur 1D). Renset, rekombinant EBNA1 DBD-protein ble analysert for binding til prober inneholdende GKN1-GKN2 stedet (GKN1 /2), FR, eller en negativ kontrollsekvens som mangler et konsensus EBNA1 bindingssete. Vi fant at EBNA1 DBD bindes effektivt til GKN1-GKN2 området, så vel som til FR konsensus, men ikke binde til kontrollsekvens. Disse funnene tyder på at EBNA1 samhandler med GKN1-GKN2 promoter regionen gjennom direkte DNA-binding med EBNA1 DBD. Figur 1 EBNA1 binder på GKN1 og GKN2 promoter locus. (A) UCSC genom nettleser ble brukt til å kartlegge EBNA1 bindende peak generert fra Raji og C666-1 ChIP-seq på GKN1 og GKN2 genloci. RefSeq kommenterte transkripsjoner er angitt nedenfor chip-Seq topp. (BC) Realtime-PCR validering av Chip-seq data for EBNA1 bindingssete på GKN1 /2 delt promoter region: EBNA1 (røde søyler) eller kontrollere IgG (blå søyler) ble analysert ved chip i Raji (B) eller C666-1 celler (C) for DNA-bindende ved GKN1 /2 side, PITPNB promoter, GAPDH, eller EBV Ori-Lyt. (D) EMSA analyse av 32P-merket sonder som inneholder Control, GKN1 /2-område, eller EBV FR. Varierende mengde EBNA1 DBD-protein ble anvendt i bindingsreaksjonen (0, 100, 300, 900 ng). Pilespisser representerer EBNA1 spesifikke bundne komplekser eller gratis sonde som angitt. Sonden sekvens av GKN1 /2 side og FR er indikert med sekvens homologe (røde bokstaver) mellom GKN1 /2 og FR. Den negative kontroll (Ctrl) sekvens er også angitt. Feilfelt angir standardavvik fra middelverdien (SDM) for n = 3.
GKN1 og GKN2 mRNA er høyt uttrykt i primær magen vev
Vi neste målt GKN1 eller GKN2 mRNA nivåer i ulike magekreft cellelinjer og i primær normal gastrisk vev ved QRT-PCR (figur 2). Vi fant at GKN1 og GKN2 er uttrykt ved mye høyere nivåer (~ 3 x 10 4 ganger) i primær mage vev enn i noen av cellelinjene som ble testet (figur 2A). Selv på langt lavere nivåer enn primær magen vev, GKN1 og GKN2 ble begge uttrykt i målbare nivåer i AGS mage carcinom cellelinjer, med GKN2 uttrykt på et høyere nivå enn alle andre GC cellelinjer, eller EBV positive B-celle eller NPC cellelinjer ( figur 2B). Svært lave nivåer av GKN1 eller GKN2 kunne påvises i primær oral epitelvev, noe som ytterligere indikerer at disse genene er spesifikke for primær mage-vev. Figur 2 GKN1 og GKN2 mRNA er høyt uttrykt i primær magen vev. RT-PCR ble utført for å analysere mRNA nivået av GKN1 (blå søyler) eller GKN2 (røde søyler) i ulike cellelinjer inkludert GC-avledet GTL, MKN28, MKN74, SNU638, AGS, BL-avledet Raji, EBV udødelig LCL, EBV positiv NPC linje C666-1, eller primærmunn epitelceller som sammenlignet med (A) eller uten (B) primær mage vev. Feilfelt angir standardavvik fra middelverdien (SDM) for n = 3.
EBV ventetid reduserer GKN1 og GKN2 mRNA uttrykk i GC cellelinjer
For å teste effekten av EBV latent infeksjon på GKN1 og GKN2 uttrykk, vi genererte en AGS cellelinje som inneholder EBV B95.8 bacmid. AGS-cellelinjen ble valgt for hygromycin resistens og GFP positivitet for å sikre at den inneholdt bacmid komponenter. For å karakterisere AGS-EBV cellelinje, vi først analysert EBV-genekspresjon mønster (figur 3). Vi fant at AGS-EBV-celler uttrykte detekterbare nivåer av mRNA EBNA1, BARF0, og LMP2A, men ikke lmp1, EBNA2, eller EBNA3C (figur 3). Selv om EBV B95.8 bacmid mangler BART mirnas Disse funnene er i tråd med AGS-EBV celler vedta en variant type I ventetid genekspresjon program med noen uttrykk for LMP2A, lik den som er observert i EBV positiv magekarsinom svulstvev [8, 10 ]. For ytterligere å karakterisere AGS-EBV celler, analyserte vi EBNA1 protein uttrykk ved Western blot (figur 4A) og EBV DNA kopiere nummer ved qPCR (figur 4B). EBNA1 ble oppdaget som en enkelt lav overflod arter på den forventede molekylvekt (figur 4A). EBV kopitallet ble målt ved å sammenligne EBV Ori-Lyt-DNA til cellulær GAPDH (figur 4B). Vi fant at AGS-EBV inneholdt ~ 50% mindre kopier av det virale genomet sammenlignet med EBV-positive LCLer. For å avgjøre om EBNA1 beholdt sin DNA-bindende aktivitet i AGS-EBV, vi utførte konvensjonelle chip analyser (Figur 4C). Vi fant at EBNA1 bundet til EBV Dyad Symmetri (DS) DNA, så vel som til den GKN1-GKN2 bindingssetet i AGS-EBV-celler. Vi neste spurt om GKN1 eller GKN2 mRNA nivåer ble påvirket av EBV latent infeksjon i AGS celler ved å sammenligne RT-qPCR uttrykk nivåer i AGS forhold til AGS-EBV celler (Figur 4D). Vi fant ut at GKN1 og GKN2 ble undertrykt ~ 3-8 ganger hos AGS-EBV forhold til AGS celler, noe som tyder på at EBV ventetid fremmer eller stabiliserer transcriptional undertrykkelse av GKN1 og GKN2. Figur 3 Karakterisering av EBV genekspresjon i AGS-EBV cellelinjer. AGS, AGS-EBV positive, og EBV-LCLer ble analysert for mRNA uttrykk ved QRT-PCR med primere for EBNA1, BARF0, LMP2A, LMP1, EBNA2, eller EBNA3C, som angitt. Feilfelt angir standardavvik fra middelverdien (SDM) for n = 3.
Figur 4 EBV infeksjon av AGS celler undertrykker GKN1 og GKN2 transkripsjon. (A) Western blot-analyse av EBNA1 protein ekspresjon i AGS-EBV-celler sammenlignet med EBV-negative AGS-celler ble utført ved anvendelse av antistoffet for EBNA1 (øverst) eller Actin (nederst). (B) DNA-kopi-antall ble analysert ved sanntids-PCR av EBV Ori-Lyt-DNA i forhold til nivået av celle GAPDH i AGS, AGS-EBV, og EBV-LCL-celler. (C) chip og real-time PCR-analyse av EBNA1 (røde søyler) eller kontrollere IgG (blå søyler) for DNA-binding på EBV nettsteder inkludert DS og Ori-Lyt, eller cellulært inkludert GKN1 /2 og GAPDH i AGS-EBV celler. (D) RT-PCR ble utført for å analysere mRNA nivået av GKN1 eller GKN2 i AGS (blå søyler) eller AGS-EBV celler (røde søyler). ** Indikerer p < 0,005. Feilfelt angir standardavvik fra middelverdien (SDM) for n = 3.
EBV øker DNA metylering avhengig undertrykkelse av GKN1 og GKN2 mRNA i GC cellelinjer
GKN1 og GKN2 kan være gjenstand for epigenetisk undertrykkelse i GC og vev kulturcellelinjer. For å utforske denne muligheten, vi testet om behandling med DNA demethylating agenten 5 'azacytidin (AZA) eller deacetylering middel (fakke) kombinert med forbolester (TPA) vil aktivere GKN1 eller GKN2 i AGS celler (figur 5A). Vi fant ut at Aza behandling førte til en ~ 10 ganger økning i GKN2, og ~ 4 ganger økning i GKN1 transkripsjon i AGS behandlede celler. I motsetning til dette, NaB /TPA behandlingen produseres kun ~ 2 gangers aktivering av transkripsjon. Disse funnene tyder på at både GKN1 og GKN1 er under aktiv epigenetisk undertrykkelse gjennom DNA-metylering. For å teste om EBV hadde noen effekt på Aza-indusert aktivering av GKN1 eller GKN2, sammenlignet vi effektene av Aza behandling på AGS i forhold til AGS-EBV-celler ved QRT-PCR (figur 5B). Vi fant at GKN1 og GKN2 effektivt ble aktivert ved behandling i Aza AGS-celler, men i mindre grad i AGS-EBV. I disse forsøk ble Aza-indusert aktivering av GKN2 fullstendig eliminert, mens aktivering av GKN1 var bare delvis svekket. Aza-behandling førte også til ~ 8,4 ganger økning i EBNA1 mRNA nivåer, noe som tyder på at Aza behandling stimulerer EBV lytisk genuttrykk i AGS-EBV cellelinjer. Disse resultatene tyder på at EBV genprodukter forhindre GKN2, og i mindre grad GKN1 aktivering etter Aza behandling. Figur 5 EBV forsterker undertrykkelse av GKN1 og GKN2 genuttrykk av DNA metylering. (A) AGS-celler ble behandlet med 10 uM Aza, eller 1 mM NaB og 20 ng /ml TPA i 48 timer og analysert ved RT-PCR for GKN1 eller GKN2 ekspresjonsnivået, sammenlignet med ubehandlede AGS. (B) AGS-celler eller AGS-EBV-celler ble behandlet eller ubehandlet med 10 uM Aza i 48 timer, og deretter assayet for GKN1, GKN2 mRNA, eller EBNA1 mRNA-nivåer. (C) MeDIP analyse av AGS eller AGS-EBV-celler behandlet eller ubehandlet med 10 uM Aza i 48 timer ved forskjellige DNA-regioner av GKN1 og GKN2 loci. (D) MeDIP analyse av AGS eller AGS-EBV celler behandlet eller ubehandlet med 10 mm Aza i 48 timer ved cellulære regioner for alfa globin-2, GAPDH, CDC7, FOXP2, HDAC3, eller MAP3KIP2. (E) Genome posisjon av primere som brukes for GKN1-GKN2 Chip og MeDIP analyser. * Indikerer p < 0,05, ** indikerer p < 0,005. Feilfelt indikert sdm for n = 3.
For bedre å forstå mekanismen av GKN1 og GKN2 epigenetisk undertrykkelse, vi undersøkte DNA metylering nivåer ved hjelp metyl cytosin-spesifikt antistoff rettet DNA immunoprecipitation (MeDIP) analyse. Vi analysert anriking av metylert DNA i GKN1-GKN2 kontrollområdet i AGS og AGS-EBV celler med eller uten Aza behandling (figur 5C). Vi observerte en relativ anrikning av metylert CpG ved et område mellom EBNA1 bindingssetet og GKN2 transkripsjonsstartsetet (GKN2_A). Aza behandling førte til en nedgang i MeDIP signal i de fleste regioner hvor et signal ble oppdaget, noe som tyder på at Aza behandling førte til en generell reduksjon i DNA metylering. Lignende tap av CpG metylering ble observert ved alfa-globin-genet (som ikke binder EBNA1), og ved flere EBNA1 bindingsseter, inkludert HDAC3 og MAP3K7IP (figur 5D). Vi har også registrert at MeDIP signalene var generelt høyere i EBV-AGS enn i AGS celler, noe som tyder på at EBV latent infeksjon kan fremme eller stabilisere DNA metylering hele vertsgenomet.
EBNA1 uttømming aktiverer GNK1 og GKN2 mRNA uttrykk i EBV positive epitelceller
å finne ut om EBNA1 bidratt til transkripsjons undertrykkelse av GKN1 og GKN2, vi først forsøkt å utarme EBNA1 i AGS-EBV celler ved hjelp siRNA (figur 6). Vi ga en siRNA rettet mot 3 'ikke-kodende UTR av EBNA1 mRNA, som delvis utarmet EBNA1 protein i AGS-EBV celler (Figur 6b). Uttømming av EBNA1 resulterte i en ~ 5 gangers aktivering av GKN2, med liten påvisbar aktivering av GKN1 (figur 6A). Disse funnene tyder på at EBNA1 kan fungere som en transcriptional repressor av GKN2 i AGS-EBV celler. Figur 6 siRNA uttømming av EBNA1 forårsaker de-undertrykkelse av GKN1 og GKN2 i AGS-EBV celler. siCtrl eller siEBNA1 transfektert AGS-EBV-celler ble analysert ved RT-PCR for GKN1 eller GKN2 mRNA-nivå i forhold til cellulær GAPDH (A). Celler ble høstet ved 72 timer etter transfeksjon med siRNA. Western blot viser EBNA1 (øverst panel) og lasting kontroll Actin (nedre panel) i AGS-EBV-celler (B). Feilfelt angir standardavvik fra middelverdien (SDM) for n = 3.
EBNA1 hemmer GKN1 og GKN2 transkripsjon etter DNA demetylering
For ytterligere å undersøke bidrag EBNA1 til GKN1 og GKN2 transkripsjon regulering, testet vi effekten av ektopisk uttrykk for EBNA1 alene på Aza-induserte nivåer av GKN1 eller GKN2 transkripsjon i GC-celler. AGS celler ble transduced med en EBNA1 uttrykker lentivirus. Stabil AGS-EBNA1 (PLU-EBNA1) eller AGS- kontroll vektor (PLU-Vec) cellelinjer ble valgt ut og analysert for GKN1 og GKN2 mRNA nivåer. Vi observerte at AGS-EBNA1 cellene hadde en ~ 2-3 ganger høyere basalnivået GKN1 og GKN2 mRNA i forhold til foreldre AGS celler (figur 7a). Men Aza-indusert mRNA nivåer av GKN1 og GKN2 ble svekket i AGS-EBNA1 forhold til AGS celler (figur 7B). Aza behandling førte også til en stor økning i EBNA1 mRNA nivåer (Figur 7C). For å finne ut om effekten av EBNA1 på GKN1 og GKN2 var spesifikke for AGS celler, vi omformet annen EBV negativ GC cellelinje MKN74 med EBNA1 lentivirus (figur 7D-F). I likhet med AGS celler, fant vi at EBNA1 økt basale nivåer av GKN1 og GKN2, men hemmet evne Aza å videre indusere GKN1 og GKN2 mRNA nivåer (Figur 7D og E). Vi bekreftet at Aza-behandlingen var effektiv ved å måle EBNA1 mRNA nivåer, som økte ~ 7 ganger (figur 7F). Disse funnene tyder på at ektopisk uttrykk for EBNA1 kan øke basal, men hemme Aza-indusert nivåer av GKN1 og GKN2 transkripsjon i EBV-negative GC cellelinjer. Figur 7 EBNA1 hemmer GKN1 og GKN2 transkripsjon etter DNA demetylering i GC-celler. (A) AGS celler ble transduced med PLU-Vector (Vec) eller PLU-EBNA1 og deretter ubehandlet (Untr) eller behandlet med 10 mm 5'-azacytidin (Aza) i 48 timer. GKN1 og GKN2 mRNA ble kvantifisert ved QRT-PCR i forhold til GAPDH. (B) Brett induksjon av GKN1 og GKN2 mRNA ved Aza ble kvantifisert fra panelet A. (C) QRT-PCR analyse av EBNA1 mRNA nivåer i AGS celler. (D) Samme som i A, med unntak av anvendelse MKN74 snarere enn AGS-celler. (E) Brett induksjon av GKN1 og GKN2 mRNA kvantifisert fra panel D. (F) QRT-PCR analyse av EBNA1 mRNA nivåer i MKN74 celler. * Indikerer p < 0,05, ** indikerer p < 0,005. Feilfelt indikert sdm for n = 3.
Diskusjon
I denne studien har vi identifisert et high-occupancy EBNA1 bindingssetet i 5 'promotor kontroll-regionen i de divergently transkribert GKN1 og GKN2 gener. EBNA1 bindingssteder ble observert i to uavhengige Chip-Seq datasett fra EBV positive lymfoide BL celler Raji og EBV positiv epitelceller nasopharyngeal carcinoma celler C666-1 (figur 1A). Vi har bekreftet disse bindingssetene ved konvensjonelle chip qPCR i begge cellelinjer (figur 1B og C). EBNA1 ble også vist å binde direkte til disse områdene av EMSA med renset rekombinant EBNA1 DBD protein (figur 1D). Vi viser at GKN1 og GKN2 mRNA-nivåer er sterkt undertrykket i de fleste cellelinjer i forhold til primær gastrisk vev (figur 2). For å studere potensielle rolle EBV og EBNA1 i transkripsjonen kontroll av GKN1 og GKN2, vi generert en EBV positiv AGS gastrisk karsinom cellelinje. Vi viser at EBV inntar en variant type I ventetid mønster i AGS-celler (figur 3), og at EBNA1 kan binde til GKN1 /GKN2 promoter-regionen i den cellulære kromosomet (figur 4C). Vi fant også at GKN1 og GKN2 mRNA ble ytterligere undertrykt i EBV positive AGS celler i forhold til å kontrollere EBV negative AGS celler (Figur 4D). Deretter viste at Aza-behandling førte til økt ekspresjon av GKN1 og GKN2 (figur 5A), og at EBV latent infeksjon inhiberer Aza aktivering av GKN2 (figur 5B). Vi fant at siRNA uttømming av EBNA1 i EBV-positive AGS celler fører til transkripsjonen aktivering av GKN2 (figur 6). Vi viser også at EBNA1 ektopisk uttrykk moderat øker basal, men hemmer Aza-induserte nivåer av GKN1 og GKN2 transkripsjon (figur 7). Samlet utgjør disse funnene tyder på at EBNA1 binder seg til GKN1-GKN2 promoter kontrollområdet i flere celletyper, og øke muligheten for at EBNA1 bidrar til transkripsjons og epigenetisk undertrykkelse av GKN1 og GKN2 tumorsuppressorgener i EBV positiv GC.
EBV latent infeksjon er kjent for å øke tumorgene fenotypen av gastrisk karsinom-celler [29-31]. GKN1 og GKN2 rapporteres å virke som cellevekst-inhibitorer og tumor-suppressorer i GC [20, 21, 23, 25-27]. Våre mRNA expression data som viser høyt nivå mRNA uttrykk bare i primær normal mage vev er i samsvar med en rolle GKN1 og GKN2 som en tumor suppressor. Men vi var ikke i stand til å vise at over-uttrykk for en eller begge GKN1 eller GKN2 i AGS eller AGS-EBV forårsake cellesyklus arrest eller redusere levedyktighet (data ikke vist). Dette tyder på at GKN1 og GKN2 funksjon på tidligere stadier i tumorcelle evolusjon, eller i mer komplekse kreft microenvironments. Vi spekulerer i at EBNA1 kan ha en mer uttalt effekt på GKN1 og GKN2 uttrykk i situasjoner der EBV kan infisere primære mage cellene der basal uttrykk for GKN1 og GKN2 er høy og viktig for svulst undertrykkelse.
Tidligere publiserte studier har vist at GKN1 og GKN2 transkripsjon er underlagt epigenetisk undertrykkelse av DNA metylering i alle former for GC [21]. Våre studier er forenlig med rollen som DNA metylering i epigenetisk undertrykkelse av GKN1 og GKN2 i AGS celler. Behandling med Aza resulterte i 4-10 gangers økning i GKN1 og GKN2 mRNA ekspresjon (figur 5A), og MeDIP avslørte anrikning av metylert DNA ved promotorområdene (figur 5C). AGS-EBV celler gjorde viser en økning i DNA-metylering ved flere cellulære nettsteder, inkludert områder rundt EBNA1 bindingsseter på GKN1 promoter-regionen (figur 5C), og HDAC3 og MAP3K7IP2 gener (Figur 5D). Men den tilstedeværelsen av EBNA1 i AGS-EBV cellene ikke hindre Aza-indusert demetylering på disse stedene. Dette tyder på at EBNA1 kan undertrykke transkripsjon fra enkelte arrangører, som GKN2, gjennom en mekanisme forskjellig fra DNA metylering. Imidlertid ektopisk ekspresjon av EBNA1 alene produserte en mer komplisert fenotype, forårsaker en liten økning i basal ekspresjon, men å begrense effektene av Aza-indusert demetylering (figur 7). Dette kan tyde på at det EBNA1 kan fungere på en annen måte når det uttrykkes ectopically, enn når det uttrykkes i lys av det virale genom. Likevel, våre funn tyder på at EBNA1 perturbs normal transcriptional regulering av GKN1 og GKN2 gener.
Presis funksjon EBNA1 i transkripsjonsregulering er fortsatt uklart. EBNA1 har vært innblandet i den transkripsjonelle aktivering og undertrykkelse av både virale og cellulære gener [32, 33]. EBNA1 kan undertrykke sin egen mRNA-ekspresjon fra den EBV Qp i type III latenstid, hvor undertrykkelse har vært knyttet til sterisk interferens med RNA-polymerase II binding til transkripsjons-initieringssetet [34]. På den annen side kan EBNA1 aktivere Cp og lmp1 promotorer i type III latens hvor det kan virke som en enhancer-lignende faktor [35-37]. EBNA1 har vært implisert i aktivering av transkripsjon noen cellulære gener, inkludert Nox2 gen som er involvert i reaktive oksygenarter formasjon [19]. EBNA1 kan også påvirke vertscelle transkripsjon gjennom en global ombygging av vertskromosomet [38]. Således kan EBNA1 endre cellulær transkripsjon gjennom flere direkte og indirekte mekanismer.
Epigenetiske modifikasjoner er kjent for å spille en viktig rolle i EBV-assosiert gastrisk karsinom [39]. Interessant, AGS celler som bærer EBV bacmid genomer hadde høyere nivåer av denaturert DNA på mange testede områder (Figur 5D). Dette er konsistent med den foreslåtte rolle av EBV i metylering av verten tumorsuppressorgener [40]. Dette er også i overensstemmelse med de funn som EBV positiv GC har forhøyede DNA-metylering ved promotorområdene av flere viktige GC tumor-suppressorer, inkludert gastrokine gener [39, 41-45]. Mens EBNA1 bundet nær DNA denaturert regioner av GKN2, vi klarte ikke å vise at EBNA1 modulerer DNA metylering på GKN1 og GKN2 nettsteder (data ikke vist). Det er imidlertid mulig at EBNA1 i assosiasjon med en annen viral kodet eller indusert faktor kan stabilisere GKN1 og GKN2 transkripsjonen undertrykkelse gjennom en kromatin avhengig og strukturell mekanisme som forsterker DNA-metylering. Det er også mulig at EBNA1 kan regulere GKN1 eller GNK2 bare i vev eller tumor microenvironments som ikke er lett rekapitulert i cellekultur. Mens funksjonen EBNA1 binding til vertscellekromosomet nettsider er fortsatt et viktig område for etterforskningen, kan mer sofistikerte smittemodeller være nødvendig for å belyse sin potensielle rolle i å endre vertscelle genekspresjon og kreftutvikling.
Metoder
celler, plasmider, og lentivirus infeksjon
EBV-positive Burkitt lymfom Raji celler, EBV positiv nasopharyngeal carcinoma C666-1 celler, og magekreft cellelinjer (en gave fra Dr. Antonia R. Sepulveda, Columbia University) inkludert GTL, MKN28, MKN74, SNU638 ble holdt i RPMI inneholdende 10% FBS og supplert med antibiotika (penicillin og streptomycin). Gastrisk karsinom AGS-celler (ATCC-betegnelse CRL-1739) ble holdt i F-12K inneholdende 10% FBS. Primær munnen epitelceller ble gitt av Dr. Manjunatha Benakanakere, University of Pennsylvania og dyrket i keratinocytt-SFM medium. EBV-LCL ble etablert av primær infeksjon av perifere mononukleære blodceller (PBMC) med EBV-BAC-virioner generert fra stimulerte 293-EBV-celler [46, 47]. EBV-LCL inneholder et hygromycin B motstandsdyktig EBV bacmid ble holdt i RPMI inneholdende 10% FBS, hygromycin B (100 ug /ml), Glutamax (Invitrogen), og antibiotika. AGS-EBV-celler ble samlet fra AGS-celler ko-dyrket med EBV-LCL ved å tilpasse en tidligere publisert ko-dyrking metoden beskrevet AGS-celler infeksjon med rEBV gjennom celle-til-celle-kontakt [48] med noen modifikasjoner. I korthet ble EBV-LCL indusert ved 20 ng /ml 12-O
-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) og 1 mM natriumbutyrat (NaB) 24 timer før ko-dyrking. De induserte EBV-LCL-celler ble vasket med PBS to ganger for å fjerne de induserende midler, resuspendert med komplett RPMI-medium ved 10 6 celler /ml før ko-inkubasjon. AGS celler ble sådd ut i 6-brønners plater 24 timer før co-dyrking, deretter 60-70% konfluente AGS celler i 1 ml komplett F-12K medium ble inkubert med 10 6 indusert og vasket EBV-LCL celler i 1 ml komplett RPMI. 24 timer senere ble 2 ml serumfritt F-12K medium tilsatt til hver brønn for å redusere den FBS konsentrasjon til 5% for å forhindre cellevekst. 3 dager etter co-inkubasjon ble EBV-LCL celler fjernet fra co-kulturer og AGS cellene ble grundig vasket med PBS minst 5 ganger for å fjerne noen av donor EBV-LCL celler. De infiserte AGS-celler ble deretter inkubert med frisk F-12K medium med 10% FBS og 100 ug /ml hygromycin B, og seleksjonsmediet ble skiftet hver 2 til 3 dager inntil de infiserte AGS cellene dannet Hyg B seleksjons kolonier med GFP uttrykk (vanligvis 3 til 4 uker etter sam-dyrkning). Seleksjons kolonier ble deretter samlet og testet for ekspresjon EBNA1 og EBV-genom kopiantall før gjenstand for forsøk. AGS-EBV-celler ble holdt i F-12K medium med 10% FBS og 100 ug /ml hygromycin B.
PLU-EBNA1 Lentivirus ekspresjonsvektor ble konstruert ved PCR-amplifisering av EBNA1 med primere (GCGGGATCCTCTGACGAGGGGCCAGGTACAGGACCT og ATCGTCGACTCACTCCTGCCCTTCCTCACCCTCATC) innføring av en 5 ' BamHI og 3 'Sal-setet klonet i ramme til PLU-TCMV-FMCS-pPURO. AGS eller MKN74 celler ble infisert med Lentivirus uttrykker PLU-EBNA1 eller PLU kontroll vektor generert fersk fra 293T celler. Infiserte AGS eller MKN74-celler ble deretter valgt med 2,5 ug /ml puromycin i 10 til 14 dager. De merkede cellene ble slått sammen og behandlet med eller uten 5'-azacytidin i 48 timer og deretter utsatt for RT-PCR.
SiRNA mot EBNA1 og siRNA Control (katalog nr. D-001810-01-20) ble alle innkjøpt fra Dharmacon. siRNA rettet mot EBNA1 3'UTR ble syntetisert ved anvendelse av målsekvensen CGGAGAUGACGGAGAUGAAUU. Transfeksjon av siRNA tomannsboliger ble utført ved hjelp Oligofectamine (Dharmacon), etter produsentens spesifikasjoner.
Chromatin immunoprecipitation (chip) analyser
Chip analysene ble utført som beskrevet tidligere [49]. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Long ikke-kodende RNA uttrykk profil i human magekreft og klinisk significances
• I Silico analyse av mage karsinom Serial analyse av genuttrykk biblioteker avslører ulike profiler tilknyttet ethnicity