EBNA1 связывания и эпигенетической регуляции генов-супрессоров опухолей gastrokine в желудочных клетках карциномы

EBNA1 связывания и эпигенетической регуляции генов-супрессоров опухолей gastrokine в желудочных клетках карциномы
Аннотация
фон
Эпштейна-Барр Вирус (EBV) латентно инфицирует ~ 10% желудочных карцином (GC). Эпштейна-Барр ядерного антигена 1 (EBNA1) выражается в EBV-ассоциированных GC, и может связывать ДНК хозяина, где они могут влиять на клеточный регуляции генов. Здесь мы покажем, что EBNA1 связывается непосредственно с ДНК вверх по течению от расходящимся расшифрованных GC-специфических генов-супрессоров опухолей gastrokine 1 (GKN1) и gastrokine 2 (GKN2).
Методы
Мы используем Обломок-Seq, Обломок-КПЦР, и EMSA, чтобы продемонстрировать, что EBNA1 непосредственно связывается с промоторной локуса GKN1 и GKN2. Мы генерируем АГС-EBV, и АГС-EBNA1 клеточные линии для изучения влияния EBNA1 на экспрессию GKN1 и GKN2 мРНК с или без 5 'азацитидину лечения.

Результаты Мы покажем, что гены gastrokine транскрипционно подавляются метилирования ДНК , Мы также показали, что скрытая инфекция EBV дополнительно уменьшает экспрессию GKN1 и GKN2 в AGS клетках желудка карциномы, и что миРНК истощение EBNA1 частично снимает эти репрессии. Однако эктопическая экспрессия EBNA1 слегка повышенные уровни GKN1 и GKN2 мРНК базально, но уменьшил их способности реагировать на деметилирующим агента.
Выводы
Эти результаты показывают, что EBNA1 связывается с расширяющейся промотора генов GKN1 и GKN2 в GC клетки, и предполагают, что EBNA1 способствует комплексной транскрипции и эпигенетических дерегуляции генов-супрессоров опухолей GKN1 и GKN2 в EBV положительной GC.
Ключевые слова
EBV EBNA1 Желудочный карцинома Gastrokine чИП-Seq Эпигенетическое Введение
вирус Эпштейна-Барр ( EBV) является человек gammaherpesvirus находится в широком диапазоне лимфоидных и эпителиальных злокачественных опухолей клеток, в том числе лимфомы Беркитта, болезнь Ходжкина, рака носоглотки (ВСНП), а также после трансплантации лимфопролиферативных заболеваний (обзор в [1, 2]). Совсем недавно, ЭБВ было обнаружено в ~ 10% всех случаев рака желудка (GC) во всем мире [3, 4]. EBV-ассоциированных GC было показано, что моноклональное вырост EBV-инфицированных эпителиальных клеток желудка и считается особым подтипом GC [5, 6]. Поскольку частота GC близка к 900000 человек в год [7], EBV-ассоциированных GC может быть одним из наиболее распространенных EBV-ассоциированных видов рака.
В EBV позитивные клетки желудка карциномы, EBV устанавливает тип Вариант I латентности, где ЭБВ транскрипции ограничивается канонического типа I генов EBNA1, Эберсом, семейство БАРТА некодирующей РНК и микроРНК, но с некоторым дополнительным выражением LMP2A [6, 8-11]. Среди этих генов латентности, EBNA1 является единственным вирусный ядерный белок, который обнаруживается в EBV-ассоциированных GC. EBNA1 требуется для создания латентной инфекции эписомального и для долгосрочного выживания латентно инфицированных клеток [12-15]. EBNA1 представляет собой ДНК-связывающий белок, который связывается с обеих вирусных и принимающих хромосомных сайтов. Сайты связывания в вирусном геноме, были охарактеризованы для основных функций в репликации и транскрипции вирусного контроля экспрессии генов. Тем не менее, функция EBNA1 последовательности-специфического связывания с хромосому хозяина менее понятна. В то время как EBNA1 может связываться с промоторных областей некоторых генов хозяина, остается неясным, являются ли эти гены подлежат регулированию EBNA1 [12, 16, 17]. Избыточная экспрессия связывающего домена EBNA1 ДНК, которая функционирует как доминантный негативный в EBV-инфицированных клеток, могут ингибировать жизнеспособность клеток в неинфицированных клетках, предполагая, что EBNA1 связывает и регулирует клеточные гены, важные для выживания клеток [18]. Эктопическая экспрессия EBNA1 Было показано, что эффект экспрессии мРНК клетки-хозяина, [19], но не ясно, являются ли эти эффекты являются прямым или косвенным образом связаны с конкретными EBNA1 сайтами связывания в клеточном геноме.
В предыдущем исследовании мы использовали Обломок-сл методы для анализа генома сайтов обогащения от EBNA1 в латентно инфицированных клетках лимфомы Беркитта Raji и выявили многочисленные клеточные сайты, связанные с EBNA1 [17]. Среди этих EBNA1 сайтов сотовой связи с обогащением мы определили значительное EBNA1 связывания пик, расположенный на gastrokine 1 (GKN1) и gastrokine 2 (GKN2, известный также как фактор трилистника взаимодействующий белок (TFIZ1)) кластер генов. GKN1 и GKN2 были идентифицированы на основании их частой потере экспрессии в опухолевые карциномы желудка эпителиальных клеток, по сравнению с нормальной желудочной ткани [20-22] (рассмотрено в [23]). Несколько недавних исследований описаны антипролиферативным и анти-инвазивную активность для GKN1 в желудочных эпителиальных клеток, которые, вместе с его частой потерей экспрессии при раке, наводит на мысль он функционирует как супрессоры опухолей, специфического к действию желудочного эпителия [21, 24-28]. GKN1 могут ингибировать клеточную миграцию и инвазию в заживлении ран, Transwell и Матригель анализа, а также маркеры альтер клеток, ассоциированных с эпителиально-мезенхимальных перехода [26]. гены GKN1 и GKN2 расположены в непосредственной близости и транскрибируются в противоположных направлениях, предполагая, что они, вероятно, разделяют двунаправленную промотор, и подлежат скоординировать регулирование на основе общих транскрипционных регуляторных факторов (обзор в [23]). В этом
исследование, мы показали прямое связывание между EBNA1 и GKN1-GKN2 локусов и исследовали GKN1 и GKN2 экспрессии генов путем модуляции EBV инфекции и EBNA1 белка. Наши данные свидетельствуют о том, что инфекция EBV может дополнительно ингибировать экспрессию GKN1 и GKN2, и что потеря EBNA1 может способствовать эпигенетическую дерепрессии GKN2 транскрипции. Мы также наблюдали повышенные уровни метилирования ДНК в GKN1 и GKN2 промоторных областей, а также потенциальную роль EBNA1 в дерегуляции и эпигенетической репрессии этого локуса-супрессора опухолей.
Результаты
Идентификация высокой занятости EBNA1 сайта связывания на GKN1 -GKN2 локус микросхемой-Seq
Ранее опубликованные Обломок-Seq данные из клеток Raji BL выявили ограниченное число сайтов связывания высоко обогащенного EBNA1 на основе пиковых показателей и читать числа [17]. Далее осмотр показал сильный сайт связывания EBNA1, расположенной выше по потоку от стартовых сайтов для расходящимся расшифрованных генов GKN1 и GKN2 (рис 1А, верхняя дорожка). Аналогичный EBNA1 пик связывания наблюдалось в отдельном эксперименте ЧИП-Seq выполненных в ЭБВ положительной карцинома носоглотки клеточной линии C666-1 (полные Обломок-сл данные, которые будут опубликованы в другом месте), что указывает, что это связывание происходит как эпителиальные, а также лимфоидной типы клеток (рис 1А, нижняя направляющая). Центр пика находится ~ 5 кб от GKN2 и ~ 15 кб от стартовых сайтов GKN1 транскрипции. ЧИП-КПЦР был использован для проверки EBNA1 связывания в области промотора GKN1-GKN2 в обоих Раджи и клетках C666-1 (рис 1B и C). КПЦР указал, что EBNA1 связанный с сайта GKN1-2 с аналогичной эффективностью ранее одобренного EBNA1-связывающего сайта на промотор PITPNB. КПЦР также указал, что EBNA1 связывание с GKN1-GKN2 конкретно, так как не было обнаружено EBNA1 связывания либо на клеточном локуса GAPDH или областей управления EBV OriLyt, как и ожидалось (рис 1B и C). Сайт мнимый EBNA1 связывания на GKN1-GKN2 локус был идентифицирован путем выравнивания с сайтом связывания консенсуса в EBV семействе повторами (FR) области, и эта последовательность была затем испытана для прямого связывания с EBNA1 с помощью EMSA (рис 1D). Очищенный рекомбинантный EBNA1 ДБР белок анализировали на связывание с зондами, содержащими сайт GKN1-GKN2 (GKN1 /2), FR, или отрицательную контрольную последовательность, в котором отсутствует сайт связывания консенсуса EBNA1. Мы обнаружили, что EBNA1 ДБР эффективно, связанного с сайтом GKN1-GKN2, а также к FR консенсуса, но не связываются с регуляторной последовательностью. Эти данные позволяют предположить, что EBNA1 взаимодействует с GKN1-GKN2 промоторной области путем прямого ДНК-связывающих с EBNA1 DBD. Рисунок 1 EBNA1 связывается в промоторной локуса GKN1 и GKN2. (A) генома браузера УСК был использован для отображения EBNA1 связывания пика генерируемый от Раджи и C666-1 Обломок-SEQ на локусы генов GKN1 и GKN2. RefSeq аннотированный транскриптов указаны ниже Обломок-Seq пика. (BC) в режиме реального времени-ПЦР проверки чиповых-сл данных для сайта связывания EBNA1 в GKN1 /2 совместно промоторной области: EBNA1 (красные столбики) или контролировать IgG (синие полосы) анализировали с помощью монетой в Раджи (B) или C666-1 клетки (C) для связывания ДНК на /2 сайта GKN1, PITPNB промотор, GAPDH или EBV Ori-LYT. (D) EMSA анализ Р32 меченых зондов, содержащих Control, GKN1 /2 сайт, или EBV FR. Варьируя количество белка EBNA1 DBD использовали в реакции связывания (0, 100, 300, 900 нг). Наконечники представляют собой EBNA1 специфичные связанные комплексы или свободный зонд, как указано. Зонд последовательность GKN1 /2 сайта и FR обозначается последовательностью гомологов (красными буквами) между GKN1 /2 и FR. Последовательность отрицательный контроль (Ctrl) также указывается. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение от среднего (SDM) при п = 3.
GKN1 и мРНК GKN2 высоко выражены в первичной ткани желудка
Затем мы измерили уровни GKN1 или мРНК GKN2 в различных желудочных клетках карциномы линий и в первичных нормальная ткань желудка с помощью QRT-PCR (рисунок 2). Мы обнаружили, что GKN1 и GKN2 выражены на более высоких уровнях (~ 3 × 10 4 раза) в первичной ткани желудка, чем в любой из клеточных линий, тестированных (фиг.2А). Хотя при гораздо более низких уровнях, чем первичной ткани желудка, GKN1 и GKN2 оба были выражены в измеримых уровней в AGS карциномы желудка клеточных линий, с GKN2 выражены на более высоких уровнях, чем все другие линии GC клеток, или EBV положительных В-клеток или линий NPC клеток ( Рисунок 2B). Очень низкий уровень GKN1 или GKN2 могут быть обнаружены в первичной полости рта эпителиальной ткани, что говорит о том, что эти гены являются специфическими для первичной желудочной ткани. Рисунок 2 GKN1 и мРНК GKN2 высоко выражены в первичной ткани желудка. ОТ-ПЦР проводили анализ уровня мРНК GKN1 (синие полосы) или GKN2 (красные столбцы) в различных клеточных линиях, включая GC полученные GTL, MKN28, MKN74, SNU638, AGS, BL полученный Раджи, EBV увековечены LCL, EBV положительная линия NPC C666-1, или первичный рот эпителиальные клетки по сравнению с (А) или без (в) первичной ткани желудка. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение от среднего (SDM) при п = 3.
EBV задержка уменьшает экспрессию GKN1 и GKN2 мРНК в линиях клеток GC
Для проверки влияния EBV латентной инфекции на экспрессию GKN1 и GKN2, мы сгенерировали клеточной линии AGS, содержащий EBV B95.8 Бакмидную. Клеточная линия АГС была выбрана для устойчивости к гигромицину и GFP положительности, чтобы гарантировать, что она содержала Бакмидную компоненты. Чтобы охарактеризовать клеточную линию АГС-EBV, мы сначала проанализировали характер экспрессии генов EBV (рисунок 3). Мы обнаружили, что АГС-EBV клетки экспрессировали детектируемых уровней мРНК EBNA1, BARF0 и LMP2A, но не LMP1, EBNA2 или EBNA3C (рисунок 3). Хотя EBV B95.8 Бакмидную не хватает BART микроРНК, эти результаты согласуются с АГС-EBV клетки принимая типа Вариант I латентности программу экспрессии генов с некоторым выражением LMP2A, подобно тому, что наблюдалось в EBV положительной ткани желудка опухоли карциномы [8, 10 ]. Для дальнейшей характеристики клеток АГС-EBV, мы проанализировали экспрессию белка EBNA1 методом Вестерн-блоттинга (рис 4а) и ДНК EBV число копий КПЦР (рис 4В). EBNA1 был обнаружен как один вид низкой численности в ожидаемой молекулярной массы (рис 4A). номер EBV копия была измерена путем сравнения ДНК EBV Ori-LYT к клеточному GAPDH (рис 4В). Мы обнаружили, что АГС-EBV содержал ~ 50% меньше копий вирусного генома по сравнению с EBV положительными LCLS. Для того, чтобы определить, является ли EBNA1 сохранил свою ДНК-связывающую активность в AGS-EBV, мы проводили обычные ChIP анализы (рис 4в). Мы обнаружили, что EBNA1 связанный с EBV Dyad Симметрия (DS) ДНК, а также с сайтом связывания GKN1-GKN2 в АГС-EBV клеток. Затем мы спросили, является ли уровень GKN1 или мРНК GKN2 были затронуты EBV латентной инфекции в AGS клетках путем сравнения уровней экспрессии RT-КПЦР в АГС по отношению к АГС-EBV клеток (рис 4D). Мы обнаружили, что GKN1 и GKN2 были репрессированы ~ 3-8 раз в АГС-EBV относительно AGS клеток, предполагая, что EBV задержка способствует или стабилизирует транскрипционный подавление GKN1 и GKN2. Рисунок 3 Определение характеристик экспрессии гена EBV в клеточных линиях АГС-EBV. AGS, АГС-EBV положительным, и EBV-LCLS анализировали на экспрессию мРНК путем QRT-ПЦР с использованием праймеров для EBNA1, BARF0, LMP2A, LMP1, EBNA2 или EBNA3C, как указано. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение от среднего (SDM) при п = 3. Рисунок 4
EBV инфекции клеток AGS подавляет GKN1 и GKN2 транскрипции. (А) Вестерн-блот-анализ экспрессии белка в EBNA1 АГС-EBV клеток по сравнению с EBV-отрицательными AGS клеток проводили с использованием антитела для EBNA1 (сверху) или актином (внизу). номер (B) копию ДНК анализировали с помощью ПЦР в реальном времени из EBV Ori-LYT ДНК по отношению к уровню клеточного GAPDH в AGS, AGS-EBV, и клетки EBV-LCL. (C) фишку и ПЦР в реальном времени анализ EBNA1 (красные столбики) или контролировать IgG (синие полосы) для связывания ДНК на сайтах EBV включая DS и Ori-LYT или клеточных сайтов, включая GKN1 /2 и GAPDH в AGS-EBV клетки. (D) ОТ-ПЦР проводили для анализа уровня мРНК GKN1 или GKN2 в AGS (синие полосы) или АГС-EBV клетки (красные столбики). ** Обозначает р &лт; .005. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение от среднего (SDM) при п = 3.
EBV увеличивает метилирования ДНК зависимой репрессии GKN1 и GKN2 мРНК в линиях клеток GC
GKN1 и GKN2 могут стать объектом эпигенетической подавления в GC и ткани культуры клеточных линий. Чтобы исследовать эту возможность, мы проверили, действительно ли лечение с помощью ДНК деметилирующим агента 5 'азацитидину (Аза) или деацетилирования агент (NAB) в сочетании с форболовым эфиром (TPA) будет активировать GKN1 или GKN2 в AGS клетках (рис 5А). Мы обнаружили, что лечение Аза привело к кратному увеличению ~ 10 в GKN2 и ~ 4 кратное увеличение GKN1 транскрипции в AGS обработанных клеток. В отличие от этого, обработка NaB /ТПА производится только ~ 2 раза активацию транскрипции. Эти данные позволяют предположить, что оба GKN1 и GKN1 находятся под активным эпигенетической репрессии через метилирование ДНК. Для того, чтобы проверить, если EBV имел никакого влияния на Аза индуцированной активации GKN1 или GKN2, мы сравнили эффекты лечения Аза на АГС по отношению к АГС-EBV клеток путем QRT-PCR (рис 5B). Мы обнаружили, что GKN1 и GKN2 были эффективно активируют обработкой Аза в AGS клетках, но в меньшей степени, в АГС-EBV. В этих экспериментах, аза-индуцированную активацию GKN2 была полностью устранена, в то время как активация GKN1 была лишь частично ослаблен. Аза-лечение также привело к кратному увеличению ~ 8.4 уровней EBNA1 мРНК, предполагая, что лечение Аза стимулирует экспрессию генов EBV литическую в клеточных линиях АГС-EBV. Эти результаты свидетельствуют о том, что ген EBV продукты предотвращают GKN2, и в меньшей степени активации GKN1 после лечения Аза. Рисунок 5 EBV усиливает подавление экспрессии генов GKN1 и GKN2 метилирование ДНК. (A) AGS клетки обрабатывали 10 мкМ Аза, или 1 мМ NaB и 20 нг /мл ТФК в течение 48 часов и анализировали с помощью ОТ-ПЦР для GKN1 или уровня экспрессии GKN2, по сравнению с необработанными AGS. (B) AGS клетки или АГС-EBV клетки обрабатывали или неочищенные с 10 мкМ Аза в течение 48 ч, а затем анализировали на GKN1, мРНК GKN2 или уровней EBNA1 мРНК. (С) MEDIP анализ из АГС или АГС-EBV клеток, обработанных или не обработанных 10 мкМ Аза в течение 48 часов при различных регионах ДНК GKN1 и GKN2 локусов. (D) MEDIP анализ из АГС или АГС-EBV клеток, обработанных или не обработанных 10 мкМ Аза в течение 48 часов в клеточных регионах для альфа-глобина-2, GAPDH, Cdc7, FOXP2, HDAC3 или MAP3KIP2. (Е) Геном положение праймеров, используемых для GKN1-GKN2 фишку и MEDIP анализов. * Обозначает р &лт; .05, ** Обозначает р &лт; .005. Столбики ошибок указано SDM при п = 3.
Чтобы лучше понять механизм GKN1 и GKN2 эпигенетической репрессии, мы исследовали уровни метилирования ДНК с использованием метил цитозин-специфическое антитело направлено ДНК иммунопреципитации (MEDIP) анализа. Мы анализировали обогащение метилированной ДНК в области управления GKN1-GKN2 в AGS и AGS-EBV клеток с или без лечения Аза (Рисунок 5С). Мы наблюдали относительное обогащение метилированных CpG в области между сайтом связывания EBNA1 и сайта инициации транскрипции GKN2 (GKN2_A). Лечение Аза привело к уменьшению сигнала MEDIP в большинстве регионов, где был обнаружен сигнал, предполагая, что лечение Аза привело к общему снижению метилирования ДНК. Аналогичные потери CpG метилирования наблюдали при гена альфа-глобина (которая не связывает EBNA1), а на нескольких участках EBNA1 связывания, включая HDAC3 и MAP3K7IP (рисунок 5D). Мы также отметили, что MEDIP сигналы были в EBV-AGS как правило, выше, чем в клетках AGS, предполагая, что ЭБВ латентной инфекции может способствовать или стабилизировать метилирование ДНК во всем геноме хозяина.
Обеднение EBNA1 активирует экспрессию GNK1 и GKN2 мРНК в EBV положительных эпителиальных клеток
чтобы определить, является ли EBNA1 вклад в транскрипционной репрессии GKN1 и GKN2, мы сначала попытались истощить EBNA1 в АГС-EBV клеток с использованием миРНК (рисунок 6). Мы вызвали миРНК ориентации 3'-некодирующей UTR из EBNA1 мРНК, которая частично обедненного EBNA1 белка в АГС-EBV клеток (рис 6б). Истощение EBNA1 привело к ~ 5 активации кратный GKN2, с небольшим количеством обнаруживаемой активации GKN1 (6А). Эти данные позволяют предположить, что EBNA1 может функционировать как транскрипционный репрессор GKN2 в клетках АГС-EBV. Рисунок 6 миРНК истощение EBNA1 вызывает де-репрессию GKN1 и GKN2 в клетках AGS-EBV. siCtrl или siEBNA1 трансфицированные клетки АГС-EBV анализировали с помощью ОТ-ПЦР для GKN1 или мРНК GKN2 уровне по отношению к клеточной GAPDH (A). Клетки собирали через 72 ч после трансфекции с миРНК. Вестерн-блот, показывающий EBNA1 (верхняя панель) и загрузка управления актин (нижняя панель) в АГС-EBV клеток (В). Столбики ошибок указывают стандартное отклонение от среднего (SDM) при п = 3.
EBNA1 ингибирует GKN1 и GKN2 транскрипцию после того, как ДНК деметилирования
Для дальнейшего изучения вклада EBNA1 в GKN1 и GKN2 регуляции транскрипции, мы исследовали влияние эктопическая экспрессия только EBNA1 на Аза-индуцированных уровней GKN1 или GKN2 транскрипции в клетках GC. Клетки AGS были трансдуцированных с EBNA1 выражения лентивирусов. Стабильная АГС-EBNA1 (PLU-EBNA1) или AGS- вектор управления (PLU-Vec) клеточные линии были отобраны и анализировали на уровни GKN1 и мРНК GKN2. Мы наблюдали, что АГС-EBNA1 клетки имели ~ 2-3 раза выше базального уровня GKN1 и мРНК GKN2 относительно родительских клеток AGS (рис 7А). Тем не менее, Аза-индуцированные уровни мРНК GKN1 и GKN2 были ослаблены в AGS-EBNA1 по сравнению с AGS клетками (рис 7б). Лечение Аза также привело к значительному увеличению уровней EBNA1 мРНК (рис 7в). Для того, чтобы определить, есть ли последствия EBNA1 на GKN1 и GKN2 были специфическими для AGS клеток, мы трансдуцированная другой EBV отрицательный GC клеточную линию MKN74 с EBNA1 лентивирусов (рис 7D-F). Подобно клеткам AGS, мы обнаружили, что EBNA1 увеличили базальные уровни GKN1 и GKN2, но ингибирует способность Аза дальнейшего индуцируют уровней GKN1 и мРНК GKN2 (рис 7D и Е). Мы подтвердили, что Аза-лечение было эффективным путем измерения уровней мРНК EBNA1, что увеличило ~ 7 раз (рис 7F). Эти данные позволяют предположить, что эктопическая экспрессия EBNA1 может увеличить базальный, но ингибируют Аза-индуцированные уровни GKN1 и GKN2 транскрипции в EBV-негативных линий GC клеток. Рисунок 7 EBNA1 ингибирует GKN1 и GKN2 транскрипцию после деметилирования ДНК в клетках GC. (A) AGS клетки трансдуцированных с PLU-Vector (Vec) или PLU-EBNA1 и затем необработанными (Untr) или обрабатывали 10 мкМ 5'-азацитидину (AZA) в течение 48 часов. GKN1 и мРНК GKN2 были количественно QRT-PCR по отношению к GAPDH. (B) Сложите индукции GKN1 и мРНК GKN2 путем Аза количественно из панели А. (С) QRT-PCR анализа уровней мРНК EBNA1 в AGS клетках. (D) Как и в A, для использования MKN74 вместо клеток AGS за исключением того. (E) Согните индукции GKN1 и мРНК GKN2 количественно из панели D. (F) QRT-PCR анализа уровней мРНК EBNA1 в клетках MKN74. * Обозначает р &лт; .05, ** Обозначает р &лт; .005. Столбики ошибок указано SDM при п = 3. Обсуждение

В этом исследовании мы идентифицировали сайт связывания с высоким EBNA1 размещение в 5 'управления промоторной области расходящимся расшифрованных генов GKN1 и GKN2. EBNA1 сайты связывания наблюдались в двух независимых наборов данных Обломок-Seq из EBV положительных лимфоидных клеток BL Раджи и EBV положительным эпителиальные клетки карциномы носоглотки C666-1 (рис 1А). Мы подтвердили эти сайты связывания с помощью обычных Обломок-кПЦР в обеих клеточных линиях (рис 1B и C). EBNA1 Было также показано, связываться непосредственно с этих сайтов с помощью EMSA очищенным рекомбинантным белком EBNA1 ДБР (рис 1D). Показано, что уровень мРНК GKN1 и GKN2 высоко репрессирован в большинстве клеточных линий по отношению к первичной ткани желудка (Рисунок 2). Для изучения потенциальной роли EBV и EBNA1 в транскрипционным контролем GKN1 и GKN2, мы породили EBV положительную AGS желудка линию клеток карциномы. Покажем, что EBV принимает тип варианта я латентности шаблон в AGS клетках (рисунок 3), и что EBNA1 может связываться с промоторной областью GKN1 /GKN2 в клеточной хромосоме (рис 4в). Мы также обнаружили, что GKN1 и мРНК GKN2 были дополнительно подавлено в EBV положительных AGS клеток по сравнению с контрольными EBV отрицательные AGS клетки (рис 4D). Затем мы показали, что Аза обращение привело к увеличению экспрессии GKN1 и GKN2 (рис 5А), и что EBV скрытая инфекция ингибирует активацию Аза из GKN2 (рис 5B). Мы обнаружили, что миРНК истощение EBNA1 в EBV положительных AGS клеток приводит к активации транскрипции GKN2 (рисунок 6). Мы также показали, что эктопическая экспрессия EBNA1 умеренно повышает базальную, но ингибирует Аза-индуцированные уровни GKN1 и GKN2 транскрипции (рисунок 7). Взятые вместе, эти данные показывают, что EBNA1 связывается с контрольной области промотора GKN1-GKN2 в нескольких типах клеток и повышают вероятность того, что EBNA1 способствует транскрипционной и эпигенетической репрессии генов-супрессоров опухолей GKN1 и GKN2 в EBV положительной GC. <Бр> ЭБВ латентной инфекции, как известно, увеличивают онкогенного фенотипа клеток карциномы желудка [29-31]. GKN1 и GKN2 сообщается функционировать в качестве ингибиторов роста клеток и опухолевых супрессоров в GC [20, 21, 23, 25-27]. Наши данные экспрессии мРНК, показывающие экспрессию мРНК на высоком уровне только в первичной нормальной желудочной ткани согласуются с ролью GKN1 и GKN2 как подавитель опухоли. Тем не менее, нам не удалось показать, что избыточная экспрессия любого или обоих GKN1 или GKN2 в АГС или АГС-EBV вызывают остановку клеточного цикла или уменьшить жизнеспособность (данные не показаны). Это говорит о том, что GKN1 и GKN2 функции на более ранних стадиях развития опухолевых клеток, или в более сложных опухолей микросреды. Мы полагаем, что EBNA1 может иметь более выраженный эффект на экспрессию GKN1 и GKN2 в ситуациях, когда EBV может инфицировать первичные клетки желудка, где базальная экспрессия GKN1 и GKN2 являются высокими и важными для подавления опухоли.
Предыдущие опубликованные исследования показали, что GKN1 и GKN2 транскрипции подвергается эпигенетической подавлению метилирования ДНК во всех формах GC [21]. Наши исследования согласуются с ролью метилирования ДНК в эпигенетической подавлении GKN1 и GKN2 в AGS клетках. Лечение с Аза привело к кратному увеличению экспрессии GKN1 и GKN2 мРНК (рис 5А) 4-10, и MEDIP показали обогащение метилированной ДНК в промоторной области (5С). АГС-EBV клетки действительно показывают увеличение метилирования ДНК на нескольких клеточных участках, в том числе регионов, окружающих EBNA1 сайты связывания на области GKN1 промотора (5С), а также HDAC3 и MAP3K7IP2 генов (рис 5D). Тем не менее, присутствие EBNA1 в клетках АГС-EBV не мешало аза-индуцированной деметилирования на этих участках. Это наводит на мысль, что EBNA1 может репрессировать транскрипцию от некоторых промоутеров, как GKN2, через механизм, отличный от метилирования ДНК. Однако эктопическая экспрессия EBNA1 в одиночку произвела более сложный фенотип, в результате чего небольшое увеличение базальной экспрессии, но ограничивая влияние Аза-индуцированной деметилирования (рисунок 7). Это может свидетельствовать о том, что что EBNA1 может функционировать по-другому, когда выражается эктопически, чем при выражении в контексте вирусного генома. Тем не менее, наши результаты показывают, что EBNA1 возмущает нормальное регулирование транскрипции генов GKN1 и GKN2.
Точная функция EBNA1 в регуляции транскрипции, остается неясным. EBNA1 участвует в активации транскрипции и подавления обоих вирусных и клеточных генов [32, 33]. EBNA1 может подавлять свою собственную экспрессию мРНК из EBV Qp в III типа задержки, где репрессии были связаны с стерической интерференции с РНК-полимеразы II связывание с сайта инициации транскрипции [34]. С другой стороны, EBNA1 может активировать ТТП и LMP1 промоторы типа III латентность, где она может функционировать как энхансер-подобный фактор [35-37]. EBNA1 участвует в активации транскрипции некоторых клеточных генов, в том числе ген Nox2, участвующих в формировании активных форм кислорода [19]. EBNA1 также может влиять на транскрипцию хост-клеток через глобальную ремоделирования хромосомы хозяина [38]. Таким образом, EBNA1 может изменять клеточную транскрипцию через множество прямых и косвенных механизмов.
Эпигенетических модификаций, как известно, играют важную роль в EBV-ассоциированных карциномы желудка [39]. Интересно, что AGS клетки, несущие EBV Бакмидную геномы имели более высокие уровни метилированной ДНК на многих протестированных сайтов (Рисунок 5D). Это согласуется с предложенной ролью EBV в метилирование опухолевых генов-супрессоров хозяина [40]. Это также согласуется с выводами, что EBV положительный GC имеет повышенные метилирование ДНК в промоторных регионах нескольких ключевых опухолевых супрессоров ГК, в том числе генов gastrokine [39, 41-45]. В то время как EBNA1 связаны вблизи ДНК метилируется областей GKN2, нам не удалось показать, что EBNA1 модулирует метилирование ДНК на участках GKN1 и GKN2 (данные не показаны). Тем не менее, возможно, что EBNA1 в сочетании с другим вирусным кодированном или наведенной фактора может стабилизировать GKN1 и GKN2 транскрипционной репрессии посредством хроматин-зависимого и структурного механизма, который усиливает метилирование ДНК. Также возможно, что EBNA1 может регулировать GKN1 или GNK2 только в ткани или опухоли микросреды, которые не легко воспроизводятся в клеточной культуре. В то время как функция EBNA1 связывания для размещения клеток хромосомы сайтов остается важной областью исследований, более сложные модели инфекции может потребоваться для выяснения его потенциальную роль в изменении экспрессии генов клетки-хозяина и канцерогенез.
Методы
Клетки, плазмид, и лентивирусов инфекция
EBV-позитивные клетки лимфомы Raji Беркитта, EBV положительным карцинома носоглотки C666-1 клетки и желудка линии клеток карциномы (подарок от доктора Антонии Р. Сепульведа, Колумбийский университет), включая GTL, MKN28, MKN74, SNU638 поддерживали в среде RPMI, содержащей 10% FBS и дополненной антибиотиками (пенициллин и стрептомицин). Карциномы желудка AGS клетки (АТСС CRL-1739) поддерживали в F-12K, содержащей 10% FBS. Первичный рот эпителиальные клетки были предоставлены доктором Manjunatha Benakanakere, Университет Пенсильвании и культивировали в кератиноцитов-SFM среде. EBV-LCL была установлена ​​первичной инфекцией мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) с EBV BAC вирионов, полученных из стимулированных 293-EBV клеток [46, 47]. EBV-LCL содержит гигромицину B устойчивые EBV Бакмидную поддерживали в среде RPMI, содержащей 10% FBS, гигромицину В (100 мкг /мл), GlutaMAX (Invitrogen), и антибиотики. АГС-EBV клетки были получены из AGS клеток совместно культивируют с EBV-LCL путем адаптации ранее опубликованного совместного культивирования метод, описанный AGS клетки инфекции с rEBV через клетки к клетке контакта [48] с некоторыми изменениями. Если коротко, то EBV-LCL индуцировали 20 нг /мл 12-O
-tetradecanoylphorbol-13-ацетата (ТРА) и 1 мМ бутирата натрия (NAB) за 24 часа до совместного культивирования. Индуцированные клетки EBV-LCL промывали PBS дважды, чтобы полностью удалить индуцирующего агента, ресуспендировали с полной среде RPMI при 10 6 клеток /мл до совместной инкубации. AGS клетки высевали в 6-луночные планшеты за 24 часа до совместного культивирования, а затем 60 - 70% сплошности AGS клеток в 1 мл полной среды F-12K, инкубировали с 10 6, индуцируемых и промытых клеток EBV-LCL в 1 мл завершить RPMI. Через 24 часа, 2 мл бессывороточной среде F-12K добавляли в каждую лунку, чтобы уменьшить концентрацию FBS до 5%, чтобы предотвратить чрезмерный рост клеток. Через 3 дня после совместной инкубации, EBV-LCL клетки были удалены из совместного культивировани и клетки AGS тщательно промывали PBS, по меньшей мере 5 раз, чтобы удалить какой-либо из донора EBV-LCL клеток. Инфицированные клетки AGS затем инкубировали со свежей средой F-12K с добавлением 10% FBS и 100 мкг /мл гигромицина B и выбор среды не меняли каждые 2 до 3 дней, пока инфицированные AGS клетки формировали колонии селекции Hyg В с выражением GFP (как правило, от 3 до 4 недель после совместного культивирования). Колонии отбора были затем собирали и тестировали на экспрессию EBNA1 и EBV генома число копий до подлежащего экспериментов. АГС-EBV клетки поддерживали в F-12K среде с добавлением 10% FBS и 100 мкг /мл гигромицина B.
вектор экспрессии, PLU-EBNA1 Лентивирус была построена с помощью ПЦР-амплификации с праймерами EBNA1 (GCGGGATCCTCTGACGAGGGGCCAGGTACAGGACCT и ATCGTCGACTCACTCCTGCCCTTCCTCACCCTCATC) введение 5 ' BamHI-я и 3 'сайт Sal I клонируют в рамке PLU-TCMV-ЦСМ-pPURO. AGS или MKN74 клетки инфицировали Лентивирус, выражающей PLU-EBNA1 или контрольным вектором PLU генерируемой свеже из клеток 293Т. Зараженные АГС или клетки MKN74 затем были выбраны с помощью 2,5 мкг /мл пуромицин в течение 10 до 14 дней. Отобранные клетки были собраны и обработаны с использованием или без 5'-азацитидину в течение 48 часов, затем подвергали ОТ-ПЦР.
МиРНК против EBNA1 и контроля миРНК (Кат. N D-001810-01-20) были приобретены у Dharmacon. миРНК направлены против EBNA1 3'-UTR, были синтезированы с использованием последовательности-мишени CGGAGAUGACGGAGAUGAAUU. Трансфекция киРНК-дуплексов проводили с использованием Oligofectamine (Dharmacon), в соответствии со спецификациями производителей.
Иммунопреципитации хроматина (CHIP) анализы
ChIP анализы проводили, как описано ранее [49]. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Длинные некодирующих профиль экспрессии РНК при раке желудка человека и его клиническая significances
• В Silico анализе карциномы желудка последовательного анализа библиотек экспрессии генов показывает различные …