EBNA1 kötő és epigenetikai szabályozása gastrokine tumorszuppresszor gének gyomor karcinóma cells

EBNA1 kötő és epigenetikai szabályozása gastrokine tumorszuppresszor gének gyomor karcinóma sejteket
Abstract
alapon
Epstein-Barr-vírus (EBV) látensen fertőz ~ 10 % a gyomor karcinómák (GC). Epstein-Barr nukleáris antigén 1 (EBNA1) van kifejezve EBV-vel összefüggő GC, és képes megkötni gazda DNS, ahol hatással lehet celluláris gén szabályozás. Itt megmutatjuk, hogy EBNA1 közvetlenül kötődik a DNS elé a távolodó átírt GC-specifikus tumor szupresszor gének gastrokine 1 (GKN1) és gastrokine 2 (GKN2). Katalógusa Módszerek katalógusa használjuk ChIP-Seq, chip-qPCR, és az EMSA annak bizonyítására, hogy EBNA1 kötődik közvetlenül a GKN1 és GKN2 promoter locus. Generáljuk AGS-EBV, és AGS-EBNA1 sejtvonalak hatását vizsgáljuk EBNA1 a GKN1 és GKN2 mRNS expresszió vagy anélkül 5 'azacitidin kezelést. Katalógusa Eredmények
Megmutatjuk, hogy gastrokine gének transzkripciós szinten elhallgattatta DNS metiláció . Azt is mutatják, hogy a látens EBV-fertőzés tovább csökkenti GKN1 és GKN2 expresszió AGS gyomor karcinóma sejteket, és hogy az siRNS kimerülése EBNA1 részlegesen enyhíti ezt elnyomás. Azonban ectopiás expresszióját EBNA1 kissé emelkedett GKN1 és GKN2 bazális mRNS szinteket, de csökkent a fogékonyság demetilációs ügynök. Katalógusa Következtetések katalógusa Ezek az eredmények azt mutatják, hogy EBNA1 kötődik az eltérő promotere GKN1 és GKN2 gének GC sejtekben, és azt sugallják, hogy EBNA1 hozzájárul a komplex transzkripciós és epigenetikai dereguláció a GKN1 és GKN2 tumorszuppresszor gének EBV pozitív GC.
kulcsszavak
EBV EBNA1 gyomor karcinóma Gastrokine chIP-Seq epigenetikai Bevezetés
Epstein-Barr vírus ( EBV) egy humán gammaherpesvirus talált széles körű limfoid és epiteliális sejtek rosszindulatú folyamatok, köztük a Burkitt-limfóma, Hodgkin-kór, orr-garat karcinóma (NPC), és transzplantáció utáni limfoproliferatív betegség (áttekintve [1, 2]). Újabban, az EBV találtak ~ 10% -a az összes gyomor karcinóma (GC) esetek világszerte [3, 4]. EBV-vel összefüggő GC kimutatták, hogy egy monoklonális kinövés EBV-fertőzött gyomor epiteliális sejtekben, és van úgy, hogy egy különálló altípusa GC [5, 6]. Mivel az előfordulása GC közel van a 900.000 ember évente [7], EBV-vel összefüggő GC lehet a leginkább elterjedt EBV-vel összefüggő daganatok.
EBV pozitív gyomor karcinóma sejtek, EBV létrehozza a variáns I. típusú késleltetés, ahol EBV transzkripció korlátozódik a kanonikus I. típusú gének EBNA1, Ebers, Bart család nem kódoló RNS-t és miRNS-ek, de néhány további expresszióját LMP2A [6, 8-11]. Ezek közül a látencia gének EBNA1 az egyetlen virális nukleáris protein, amely kimutatható a EBV-asszociált GC. EBNA1 szükséges a létesítmény a látens episzomális fertőzés és a hosszú távú túlélés látensen fertőzött sejtek [12-15]. EBNA1 egy DNS-kötő fehérje, amely kötődik mind a virális és gazdasejt kromoszomális oldalakon. A kötőhelyek a virális genom már jellemzett nélkülözhetetlen funkcióinak a replikációban és transzkripciós szabályozása virális génexpresszió. Azonban, a funkció a EBNA1 szekvencia-specifikus kötődés a gazda kromoszóma kevésbé értenek. Míg EBNA1 képes kötődni a promoter régióhoz több fogadó gének, nem világos, hogy ezek a gének vannak kitéve EBNA1 szabályozás [12, 16, 17]. Overexpressziója a EBNA1 DNS-kötő domén, amely működik, mint egy domináns negatív EBV-fertőzött sejtek, képes gátolni a sejtek életképességét nem fertőzött sejtekben, ami arra utal, hogy a EBNA1 kötődik, és szabályozza a celluláris gének fontosak a sejt túlélését [18]. Méhen kívüli expressziója EBNA1 kimutatták, hogy hatása gazdasejt mRNS expresszióját [19], de ez nem világos, hogy ezek a hatások a közvetlen vagy közvetett kapcsolatban specifikus EBNA1 kötőhelyek a sejt genomjába.
Egy korábbi vizsgálatban, használtuk chip azt követő oldalak módszerek elemzésére genomot dúsító helyek EBNA1 a látensen fertőzött Raji Burkitt limfóma sejtek és azonosított számos celluláris oldalakat köti EBNA1 [17]. Azok között, EBNA1 celluláris dúsítás oldalakat azonosítottunk egy jelentős EBNA1 kötő csúcs található, a gastrokine 1 (GKN1) és gastrokine 2 (GKN2, más néven lóhere faktor kölcsönhatásba lépő protein (TFIZ1)) gén klaszter. GKN1 és GKN2 azonosítottak alapján gyakori expressziójának elvesztése neoplasztikus gyomor karcinóma hámsejtek, összehasonlítva a normál gasztrikus szövet [20-22] (áttekintve [23]). A közelmúltban számos tanulmány leírt anti-proliferatív és anti-invazív aktivitás GKN1 gyomor epiteliális sejtek, amelyek együtt gyakori expresszió elvesztése a rák, azt sugallja, úgy működik, mint a tumor szuppresszor specifikus gyomornyálkahártya [21, 24-28]. GKN1 képes gátolni a sejtek migrációját és invázióját a sebgyógyulásban, transwell és Matrigel-vizsgálat, valamint az Alter sejt markerek társított epithelialis-mesenchymalis átalakulás [26]. GKN1 és GKN2 gének található közel és átírt ellenkező irányba, ami arra utal, hogy valószínűleg megosztani egy kétirányú promoter, és azokra koordinálására szabályozás közös transzkripciós szabályozó faktorok (összefoglalva [23]). Ebben katalógusa tanulmányban bemutattuk a közvetlen kötődés között EBNA1 és GKN1-GKN2 loci és vizsgálták GKN1 és GKN2 génexpresszió moduláció EBV fertőzés és EBNA1 fehérje. Eredményeink arra utalnak, hogy az EBV fertőzés tovább gátolja GKN1 és GKN2 kifejezés, és hogy a veszteség EBNA1 megkönnyítheti epigenetikai de-elnyomása GKN2 átírás. Azt is megfigyelték, emelkedett a DNS metiláció szinten GKN1 és GKN2 promóter régiók, valamint a potenciális szerepét EBNA1 a dereguláció és epigenetikus represszió e tumor szupresszor locus. Katalógusa eredményei katalógusa azonosítása magas kihasználtsági EBNA1 kötőhely a GKN1 -GKN2 locus chip-szekvencia
korábban közzétett chIP-Seq adatait Raji BL sejteket vizsgálva korlátozott számú magasan dúsított EBNA1 kötőhelyek alapján csúcs pontszámok és olvasni a számokat. [17] További vizsgálat kimutatta, erős EBNA1 kötőhely fölött elhelyezkedő starthelyeként a távolodó átírt GKN1 és GKN2 gének (1A, felső sáv). Egy hasonló EBNA1 kötő csúcs volt megfigyelhető egy külön chip Seq kísérletet végezzük EBV pozitív nazofaringeális karcinóma sejtvonal C666-1 (teljes lapka SEQ adatok közzétett máshol), jelezve, hogy ez a kötés fordul elő mindkét epitheliális, valamint limfoid sejttípus (1A, alsó sáv). A központ a csúcs volt található ~ 5 kb-GKN2 és ~ 15 kb a GKN1 transzkripciós start oldalak. A Chip-qPCR használtunk, hogy érvényesítse a EBNA1 kötő a GKN1-GKN2 promoter régióban mindkét Raji és C666-1-sejtek (1B és C). qPCR jelezte, hogy EBNA1 kötve GKN1-2 oldal hasonló hatékonysággal egy validált EBNA1-kötőhely a PITPNB promoter. qPCR is jelezte, hogy EBNA1 kötődését GKN1-GKN2 specifikus volt, mivel nem volt kimutatható EBNA1 kötő akár a celluláris GAPDH lókusz vagy EBV OriLyt szabályozó régiók, a várt (1B és C). A feltételezett EBNA1 kötőhely a GKN1-GKN2 lókuszt azonosítottunk a beállítást egy konszenzus kötőhely az EBV család ismétlések (FR) régió, és ezt a szekvencia azután vizsgáljuk a direkt kötődik EBNA1 az EMSA (1D ábra). Tisztított rekombináns EBNA1 DBD fehérjét megvizsgáltuk kötődés szondák tartalmazó GKN1-GKN2 helyén (GKN1 /2), FR, vagy egy negatív kontroll szekvenciát, amelyből hiányzik a konszenzus EBNA1 kötőhely. Azt találtuk, hogy EBNA1 DBD kötődik hatékonyan a GKN1-GKN2 helyén, valamint az FR konszenzus, de nem kötődnek a kontroll szekvenciához. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy EBNA1 kölcsönhatásba GKN1-GKN2 promoter régió közvetlen DNS-kötő a EBNA1 DBD. 1. ábra EBNA1 kötődik a GKN1 és GKN2 promoter locus. (A) A UCSC genom böngésző által használt térkép EBNA1 kötelező csúcs keletkezett Raji és C666-1 chip azt követő pontjai, a GKN1 és GKN2 génlokuszok. RefSeq annotált átiratok alábbiakban olvashatók a chip-Seq csúcs. (BC) Valós idejű PCR validálása chip SEQ adatok EBNA1 kötőhely a GKN1 /2 megosztott promoter régiót: EBNA1 (piros oszlopok) vagy kontroll IgG-t (kék oszlopok) vizsgáltunk által chip Raji (B) vagy C666-1 sejteket (C) DNS-kötő a GKN1 /2 helyén, PITPNB promoter, GAPDH, vagy EBV Ori-Lyt. (D) EMSA elemzése 32P jelzett próbák tartalmazó Ellenőrző GKN1 /2 oldalon, vagy EBV FR. Változó mennyiségű EBNA1 DBD fehérjét használtuk kötési reakció (0, 100, 300, 900 ng). Nyílhegyek képviseli EBNA1 specifikus kötött komplexek vagy a szabad próba jelzett. A szonda szekvenciája GKN1 /2 oldalon, és FR jelzi szekvencia homológ (piros betűkkel) között GKN1 /2 és FR. A negatív kontroll (Ctrl) szekvenciát is jelzi. A hibahatárok mutatják szórás az átlagtól (SDM) n = 3
GKN1 és GKN2 mRNS erősen expresszálódik primer gyomor szöveti
Mi következő mért GKN1 vagy GKN2 mRNS-szintje a különböző gyomor karcinóma sejtvonalak és primer normál gyomor szöveteinek qRT-PCR (2. ábra). Azt találtuk, hogy GKN1 és GKN2 vannak kifejezve jóval magasabb szinten (~ 3 × 10 4-szeres) a primer gyomor szövetben, mint bármelyik vizsgált sejtvonalban (2A ábra). Bár sokkal alacsonyabb szinten, mint a primer gyomor szövetek, GKN1 és GKN2 mindketten expresszálódik mérhető szinten AGS gyomor karcinóma sejtvonalakban, azzal GKN2 kifejezve magasabb szinten, mint az összes többi GC sejtvonalak, vagy EBV-pozitív B-sejtes vagy NPC-sejtvonalak ( 2B ábra). Nagyon alacsony GKN1 vagy GKN2 volt kimutatható primer orális hámszövet, továbbá azt jelzi, hogy ezek a gének specifikus primer gyomor-szövetben. 2. ábra GKN1 és GKN2 mRNS erősen expresszálódik primer gyomor szövetben. RT-PCR-t végeztünk, hogy elemezze a mRNS szintjén GKN1 (kék oszlopok) vagy GKN2 (piros oszlopok) különböző sejtvonalakban, beleértve a GC-eredetű GTL, MKN28, MKN74, SNU638, AGS, BL-eredetű Raji, EBV immortalizált LCL, EBV pozitív NPC vonal C666-1, vagy primer száj hámsejtek összehasonlítva (a) vagy anélkül (B) primer gyomor szövetet. A hibahatárok mutatják szórás az átlagtól (SDM) n = 3
EBV látencia csökkenti GKN1 és GKN2 mRNS expresszió GC sejt vonalak
hatásának vizsgálatára az EBV látens fertőzés GKN1 és GKN2 kifejezés, mi generált egy AGS sejtvonal tartalmazó EBV B95.8 bacmid. A AGS sejtvonalat választottunk a higromicin rezisztencia és GFP-pozitivitás annak biztosítása érdekében, hogy benne bacmid alkatrészeket. Jellemezni AGS-EBV sejtvonal, először analizáltuk a EBV génexpressziós mintázat (3. ábra). Azt találtuk, hogy az AGS-EBV sejtek expresszálták kimutatható mRNS szintje EBNA1, BARF0, és LMP2A, de nem LMP1, EBNA2, vagy EBNA3C (3. ábra). Bár EBV B95.8 bacmid hiányzik a BART miRNS, ezek az eredmények összhangban vannak AGS-EBV sejtek elfogadásáról változat I. típusú látens gén kifejeződése program néhány kifejezése LMP2A, hasonlóan megfigyelhető EBV pozitív gyomorrák tumorszövetben [8, 10 ]. Ahhoz, hogy tovább jellemezzük az AGS-EBV-sejtek, elemeztük EBNA1 fehérje expresszió Western-blot (4a ábra), és az EBV-DNS kópiaszámának qPCR (4b ábra). EBNA1 volt kimutatható, mint egy alacsony bőség fajok a várt molekulatömeg (4a ábra). EBV kópiaszám mértük összehasonlításával EBV Ori-Lyt DNS a celluláris GAPDH (4b ábra). Azt találtuk, hogy az AGS-EBV tartalmazott ~ 50% -kal kevesebb példányban a virális genom összehasonlítva EBV pozitív LCL. Annak eldöntésére, hogy EBNA1 megőrizte DNS-kötő aktivitást AGS-EBV végeztünk hagyományos ChIP vizsgálatok (4C). Azt találtuk, hogy EBNA1 kötődik az EBV diád Symmetry (DS) DNS-t, valamint a GKN1-GKN2 kötőhely AGS-EBV sejteket. Mi a következő kérdés, hogy GKN1 vagy GKN2 mRNS szinteket érinti EBV látens fertőzés AGS sejtek összehasonlításával RT-qPCR expressziós szinteket AGS képest AGS-EBV sejtek (ábra 4D). Azt találtuk, hogy GKN1 és GKN2 voltak elnyomott ~ 3-8 szorosára AGS-EBV képest AGS sejteket, ami arra utal, hogy az EBV látencia elősegíti vagy stabilizálja a transzkripciós elnyomása GKN1 és GKN2. 3. ábra jellemzése EBV génexpresszió AGS-EBV sejtvonalakban. AGS, AGS-EBV pozitív, és az EBV-LCL megvizsgáljuk mRNS-expresszió által QRT-PCR primerekkel az EBNA1, BARF0, LMP2A, LMP1, EBNA2, vagy EBNA3C, ahogy jelezzük. Hiba sávok jelzik szórás az átlagtól (SDM) n = 3 katalógusa 4. ábra EBV fertőzés AGS sejtek elnyomja GKN1 és GKN2 átírás. (A) Western-blot-analízise EBNA1 protein expresszió AGS-EBV sejtek összehasonlítva EBV-negatív AGS sejtek alkalmazásával végeztük antitest EBNA1 (felső) vagy Aktin (alul). (B) DNS kópiaszámát úgy vizsgáltuk, valós idejű PCR-EBV Ori-Lyt DNS szinthez viszonyítva a celluláris GAPDH AGS, AGS-EBV, és az EBV-LCL sejteket. (C) chip és a valós idejű PCR analízise EBNA1 (piros oszlopok) vagy kontroll IgG-t (kék oszlopok) DNS-kötő a EBV telek beleértve DS és Ori-Lyt vagy celláshoz helyek, köztük GKN1 /2 és GAPDH az AGS-EBV sejtekben. (D) RT-PCR-t végeztünk, hogy elemezze a mRNS szintjén GKN1 vagy GKN2 AGS (kék oszlopok) vagy AGS-EBV sejteket (vörös oszlopok). ** Jelzi p < 0,005. Hiba sávok jelzik szórás az átlagtól (SDM) n = 3 katalógusa EBV növeli a DNS metiláció függő elnyomását GKN1 és GKN2 mRNS GC sejtvonalak katalógusa GKN1 és GKN2 tárgya lehet epigenetikus elnyomás GC és szövetek sejtvonalak. Ennek a lehetőségnek, megvizsgáltuk, hogy a kezelés a DNS-sel demetilező ügynök 5 'azacitidin (AZA) vagy dezacetilezzük szert (NaB) kombinált forbol-észtert (TPA) lenne aktiválni GKN1 vagy GKN2 AGS sejtekben (5A ábra). Azt találtuk, hogy Aza kezelés vezetett egy ~ 10-szeres növekedést GKN2, és ~ 4 szeres növekedést GKN1 transzkripciót AGS kezelt sejtekben. Ezzel ellentétben, NaB /TPA kezelés termelt csak ~ 2-szeres átírás aktiválását. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy mind GKN1 és GKN1 alatt aktív epigenetikus represszió a DNS metiláció. Annak ellenőrzésére, hogy az EBV volt semmilyen hatása Aza indukált aktiválását GKN1 vagy GKN2, összehasonlítottuk a hatását Aza kezelés AGS képest AGS-EBV sejtek qRT-PCR (5B). Azt találtuk, hogy GKN1 és GKN2 voltak hatékonyan aktiválják Aza kezelés AGS sejtekben, de kisebb mértékben az AGS-EBV. Ezekben a kísérletekben, Aza-indukált aktiválását GKN2 teljesen megszűnt, míg aktiválása GKN1 csak részben gyengített. Aza-kezelés is vezetett a ~ 8,4-szeres növekedést EBNA1 mRNS szintek, ami arra utal, hogy Aza stimulálja az EBV litikus génexpresszió AGS-EBV sejtvonalak. Ezek az eredmények arra utalnak, az EBV-géntermékek megakadályozzák GKN2, és kisebb mértékben a GKN1 aktiválás után Aza kezelést. 5. ábra EBV erősíti elnyomása GKN1 és GKN2 génexpresszió DNS metiláció. (A) AGS sejteket kezeltünk 10 jiM aza-, vagy 1 mM NaB és 20 ng /ml TPA-t 48 órán keresztül, és analizáltuk RT-PCR GKN1 vagy GKN2 expressziós szintje, összehasonlítva a kezeletlen AGS. (B) AGS sejtek vagy AGS-EBV sejteket kezelt vagy kezeletlen, 10 uM Aza 48 órán át, majd megvizsgáljuk GKN1, GKN2 mRNS, vagy EBNA1 mRNS szinteket. (C) MEDIP assay AGS vagy AGS-EBV sejtek kezelt vagy kezeletlen, 10 uM Aza 48 órán át különböző DNS régiók GKN1 és GKN2 lókuszok. (D) MEDIP assay AGS vagy AGS-EBV sejtek kezelt vagy kezeletlen, 10 uM Aza 48 órán át celluláris régiók alfa-globin-2, GAPDH, CDC7, FOXP2, HDAC3, vagy MAP3KIP2. (E) Genome helyzete alkalmazott primerek GKN1-GKN2 chip és MEDIP vizsgálatokban. * Azt jelzi, p < 0,05, ** p jelzi < 0,005. Hiba sávok jelzett SDM az n = 3 katalógusa Hogy jobban megértsék a mechanizmus a GKN1 és GKN2 epigenetikus represszió, megvizsgáltuk a DNS-metilációs szintek segítségével metil-citozin-specifikus ellenanyag DNS immunprecipitáció (MEDIP) vizsgálattal. Mi megvizsgáljuk a dúsítási metilezett DNS-t a GKN1-GKN2 kontroll régió AGS AGS-EBV sejtek vagy anélkül Aza kezelés (5C). Megfigyeltük relatív dúsítására metilezett CpG egy régió közötti EBNA1 kötőhelyet és GKN2 transzkripciós starthelyet (GKN2_A). Aza-kezelés eredményeként csökkent a MEDIP jel a legtöbb régióban, ahol a jel nem volt detektálható, ami arra utal, hogy Aza-kezelés eredményeként általános csökkenése a DNS metiláció. Hasonló elvesztése CpG metiláció volt megfigyelhető az alfa-globin gént (amely nem kötődik EBNA1), és több EBNA1 kötőhelyek, beleértve HDAC3 és MAP3K7IP (5D ábra). Azt is megjegyezte, hogy MEDIP jelek általában magasabbak voltak az EBV-AGS, mint AGS sejtekben, ami arra utal, hogy az EBV látens fertőzés elősegítik vagy stabilizálják a DNS metiláció az egész gazda genomba.
EBNA1 kimerülése aktiválja GNK1 és GKN2 mRNS expresszió EBV pozitív hámsejtek
Annak meghatározásához, hogy EBNA1 hozzájárult a transzkripciós elnyomása GKN1 és GKN2, először megpróbálta lebontó EBNA1 AGS-EBV sejtekben siRNS (6. ábra). Mi generált siRNS célzási 3 'nem-kódoló UTR EBNA1 mRNS, amely részben kimerült EBNA1 fehérje AGS-EBV sejtek (6B). Kiürülése EBNA1 eredményezett ~ 5-ször aktiválását GKN2, kevés kimutatható aktiválását GKN1 (6a ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy EBNA1 működhet egy transzkripciós represszor GKN2 AGS-EBV sejteket. 6. ábra siRNS kimerülése EBNA1 okozza de-elnyomás a GKN1 és GKN2 AGS-EBV sejteket. siCtrl vagy siEBNA1 transzfektált AGS-EBV sejteket vizsgáltuk RT-PCR GKN1 vagy GKN2 mRNS szintje viszonyítva celluláris GAPDH (A). A sejteket 72 órával a transzfekció siRNS-sel. Western-blot mutatja EBNA1 (felső panel), és terhelési kontrollként aktin (alsó panel) AGS-EBV-sejtek (B). Hiba sávok jelzik szórás az átlagtól (SDM) n = 3 katalógusa EBNA1 gátolja GKN1 és GKN2 átírás után a DNS demetilációja katalógusa hogy tovább vizsgálja a hozzájárulását EBNA1 a GKN1 és GKN2 transzkripciós szabályozás hatását vizsgáltuk a méhen kívüli kifejezése EBNA1 egyedül Aza-indukált szintjét GKN1 vagy GKN2 transzkripció GC sejtekben. AGS sejteket transzdukált egy EBNA1 expresszáló lentivírus. Stabil AGS-EBNA1 (PLU-EBNA1) vagy AGS- kontroll vektorral (PLU-Vec) sejtvonalat választottunk ki, és vizsgáljuk a GKN1 és GKN2 mRNS szinteket. Megfigyeltük, hogy az AGS-EBNA1 sejteknek ~ 2-3 szor nagyobb alapszintű GKN1 és GKN2 mRNS relatív szülői AGS sejtek (7A). Azonban Aza-indukált mRNS szintje GKN1 és GKN2 arra legyengített AGS-EBNA1 összehasonlítva AGS sejtek (7B ábra). Aza kezelés is vezetett jelentős növekedése EBNA1 mRNS szintek (ábra 7C). Annak meghatározására, hogy a hatásait EBNA1 a GKN1 és GKN2 voltak specifikusak AGS sejtek, mi transzdukált másik EBV negatív GC sejtvonal MKN74 azzal EBNA1 lentivírus (ábra 7D-F). Hasonló a AGS sejtek, azt találtuk, hogy EBNA1 fokozott bazális szintek GKN1 és GKN2, de gátolta a képességét, AZA további indukáló GKN1 és GKN2 mRNS-szintek (ábra 7D és E). Azt megerősítette, hogy Aza-kezelés hatásos volt mérésével EBNA1 mRNS-szint, ami növelte ~ 7 szeres (ábra 7F). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a méhen kívüli kifejezése EBNA1 növelheti a bazális, de gátolja Aza-indukált szintjét GKN1 és GKN2 transzkripció EBV-negatív GC sejtvonalak. 7. ábra EBNA1 gátolja GKN1 és GKN2 átírás után a DNS demetiláció GC sejtekben. (A) AGS sejteket transzdukált PLU-Vektor (VEC), vagy Plu-EBNA1 majd kezeletlen (Untr) vagy a kezelt 10 uM 5'-azacitidin (AZA) 48 órán keresztül. GKN1 és GKN2 mRNS mennyiségét qRT-PCR képest GAPDH. (B) Az indukció a GKN1 és GKN2 mRNS Aza mennyiségileg származó panel A. (C) QRT-PCR elemzését EBNA1 mRNS-szintjét a AGS sejtekben. (D) Ugyanaz, mint az A, azzal az eltéréssel, MKN74 helyett AGS sejteket. (E) Az indukció a GKN1 és GKN2 mRNS mennyiségileg származó panel D. (F) QRT-PCR elemzését EBNA1 mRNS-szintjét a MKN74 sejtekben. * Azt jelzi, p < 0,05, ** p jelzi < 0,005. Hiba sávok jelzett SDM az n = 3.
Megbeszélés
Ebben a vizsgálatban, azonosítottunk egy magas kihasználtsági EBNA1 kötőhelyet az 5 'promoter szabályozó régió a széttartóan átírt GKN1 és GKN2 géneket. EBNA1 kötőhelyek észleltek két független chip szekvencia adathalmazok EBV pozitív limfoid sejtek BL Raji és EBV pozitív epiteliális karcinóma sejteket nasopharyngeal C666-1 (1A). Mi megerősítették ezeket kötőhelyek hagyományos pehelyszerű qPCR mindkét sejtvonalban (1B és C). EBNA1 is kimutatták, hogy kötődik közvetlenül ezeken az oldalakon az EMSA tisztított rekombináns EBNA1 DBD protein (1D). Megmutatjuk, hogy GKN1 és GKN2 mRNS szintek nagymértékben elnyomják a legtöbb sejtvonal képest primer gyomor szöveti (2. ábra). Ahhoz, hogy tanulmányozzuk a lehetséges szerepét EBV és EBNA1 a transzkripciós szabályozása GKN1 és GKN2 generáltunk egy EBV pozitív AGS gyomor karcinóma sejtvonal. Megmutatjuk, hogy az EBV fogad egy variáns I. típusú látens minta AGS sejtekben (3. ábra), és hogy a EBNA1 kötődhet a GKN1 /GKN2 promoter régió a celluláris kromoszóma (4C). Azt is megállapították, hogy GKN1 és GKN2 mRNS tovább elnyomott EBV pozitív AGS sejtek a kontrollhoz viszonyítva EBV negatív AGS sejtek (ábra 4D). Ezután azt mutatta, hogy Aza-kezelés eredményeként a növekedés kifejezése GKN1 és GKN2 (5A ábra), és az EBV látens fertőzés gátolja Aza aktiválását GKN2 (5B). Azt találtuk, hogy az siRNS kimerülése EBNA1 EBV pozitív AGS sejtek vezet transzkripciós aktiválását GKN2 (6. ábra). Azt is mutatják, hogy a EBNA1 ektopikus expresszió mérsékelten növeli a bazális, de gátolja az Aza-indukált szintjét GKN1 és GKN2 transzkripció (7. ábra). Mindent összevetve, ezek a megállapítások jelzik, hogy EBNA1 kötődik a GKN1-GKN2 promoter szabályozó régió több sejttípus, és felvetik annak a lehetőségét, hogy a EBNA1 hozzájárul a transzkripciós és epigenetikai elnyomás a GKN1 és GKN2 tumorszuppresszor gének EBV pozitív GC.
EBV látens fertőzés ismert, hogy növeli a tumorigenikus fenotípus gyomorrák sejtek [29-31]. GKN1 és GKN2 jelentik, hogy működni sejtnövekedés inhibitorok és tumorszuppresszorok GC [20, 21, 23, 25-27]. A mRNS-expresszió mutató adatok magas szintű mRNS expresszió csak az elsődleges normál gyomor szöveti összhangban vannak a szerepe GKN1 és GKN2 mint egy tumor szupresszor. Azonban nem tudtuk mutatni, hogy a túlzott expressziója egyik vagy mindkét GKN1 vagy GKN2 AGS vagy AGS-EBV okozhat sejtciklus vagy csökkentésére életképességét (az adatokat nem mutatjuk be). Ez azt sugallja, hogy GKN1 és GKN2 funkció korábbi szakaszaiban tumorsejt evolúció, vagy komplexebb tumor mikrokörnyezet. Úgy gondoljuk, hogy EBNA1 lehet egy kifejezettebb hatása GKN1 és GKN2 kifejezés olyan helyzetekben, amikor az EBV megfertőzheti primer gyomor sejtekben, ahol a bazális expressziója GKN1 és GKN2 magasak, és fontos a tumorszuppressziónak.
Előző közzétett tanulmányok kimutatták, hogy GKN1 és GKN2 transzkripció alá epigenetikus elnyomása DNS metiláció minden formája GC [21]. A tanulmányok összhangban vannak a szerepe a DNS metiláció az epigenetikus elnyomása GKN1 és GKN2 AGS sejtekben. Kezelés Aza eredményezte 4-10-szeres növekedést GKN1 és GKN2 mRNS expresszióját (5A ábra), és MEDIP kiderült gazdagítása denaturált DNS a promoter régiók (5C). AGS-EBV sejtek nem mutatnak fokozott DNS-metiláció több celluláris helyek, beleértve régiókat körülvevő EBNA1 kötőhelyek a GKN1 promoter régió (5C) és az HDAC3 és MAP3K7IP2 gének (5D ábra). Ugyanakkor a jelen EBNA1 AGS-EBV sejtek nem akadályozza Aza indukált demetilációja ezeken a helyszíneken. Ez azt sugallja, hogy EBNA1 lehet elnyomják a transzkripciót néhány promoterek, mint például a GKN2 keresztül eltérő mechanizmus a DNS metiláció. Azonban ectopiás expresszióját EBNA1 önmagában is egy bonyolultabb fenotípus, ami kisebb mértékben a bazális kifejezés, de korlátozó hatásait Aza-indukált demetilációja (7. ábra). Ez arra utalhat, hogy az említett EBNA1 működhet másképp kifejezve ektopikusan, mint amikor kifejezve összefüggésben a virális genomban. Mindazonáltal, eredményeink arra utalnak, hogy EBNA1 megzavarja a normális transzkripciós szabályozása GKN1 és GKN2 gének.
A pontos funkciója EBNA1 a transzkripciós szabályozásban nem tisztázott. EBNA1 hozták összefüggésbe a transzkripciós aktiválását és elnyomása mind virális és celluláris gének [32, 33]. EBNA1 képes elnyomni a saját mRNS expresszió a EBV Qp a III típusú látencia, ahol elnyomás összefüggésbe hozták a sztérikus interferencia RNS-polimeráz-II kötődését a transzkripciós iniciációs hely [34]. Másrészt, EBNA1 aktiválhatja Cp és LMP1 promóterek III típusú látencia ahol működhet egy enhanszer-szerű faktor [35-37]. EBNA1 szerepet játszik a transzkripció aktiválását néhány celluláris gén, beleértve a NOX2 gén részt vesz a reaktív oxigéngyökök képződése [19]. EBNA1 is hatással lehet gazdasejt átírás, a globális átrendeződése, a gazda kromoszómán [38]. Így EBNA1 megváltoztathatja celluláris transzkripciós révén több közvetlen és közvetett mechanizmusok.
Epigenetikai módosítások ismertek játszanak fontos szerepet EBV-vel összefüggő gyomor karcinóma [39]. Érdekes, AGS hordozó sejtek EBV bacmid genomok nagyobb volt a denaturált DNS-sok megvizsgált helyszínek (5D ábra). Ez összhangban áll a javasolt szerepét EBV a metilezése fogadó tumorszuppresszor gének [40]. Ez is összhangban van a megállapítást, hogy az EBV pozitív GC emelte a DNS metiláció promóter régiójában több kulcsfontosságú GC tumor szupresszor, beleértve gastrokine gének [39, 41-45]. Míg EBNA1 kötött közel DNS metilezett régióiban a GKN2 nem tudtuk bizonyítani, hogy EBNA1 modulálja a DNS metilezése a GKN1 és GKN2 oldalak (az adatokat nem mutatjuk). Azonban lehetséges, hogy EBNA1 társítva egy másik vírus által kódolt vagy indukált faktor stabilizálására GKN1 és GKN2 transzkripciós elnyomás keresztül egy kromatin-függő és a strukturális mechanizmus, amely megerősíti a DNS metiláció. Az is lehetséges, hogy EBNA1 szabályozhatják GKN1 vagy GNK2 csak szövet vagy tumor mikrokörnyezetet, amelyek nem könnyen összefoglalt sejttenyészetben. Míg a funkciója EBNA1 kötődés gazdasejt kromoszóma oldalak továbbra is fontos kutatási terület, kifinomultabb fertőzési modell lehet szükség, hogy tisztázzák potenciális szerepe megváltoztatásával gazdasejt génexpresszió és kialakulásában. Katalógusa Methods katalógusa Cells, plazmidok, és lentivírus fertőzés katalógusa EBV-pozitív Burkitt limfóma Raji sejtek, EBV pozitív nasopharingealis karcinóma C666-1 sejteket és gyomor karcinóma sejtvonalat (ajándék Dr. Antonia R. Sepulveda, Columbia University), beleértve a GTL, MKN28, MKN74, SNU638 RPMI, amely 10% FBS-t és antibiotikumokkal kiegészített (penicillin és streptomicin). Gyomor karcinóma AGS-sejtek (ATCC No. CRL-1739) tartottunk fenn in F-12K, amely 10% FBS-t. Elsődleges száj epitheliumsejt melyet Dr. Manjunatha Benakanakere, University of Pennsylvania és tenyésztett Keratinocyte-SFM közegben. EBV-LCL hozták létre az elsődleges fertőzés perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC) EBV BAC virionok generált stimulált 293-EBV-sejtek [46, 47]. EBV-LCL tartalmaz higromicin B rezisztens EBV bacmid RPMI 10% FBS tartalmú, higromicin B (100 ng /ml), Glutamax (Invitrogen), és antibiotikumokat. AGS-EBV sejteket generált AGS sejteket együtt tenyésztettük az EBV-LCL adaptálásával egy korábban publikált együtt-tenyésztéssel leírt módszer AGS sejtek fertőzése rEBV keresztül sejt-sejt érintkezés [48], néhány módosítással. Röviden, az EBV-LCL váltottuk ki 20 ng /ml 12-O
-tetradecanoylphorbol-13-acetát (TPA) és 1 mM nátrium-butiráttal (NaB) előtt 24 órával együtt-tenyésztéssel. Az indukált EBV-LCL sejteket PBS-sel mostuk kétszer teljesen eltávolítani a indukáló szereket, újra felszuszpendáltuk komplett RPMI közegben 10 6 sejt /ml, mielőtt a ko-inkubáció. AGS sejteket szélesztettünk 6 lyukas lemezeken 24 óráig, mielőtt együtt tenyésztést, majd 60-70% -ban összefolyt AGS sejteket 1 ml teljes F-12K közegben inkubáltuk 10 6 indukált és a mosott EBV-LCL sejteket 1 ml komplett RPMI. 24 órával később 2 ml szérummentes F-12K tápközeget adunk az egyes üregekhez, hogy csökkentsék a FBS koncentráció 5% -ra, hogy megakadályozzák sejt elszaporodását. 3 nap után co-inkubáció, EBV-LCL sejteket eltávolítjuk a ko-tenyészetekben és az AGS sejteket alaposan mostuk PBS-sel, legalább 5-ször, hogy eltávolítsa a a donor EBV-LCL sejteket. A fertőzött AGS sejteket ezután inkubáltuk friss F-12K tápközegben, amely 10% FBS-sel és 100 ng /ml higromicin B és a szelekciós táptalajra cseréltük minden 2-3 napig, amíg a fertőzött AGS kialakult sejtek Hyg B kiválasztás telepeket GFP expresszió (rendszerint 3-4 hét után co-termesztés). A kiválasztási kolóniákat ezután összeöntöttük, és teszteltük EBNA1 expresszió és az EBV genom másolat számát, mielőtt alá kísérletek. AGS-EBV sejteket tartottunk fenn F-12K tápközegben, amely 10% FBS-sel és 100 ng /ml higromicin B-
Plu-EBNA1 lentivírus expressziós vektort szerkesztettünk PCR-amplifikációjával EBNA1 primerekkel (GCGGGATCCTCTGACGAGGGGCCAGGTACAGGACCT és ATCGTCGACTCACTCCTGCCCTTCCTCACCCTCATC) bevezetésével egy 5 ' BamHI és 3 'Sall helyet leolvasási keretben kiónozzuk PLU-TCMV-FMC-pPURO. AGS vagy MKN74 sejteket fertőztünk lentivírus expresszáló Plu-EBNA1 vagy Plu kontroll vektorral generált frissen származó 293T-sejtek. Fertőzött AGS vagy MKN74 sejteket ezután kiválasztott 2,5 ug /ml puromicin 10-től 14 napig. A kiválasztott sejteket összegyűjtöttük és a kezelt vagy anélkül 5'-azacitidin 48 órán át, majd vetjük alá az RT-PCR.
Elleni siRNS EBNA1 és siRNS-szabályozás (Cat. No. D-001810-01-20) mind vásárolt Dharmacon. siRNS ellen irányul EBNA1 3'UTR alkalmazásával szintetizáltuk a célszekvenciával CGGAGAUGACGGAGAUGAAUU. Transzfekció siRNS duplexek végezte alkalmazásával Oligofectamine (Dharmacon), következő gyártók leírások.
Kromatin immunprecipitáció (chip) vizsgálatokban
ChIP vizsgálatokat végeztünk a korábban leírtak szerint [49].

• Hosszú nem-kódoló RNS-expressziós profil humán gyomorrák és klinikai significances
• In silico elemzése a gyomorrák Serial Analysis of Gene Expression könyvtárak feltárja a különböző profilok összefüggő etnikai