EBNA1 binding og epigenetisk regulering af gastrokine tumorsuppressorgener i gastrisk karcinom cells

EBNA1 bindende og epigenetisk regulering af gastrokine tumorsuppressorgener i gastrisk carcinomceller
Abstrakt
Baggrund
Epstein-Barr virus (EBV) latent inficerer ~ 10 % af gastriske carcinomer (GC). Epstein-Barr nukleært antigen 1 (EBNA1) udtrykkes i EBV-associeret GC, og kan binde værts-DNA, hvor det kan påvirke cellulære genregulering. Her viser vi, at EBNA1 binder direkte til DNA opstrøms for divergerende transskriberede GC-specifikke tumorsuppressorgener gastrokine 1 (GKN1) og gastrokine 2 (GKN2).
Metoder
Vi bruger chip-Seq, chip-qPCR, og EMSA til at vise, at EBNA1 binder direkte til GKN1 og GKN2 promotor locus. Vi genererer AGS-EBV, og AGS-EBNA1 cellelinjer at studere virkningerne af EBNA1 på GKN1 og GKN2 mRNA udtryk med eller uden 5 'azacitidin behandling.
Resultater
Vi viser, at gastrokine gener transkriptionelt er bragt til tavshed ved hjælp af DNA methylering . Vi viser også, at latent EBV infektion yderligere reducerer GKN1 og GKN2 udtryk i AGS gastrisk carcinomceller, og at siRNA udtømning af EBNA1 delvis opvejer denne undertrykkelse. Men ektopisk udtryk for EBNA1 steg lidt GKN1 og GKN2 basal mRNA-niveauer, men reduceret deres lydhørhed over for demethyleringsmiddel.
Konklusioner
Disse resultater viser, at EBNA1 binder sig til divergerende promotor af GKN1 og GKN2 gener i GC celler, og foreslå, at EBNA1 bidrager til den komplekse transkriptions- og epigenetisk deregulering af GKN1 og GKN2 tumorsuppressorgener i EBV positiv GC.
Nøgleord
EBV EBNA1 Gastrisk karcinom Gastrokine chip-Seq epigenetisk Indledning
Epstein-Barr virus ( EBV) er et humant gammaherpesvirus findes i en lang række lymfoide og epiteliale celle-maligniteter, herunder Burkitts lymfom, Hodgkins sygdom, nasopharyngeal carcinoma (NPC), og efter transplantation lymfoproliferativ sygdom (oversigt i [1, 2]). For nylig EBV er blevet fundet i ~ 10% af alle gastrisk karcinom (GC) tilfælde verdensplan [3, 4]. EBV-associeret GC har vist sig at være et monoklonalt udvækst af EBV-inficerede gastriske epitelceller og anses for at være et særskilt undertype af GC [5, 6]. Fordi forekomsten af ​​GC er tæt på 900.000 mennesker om året [7], kan EBV-associeret GC være blandt de mest udbredte EBV-associerede kræftformer.
I EBV-positive gastrisk carcinomceller, EBV etablerer en variant type I latens, hvor EBV transkription er begrænset til den kanoniske type i-gener EBNA1, Ebers, BART familie ikke-kodende RNA og miRNA, men med nogle ekstra ekspression af LMP2A [6, 8-11]. Blandt disse latenstid gener, EBNA1 er den eneste viral kerneprotein, der er påvist i EBV-associeret GC. EBNA1 er nødvendig for etableringen af ​​den latente episomale infektion og for overlevelsen af ​​latent inficerede celler [12-15] langsigtet. EBNA1 er et DNA-bindende protein, som binder til både virale og værtens kromosomale steder. Bindingsstederne i det virale genom er blevet karakteriseret for væsentlige funktioner i replikation og transkriptionel kontrol af viral genekspression. Imidlertid er funktionen af ​​EBNA1 sekvensspecifik binding til værtskromosomet mindre godt forstået. Mens EBNA1 kan binde til promotoren regioner på tværs værtsgener er det uklart, om disse gener er underkastet EBNA1 regulering [12, 16, 17]. Overekspression af EBNA1 DNA-bindende domæne, der fungerer som en dominant negativ i EBV-inficerede celler, kan inhibere levedygtighed celle i ikke-inficerede celler, hvilket antyder, at EBNA1 binder til og regulerer cellulære gener er vigtige for cellens overlevelse [18]. Ektopisk ekspression af EBNA1 har vist sig at bevirke værtscelle-mRNA-ekspression [19], men det er ikke klart, om disse effekter er direkte eller indirekte forbundet med specifikke EBNA1 bindingssteder i det cellulære genom.
I en tidligere undersøgelse anvendte vi Chip-seq metoder til at analysere de genom-dækkende berigelse steder af EBNA1 i latent inficerede Raji Burkitts lymfom celler og identificeret adskillige cellulære steder bundet af EBNA1 [17]. Blandt disse EBNA1 cellulær berigelse websteder vi identificeret en betydelig EBNA1 bindende top placeret på gastrokine 1 (GKN1) og gastrokine 2 (GKN2, også kendt som trefoil-faktor interagerende protein (TFIZ1)) gen-klyngen. GKN1 og GKN2 er blevet identificeret på grundlag af deres hyppige tab af udtryk i neoplastiske gastrisk karcinom epitelceller, sammenlignet med normal gastrisk væv [20-22] (revideret i [23]). Adskillige nylige undersøgelser har beskrevet antiproliferativ og anti-invasiv aktivitet for GKN1 i gastriske epitelceller, som sammen med den hyppige udtryk tab i cancer, tyder det fungerer som tumorsuppressor specifikke for gastrisk epitel [21, 24-28]. GKN1 kan inhibere cellemigrering og invasion i sårheling, transwell og Matrigel assay, samt ændre cellemarkører forbundet med epitel-mesenkymale overgang [26]. GKN1 og GKN2 gener er placeret i umiddelbar nærhed og transskriberet i modsatte retninger, hvilket tyder på, at de sandsynligvis deler et tovejs promotor, og er underlagt koordinere regulering ved delt transskription regulatoriske faktorer (revideret i [23]).
I denne undersøgelse, vi demonstrerede den direkte binding mellem EBNA1 og GKN1-GKN2 loci og undersøgt GKN1 og GKN2 genekspression modulation af EBV infektion og EBNA1 protein. Vores resultater tyder på, at EBV infektion yderligere kan hæmme GKN1 og GKN2 udtryk, og at tab af EBNA1 kan lette epigenetiske de-repression af GKN2 transskription. Vi observerede også forhøjet DNA methylering niveauer GKN1 og GKN2 promotorområder, og en potentiel rolle for EBNA1 i deregulering og epigenetisk undertrykkelse af denne tumor suppressor locus.
Resultater
Identifikation af en høj belægningsprocent EBNA1 bindingssted på GKN1 -GKN2 locus af Chip-Seq
Tidligere offentliggjorte chip-Seq data fra Raji BL celler afslørede et begrænset antal højt beriget EBNA1 bindingssteder baseret på peak scoringer og læse tal [17]. Yderligere inspektion afslørede en stærk EBNA1 bindingssted placeret opstrøms for start-sites for de divergerende transskriberede GKN1 og GKN2 gener (figur 1A, øvre spor). En lignende EBNA1 bindende top blev observeret i et separat chip-Seq forsøg udført i EBV positiv nasopharyngeal carcinom cellelinie C666-1 (fuld chip-seq data, der skal offentliggøres andetsteds), hvilket indikerer, at denne binding forekommer både epitel, samt lymfoid celletyper (figur 1A, lavere spor). I midten af ​​toppen var placeret ~ 5 kb fra GKN2 og ~ 15 kb fra GKN1 transcription start sites. Chip-qPCR blev brugt til at validere EBNA1 bindende på GKN1-GKN2 promoter region i både Raji og C666-1 celler (Figur 1B og C). qPCR indikerede, at EBNA1 bundet til GKN1-2 site med samme effektivitet til en tidligere valideret EBNA1-bindingssted på PITPNB promotor. qPCR anførte også, at EBNA1 binding til GKN1-GKN2 var specifik, da der ikke var nogen påviselig EBNA1 bindende på enten den cellulære GAPDH locus eller EBV OriLyt kontrol regioner, som forventet (figur 1B og C). Den formodede EBNA1 bindingssted på GKN1-GKN2 locus blev identificeret ved linie med konsensus bindingssted i EBV familie af gentagelser (FR) region, og denne sekvens blev derefter testet for direkte binding til EBNA1 af EMSA (Figur 1D). Oprenset rekombinant EBNA1 DBD-protein blev analyseret for binding til prober indeholdende GKN1-GKN2 stedet (GKN1 /2), FR, eller en negativ kontrol, der mangler en konsensus EBNA1 bindingssted. Vi fandt, at EBNA1 DBD bundet effektivt til GKN1-GKN2 site, samt til FR konsensus, men bandt ikke til kontrolsekvensen. Disse resultater tyder på, at EBNA1 interagerer med GKN1-GKN2 promoter regionen gennem direkte DNA-bindende med EBNA1 DBD. Figur 1 EBNA1 binder på GKN1 og GKN2 promotor locus. (A) The UCSC genom browser blev anvendt til at kortlægge EBNA1 bindende peak genereret fra Raji og C666-1 chip-seq på GKN1 og GKN2 gen loci. RefSeq kommenteret udskrifter er angivet nedenfor chip-Seq højdepunkt. (BC) Realtime-PCR validering af chip-seq data for EBNA1 bindingssted på GKN1 /2 delt promoter region: EBNA1 (røde søjler) eller kontrol IgG (blå søjler) blev analyseret af Chip i Raji (B) eller C666-1 celler (C) til DNA binding på GKN1 /2 site, PITPNB promotor, GAPDH, eller EBV Ori-Lyt. (D) EMSA analyse af 32P mærkede prober indeholdende Kontrol, GKN1 /2 site, eller EBV FR. Varierende mængde EBNA1 DBD-protein blev anvendt i bindingsreaktion (0, 100, 300, 900 ng). Pilespidser repræsenterer EBNA1-specifikke bundne komplekser eller fri probe som angivet. Sonden sekvens af GKN1 /2 websted og FR er angivet med sekvens homolog (røde bogstaver) mellem GKN1 /2 og FR. Den negative kontrol (Ctrl) sekvens er også vist. Fejl søjler indikerer standardafvigelse fra middelværdien (SDM) for n = 3.
GKN1 og GKN2 mRNA er højt udtrykt i primær mave væv næste
Vi målte GKN1 eller GKN2 mRNA-niveauer i forskellige gastrisk karcinom cellelinjer og i primære normal gastrisk væv ved QRT-PCR (figur 2). Vi fandt, at GKN1 og GKN2 udtrykkes i meget højere niveauer (~ 3 × 10 4 gange) i den primære mave væv end i nogen af ​​de testede (figur 2A) cellelinier. Selvom på meget lavere niveauer end primær mave væv, GKN1 og GKN2 blev begge udtrykt ved målelige niveauer i AGS gastrisk karcinom cellelinjer, med GKN2 udtrykt ved højere niveauer end alle andre GC cellelinjer, eller EBV positiv B-celle eller NPC cellelinjer ( Figur 2B). kunne påvises meget lave niveauer af GKN1 eller GKN2 i primær oral epitelvæv, hvilket yderligere indikerer, at disse gener er specifikke for primær gastrisk væv. Figur 2 GKN1 og GKN2 mRNA stærkt udtrykt i primær mave væv. RT-PCR blev udført for at analysere mRNA-niveauet af GKN1 (blå søjler) eller GKN2 (røde søjler) i forskellige cellelinjer, herunder GC-afledte GTL, MKN28, MKN74, SNU638, AGS, BL-afledt Raji, EBV immortaliserede LCL, EBV positiv NPC line C666-1 eller primær munden epitelceller sammenligner med (A) eller uden (B) primære mave væv. Fejl søjler indikerer standardafvigelse fra middelværdien (SDM) for n = 3.
EBV latency reducerer GKN1 og GKN2 mRNA-ekspression i GC cellelinjer
For at teste effekten af ​​EBV latent infektion på GKN1 og GKN2 udtryk, genereret vi en AGS-cellelinie indeholdende EBV B95.8 bacmid. AGS cellelinjen blev udvalgt til hygromycinresistens og GFP positivitet at sikre, at det indeholdt bacmid komponenter. At karakterisere AGS-EBV-cellelinie, vi først analyseret EBV genekspression mønster (figur 3). Vi fandt, at AGS-EBV celler udtrykte detekterbare mRNA-niveauer af EBNA1, BARF0, og LMP2A, men ikke LMP1, EBNA2, eller EBNA3C (figur 3). Selvom EBV B95.8 bacmid mangler BART miRNA, disse resultater er i overensstemmelse med AGS-EBV celler vedtage en variant type I latens genekspression program med nogle udtryk for LMP2A, ligner den, der observeres i EBV positiv gastrisk karcinom tumorvæv [8, 10 ]. For yderligere at karakterisere AGS-EBV-celler, analyserede vi EBNA1-proteinekspression ved Western blot (figur 4A) og EBV DNA kopiantal ved qPCR (figur 4B). EBNA1 blev detekteret som en enkelt lav tæthed arter ved den forventede molekylmasse (figur 4A). EBV kopiantal blev målt ved at sammenligne EBV Ori-Lyt DNA til cellulær GAPDH (Figur 4B). Vi fandt, at AGS-EBV indeholdt ~ 50% færre kopier af det virale genom i forhold til EBV-positive LCLS. For at bestemme om EBNA1 bevaret sin DNA-bindingsaktivitet i AGS-EBV, udførte vi konventionelle chip assays (figur 4C). Vi fandt, at EBNA1 bundet til EBV dyadesymmetri (DS) DNA, samt til GKN1-GKN2 bindingssted i AGS-EBV-celler. Vi næste spurgt, om GKN1 eller GKN2 mRNA niveauer blev påvirket af EBV latent infektion i AGS celler ved at sammenligne RT-qPCR ekspressionsniveauerne i AGS forhold til AGS-EBV-celler (Figur 4D). Vi fandt, at GKN1 og GKN2 blev undertrykt ~ 3-8 gange i AGS-EBV forhold til AGS celler, hvilket antyder, at EBV latency fremmer eller stabiliserer transkriptionelle undertrykkelse af GKN1 og GKN2. Figur 3 Karakterisering af EBV genekspression i AGS-EBV cellelinier. AGS, AGS-EBV positiv, og EBV-LCLS blev analyseret for mRNA-ekspression ved QRT-PCR med primere for EBNA1, BARF0, LMP2A, LMP1, EBNA2, eller EBNA3C, som angivet. Fejl søjler indikerer standardafvigelse fra middelværdien (SDM) for n = 3.
Figur 4 EBV infektion af AGS celler undertrykker GKN1 og GKN2 transskription. (A) Western blot-analyse af EBNA1 proteinekspression i AGS-EBV-celler sammenlignet med EBV-negative AGS celler blev udført under anvendelse af antistof for EBNA1 (øverst) eller Actin (nederst). (B) DNA kopital blev analyseret ved realtids-PCR af EBV Ori-Lyt DNA i forhold til niveauet af cellulær GAPDH i AGS, AGS-EBV, og EBV-LCL-celler. (C) chip og real-time PCR-analyse af EBNA1 (røde søjler) eller kontrol IgG (blå søjler) for DNA-binding på EBV sites herunder DS og Ori-Lyt, eller cellulære steder, herunder GKN1 /2 og GAPDH i AGS-EBV celler. (D) RT-PCR blev udført for at analysere mRNA-niveauet af GKN1 eller GKN2 i AGS (blå søjler) eller AGS-EBV-celler (røde søjler). ** Angiver p < 0,005. Fejl søjler indikerer standardafvigelse fra middelværdien (SDM) for n = 3.
EBV øger DNA methylering afhængig undertrykkelse af GKN1 og GKN2 mRNA i GC cellelinjer
GKN1 og GKN2 kan være genstand for epigenetisk undertrykkelse i GC og væv kultur cellelinier. For at udforske denne mulighed, testede vi, om behandling med DNA demethyleringsmiddel 5'azacytidin (Aza) eller deacetylering middel (NaB) kombineret med phorbolester (TPA) ville aktivere GKN1 eller GKN2 i AGS celler (figur 5A). Vi fandt, at Aza behandling førte til en ~ 10 gange stigning i GKN2, og ~ 4 gange stigning i GKN1 transkription i AGS-behandlede celler. I modsætning hertil NaB /TPA behandling produceres kun ~ 2 gange aktivering af transkription. Disse resultater tyder på, at både GKN1 og GKN1 er under aktiv epigenetisk undertrykkelse gennem DNA methylering. For at teste om EBV haft nogen effekt på Aza induceret aktivering af GKN1 eller GKN2, vi sammenlignede virkningerne af Aza behandling på AGS forhold til AGS-EBV celler ved QRT-PCR (figur 5B). Vi fandt, at GKN1 og GKN2 effektivt blev aktiveret ved Aza behandling i AGS celler, men i mindre grad i AGS-EBV. I disse eksperimenter blev Aza-induceret aktivering af GKN2 fuldstændig fjernet, mens aktivering af GKN1 blev kun delvist svækket. Aza-behandling også ført til ~ 8,4 gange stigning i EBNA1 mRNA-niveauer, hvilket antyder, at Aza behandling stimulerer EBV lytisk genekspression i AGS-EBV cellelinier. Disse resultater tyder på EBV-genprodukter forhindrer GKN2, og i mindre grad GKN1 aktivering efter Aza behandling. Figur 5 EBV forstærker undertrykkelsen af ​​GKN1 og GKN2 genekspression ved DNA methylering. (A) AGS-celler blev behandlet med 10 pM Aza, eller 1 mM NaB og 20 ng /ml TPA i 48 timer og analyseret ved RT-PCR for GKN1 eller GKN2 ekspressionsniveau sammenlignet med ubehandlede AGS. (B) AGS celler eller AGS-EBV-celler blev behandlet og ubehandlet med 10 pM Aza i 48 timer og derefter analyseret for GKN1, GKN2 mRNA eller EBNA1-mRNA-niveauer. (C) MeDIP assay af AGS eller AGS-EBV-celler behandlet eller ubehandlet med 10 pM Aza i 48 timer ved forskellige DNA regioner GKN1 og GKN2 loci. (D) MeDIP assay af AGS eller AGS-EBV-celler behandlet eller ubehandlet med 10 pM Aza i 48 timer ved cellulære regioner for alpha globin-2, GAPDH, CDC7, FOXP2, HDAC3, eller MAP3KIP2. (E) Genome stilling primere anvendt til GKN1-GKN2 chip og MeDIP assays. * Angiver p < 0,05, ** angiver p < 0,005. Fejl barer indiceret SDM for n = 3.
For bedre at forstå den mekanisme af GKN1 og GKN2 epigenetiske undertrykkelse, vi undersøgte DNA methylering niveauer ved hjælp af methyl cytosin-specifikt antistof rettet DNA immunopræcipitation (MeDIP) assay. Vi analyseret berigelsen af ​​methyleret DNA i GKN1-GKN2 kontrolregion i AGS og AGS-EBV-celler med eller uden Aza behandling (figur 5C). Vi observerede en relativ berigelse af methyleret CpG ved et område mellem EBNA1 bindingssted og GKN2 transkriptionsstartstedet (GKN2_A). Aza behandling førte til et fald i MeDIP signal i de fleste regioner, hvor et signal blev registreret, hvilket tyder på, at Aza behandling førte til en generel reduktion i DNA-methylering. Tilsvarende tab af CpG-methylering blev observeret i alfa-globin genet (som ikke binder EBNA1), og på flere EBNA1 bindingssteder, herunder HDAC3 og MAP3K7IP (figur 5D). Vi bemærkede også, at MeDIP signaler var generelt højere i EBV-AGS end i AGS celler, hvilket tyder på, at EBV latent infektion kan fremme eller stabilisere DNA methylering hele værtsgenomet.
EBNA1 udtømning aktiverer GNK1 og GKN2 mRNA-ekspression i EBV-positive epitelceller
at bestemme om EBNA1 bidrog til transkriptionel repression af GKN1 og GKN2, vi først forsøgte at nedbryder EBNA1 i AGS-EBV celler under anvendelse siRNA (figur 6). Vi genererede et siRNA rettet mod 3'-ikke-kodende UTR af EBNA1 mRNA, som delvis depleteret EBNA1-protein i AGS-EBV-celler (figur 6B). Udtømning af EBNA1 resulterede i en ~ 5 gange aktivering af GKN2, med ringe påviselig aktivering af GKN1 (figur 6A). Disse resultater antyder, at EBNA1 kan fungere som en transkriptionel repressor af GKN2 i AGS-EBV-celler. Figur 6 siRNA udtømning af EBNA1 forårsager de-undertrykkelse af GKN1 og GKN2 i AGS-EBV celler. siCtrl eller siEBNA1 transficerede AGS-EBV-celler blev analyseret ved RT-PCR for GKN1 eller GKN2 mRNA niveau i forhold til cellulær GAPDH (A). Celler blev høstet ved 72 timer efter transfektion med siRNA. Western blot, der viser EBNA1 (øverste felt) og ladningskontrol actin (nedre panel) i AGS-EBV-celler (B). Fejl søjler indikerer standardafvigelse fra middelværdien (SDM) for n = 3.
EBNA1 hæmmer GKN1 og GKN2 transskription efter DNA demethylering
For yderligere at udforske bidrag EBNA1 til GKN1 og GKN2 transskription regulering, vi testede effekten af ektopisk ekspression af EBNA1 alene på Aza-inducerede niveauer af GKN1 eller GKN2 transkription i GC-celler. AGS-celler blev transduceret med en EBNA1 udtrykker lentivirus. Stabil AGS-EBNA1 (PLU-EBNA1) eller AGS- kontrolvektor (PLU-Vec) cellelinier blev selekteret og analyseret for GKN1 og GKN2 mRNA-niveauer. Vi observerede, at AGS-EBNA1 celler havde en ~ 2-3 gange højere basalt GKN1 og GKN2 mRNA i forhold til parentale AGS celler (figur 7A). Imidlertid Aza-inducerede mRNA niveauer af GKN1 og GKN2 blev svækket i AGS-EBNA1 sammenlignet med AGS celler (figur 7B). Aza behandling også ført til en stor stigning i EBNA1 mRNA-niveauer (Figur 7C). For at bestemme om virkningen af ​​EBNA1 på GKN1 og GKN2 var specifikke for AGS celler, vi transduceres anden EBV negative GC cellelinie MKN74 med EBNA1 lentivirus (figur 7D-F). Svarende til AGS celler, fandt vi, at EBNA1 forøgede basale niveauer af GKN1 og GKN2, men inhiberede evne Aza til yderligere inducere GKN1 og GKN2 mRNA-niveauer (figur 7D og E). Vi bekræftede, at Aza-behandlingen var effektiv ved at måle EBNA1 mRNA niveauer, der steg ~ 7 gange (figur 7F). Disse resultater antyder, at ektopisk ekspression af EBNA1 kan øge basal, men inhiberer Aza-inducerede niveauer af GKN1 og GKN2 transkription i EBV-negative GC cellelinier. Figur 7 EBNA1 inhiberer GKN1 og GKN2 transkription efter DNA demethylering i GC-celler. (A) AGS celler blev transduceret med PLU-Vector (Vec) eller PLU-EBNA1 og derefter ubehandlet (Untr) eller behandlet med 10 pM 5'-azacytidin (Aza) i 48 timer. GKN1 og GKN2 mRNA blev kvantificeret ved QRT-PCR forhold til GAPDH. (B) Fold induktion af GKN1 og GKN2 mRNA ved Aza blev kvantificeret fra panelet A. (C) QRT-PCR-analyse af EBNA1 mRNA-niveauer i AGS celler. (D) Samme som i A, bortset fra anvendelse af MKN74 stedet AGS celler. (E) Fold induktion af GKN1 og GKN2 mRNA kvantificeret fra panelet D. (F) QRT-PCR-analyse af EBNA1 mRNA-niveauer i MKN74 celler. * Angiver p < 0,05, ** angiver p < 0,005. Fejlsøjler indiceret SDM for n = 3.
Diskussion
I denne undersøgelse identificerede vi en høj belægning EBNA1 bindingssted i 5'-promotoren kontrolregion af de divergerende transskriberede GKN1 og GKN2 gener. EBNA1-bindingssteder blev observeret i to uafhængige chip-Seq datasæt fra EBV-positive lymfoide BL celler Raji og EBV positiv epiteliale nasopharyngeal carcinomceller C666-1 (figur 1A). Vi bekræftede disse bindingssteder ved traditionel chip-qPCR i begge cellelinier (figur 1B og C). EBNA1 blev også vist sig at binde direkte til disse steder efter EMSA med renset rekombinant EBNA1 DBD-protein (figur 1 D). Vi viser, at GKN1 og GKN2 mRNA-niveauer er stærkt undertrykt i de fleste cellelinjer forhold til primær gastrisk væv (figur 2). For at undersøge den potentielle rolle for EBV og EBNA1 i transkriptionel kontrol af GKN1 og GKN2, genereret vi en EBV positiv AGS gastrisk carcinom cellelinie. Vi viser, at EBV vedtager en variant type I latens mønster i AGS celler (figur 3), og at EBNA1 kan binde til GKN1 /GKN2 promotorregionen i det cellulære kromosom (figur 4C). Vi fandt også, at GKN1 og GKN2 mRNA blev yderligere undertrykt i EBV-positive AGS celler i forhold til at kontrollere EBV negative AGS celler (Figur 4D). Vi derefter viste at Aza-behandling førte til stigningen ekspression af GKN1 og GKN2 (figur 5A), og at EBV latent infektion inhiberer Aza aktivering af GKN2 (figur 5B). Vi fandt, at siRNA udtømning af EBNA1 i EBV-positive AGS celler fører til transkription aktivering af GKN2 (figur 6). Vi viser også, at EBNA1 ektopisk ekspression moderat forøger basal, men hæmmer Aza-inducerede niveauer af GKN1 og GKN2 transkription (figur 7). Tilsammen disse resultater viser, at EBNA1 binder til GKN1-GKN2 promotor kontrol region i flere celletyper, og hæve den mulighed, at EBNA1 bidrager til transkriptionelle og epigenetisk undertrykkelse af GKN1 og GKN2 tumorsuppressorgener i EBV positiv GC.
EBV latent infektion er kendt for at øge tumorigene fænotype af gastriske carcinomaceller [29-31]. GKN1 og GKN2 er rapporteret at fungere som celle vækst inhibitorer og tumor undertrykkere i GC [20, 21, 23, 25-27]. Vores mRNA udtryk data, der viser højt niveau mRNA-ekspression kun i den primære normal gastrisk væv er i overensstemmelse med en rolle GKN1 og GKN2 som en tumor suppressor. Men vi var i stand til at vise, at overekspression af den ene eller begge GKN1 eller GKN2 i AGS eller AGS-EBV forårsage en cellecyklus arrest eller reducere levedygtigheden (data ikke vist). Dette antyder, at GKN1 og GKN2 funktion på tidligere stadier i tumorceller evolution, eller i mere komplekse tumor mikromiljøer. Vi spekulere at EBNA1 kan have en mere udtalt effekt på GKN1 og GKN2 udtryk i situationer, hvor EBV kan inficere primære gastriske celler, hvor basal udtryk for GKN1 og GKN2 er høje og vigtige for tumor undertrykkelse.
Tidligere offentliggjorte undersøgelser har vist, at GKN1 og GKN2 transkription er underlagt epigenetiske suppression af DNA-methylering i alle former for GC [21]. Vores undersøgelser er i overensstemmelse med den rolle, DNA methylering i epigenetiske undertrykkelse af GKN1 og GKN2 i AGS celler. Behandling med Aza resulterede i gange stigning i GKN1 og GKN2 mRNA-ekspression (figur 5A) 4-10, og MeDIP afslørede berigelse af methyleret DNA ved promotorregionerne (figur 5C). AGS-EBV celler gjorde viser en stigning i DNA-methylering på flere cellulære steder, herunder regioner omgiver EBNA1 bindingssteder på GKN1 promotor-regionen (figur 5C), og HDAC3 og MAP3K7IP2 generne (figur 5D). Men tilstedeværelsen af ​​EBNA1 i AGS-EBV-celler ikke til hinder Aza-induceret demethylering på disse steder. Dette antyder, at EBNA1 kan undertrykke transkription fra visse promotorer, som GKN2, via en mekanisme forskellig fra DNA-methylering. Men ektopisk ekspression af EBNA1 alene gav en mere kompliceret fænotype, hvilket medfører en lille stigning i basal ekspression, men begrænse virkningerne af Aza-induceret demethylering (figur 7). Dette kan tyde på, at denne EBNA1 kan fungere anderledes, når de udtrykkes ektopisk, end når det udtrykkes i forbindelse med det virale genom. Ikke desto mindre er vores resultater tyder på, at EBNA1 forstyrrer den normale transkriptionelle regulering af GKN1 og GKN2 generne.
Den nøjagtige funktion af EBNA1 i transskription regulering fortsat uklart. EBNA1 er blevet impliceret i den transskriptionelle aktivering og undertrykkelse af både virale og cellulære gener [32, 33]. EBNA1 kan undertrykke sit eget mRNA ekspression fra EBV Qp i type III latenstid, hvor undertrykkelse er blevet forbundet med sterisk interferens med RNA-polymerase II-binding til transkriptionsinitieringsstedet [34]. På den anden side kan EBNA1 aktivere Cp og LMP1 promotorer i type III latens, hvor det kan fungere som en enhancer-lignende faktor [35-37]. EBNA1 er blevet impliceret i transcription aktivering af nogle cellulære gener, herunder Nox2 gen involveret i dannelsen reaktive oxygenarter [19]. EBNA1 kan også påvirke værtscelle transkription gennem et globalt ombygning af værtskromosomet [38]. Således kan EBNA1 ændre cellulær transskription gennem flere direkte og indirekte mekanismer.
Epigenetisk modifikationer er kendt for at spille en vigtig rolle i EBV-associeret gastrisk carcinom [39]. Interessant, AGS celler, som bærer EBV bacmid genomer havde højere niveauer af denatureret DNA på mange testede sites (Figur 5D). Dette stemmer overens med den foreslåede rolle EBV i methylering af værten tumorsuppressorgener [40]. Dette er også i overensstemmelse med resultaterne, at EBV positiv GC har forhøjede DNA methylering på promotorområder af flere vigtige GC tumorsuppressorer, herunder gastrokine gener [39, 41-45]. Mens EBNA1 bundet nær DNA methylerede regioner i GKN2, vi var ude af stand til at vise, at EBNA1 modulerer DNA methylering på GKN1 og GKN2 sites (data ikke vist). Det er imidlertid muligt, at EBNA1 i association med et andet viralt kodede eller induceret faktor kan stabilisere GKN1 og GKN2 transkriptionel repression via en chromatin-afhængig og strukturel mekanisme, der styrker DNA-methylering. Det er også muligt, at EBNA1 kan regulere GKN1 eller GNK2 kun i vævs- eller tumor mikromiljøer, som ikke let sammenfattet i cellekultur. Mens funktionen af ​​EBNA1 binding til værtscellekromosomet sites er fortsat et vigtigt område af undersøgelse, kan mere avancerede infektion modeller være forpligtet til at belyse sin potentielle rolle i at ændre værtscelle genekspression og carcinogenese.
Metoder
Cells, plasmider, og lentivirus infektion
EBV-positive Burkitts lymfom Raji celler, EBV positiv nasopharyngeal carcinoma C666-1 celler, og gastrisk karcinom cellelinjer (en gave fra Dr. Antonia R. Sepulveda, Columbia University), herunder GTL, MKN28, MKN74, SNU638 blev opretholdt i RPMI indeholdende 10% FBS og suppleret med antibiotika (penicillin og streptomycin). Gastriske carcinoma AGS celler (ATCC No. CRL 1739) blev opretholdt i F-12K indeholdende 10% FBS. Primær munden epitelceller blev leveret af Dr. Manjunatha Benakanakere, University of Pennsylvania og dyrket i keratinocyt-SFM medium. EBV-LCL blev etableret af primær infektion af mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) med EBV BAC virioner genereret fra stimulerede 293-EBV-celler [46, 47]. EBV-LCL indeholder et hygromycin B-resistent EBV bacmid blev opretholdt i RPMI indeholdende 10% FBS, hygromycin B (100 ug /ml), glutamax (Invitrogen), og antibiotika. AGS-EBV-celler blev frembragt fra AGS celler co-dyrket med EBV-LCL ved at tilpasse en tidligere publiceret samdyrkning beskrevet AGS celler infektion med rEBV gennem celle-til-celle-kontakt [48] med nogle ændringer. Kort fortalt blev EBV-LCL induceret af 20 ng /ml 12-O
tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) og 1 mM natriumbutyrat (NaB) 24 timer før co-dyrkning. De inducerede EBV-LCL-celler blev vasket med PBS to gange helt at fjerne inducerende midler, resuspenderet med komplet RPMI-medium ved 10 6 celler /ml før co-inkubation. AGS-celler blev udpladet i 6-brønds plader 24 timer før samdyrkning end 60 - 70% konfluerende AGS celler i 1 ml komplet F-12K-medium blev inkuberet med 10 6 inducerede og vaskede EBV-LCL-celler i 1 ml komplet RPMI. 24 timer senere blev 2 ml serumfrit F-12K-medium tilsat til hver brønd for at reducere FBS koncentration til 5% for at forhindre celle overvækst. 3 dage efter co-inkubering blev EBV-LCL celler fjernet fra co-kulturer og AGS cellerne blev vasket grundigt med PBS mindst 5 gange for at fjerne nogen af ​​donor- EBV-LCL-celler. De inficerede AGS-celler blev derefter inkuberet med frisk F-12K-medium med 10% FBS og 100 pg /ml hygromycin B og selektionsmediet blev skiftet hver 2. til 3. dag, indtil de inficerede AGS celler dannet Hyg B udvælgelse kolonier med GFP-ekspression (sædvanligvis 3 til 4 uger efter co-dyrkning). Udvælgelseskriterier kolonier blev derefter samlet og testet for EBNA1 udtryk og EBV genom kopi nummer før underlagt eksperimenter. AGS-EBV-celler blev holdt i F-12K-medium med 10% FBS og 100 ug /ml hygromycin B.
PLU-EBNA1 lentivirus ekspressionsvektor blev konstrueret ved PCR-amplifikation af EBNA1 med primere (GCGGGATCCTCTGACGAGGGGCCAGGTACAGGACCT og ATCGTCGACTCACTCCTGCCCTTCCTCACCCTCATC) at indføre en 5' BamH i og 3 'Sal i-sted klones i ramme til PLU-TCMV-FOC-pPURO. AGS eller MKN74 celler blev inficeret med lentivirus udtrykker PLU-EBNA1 eller PLU styrevektor genereret frisk fra 293T-celler. Inficerede AGS eller MKN74 celler blev derefter selekteret med 2,5 ug /ml puromycin for 10 til 14 dage. De udvalgte celler blev samlet og behandlet med eller uden 5'-azacytidin i 48 timer derefter underkastet RT-PCR.
SiRNA mod EBNA1 og siRNA kontrol (katalog nr. D-001810-01-20) blev alle anskaffet fra Dharmacon. siRNA rettet mod EBNA1 3'UTR blev syntetiseret under anvendelse målsekvensen CGGAGAUGACGGAGAUGAAUU. Transfektion af siRNA-duplexer blev udført ved anvendelse Oligofectamine (Dharmacon) efter fabrikantens specifikationer.
Chromatin immunoprecipitation (chip) assays
chip assays blev udført som tidligere [49] beskrevne. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Lange ikke-kodende RNA-ekspression profil i human gastrisk cancer og dens kliniske betydninger
• I Silico analyse af gastrisk karcinom Serial Analyse af genekspression biblioteker afslører forskellige profiler, der er forbundet med etnicitet