Undersökning av hästdjur glandulärmagen lesioner för bakterier, inklusive Helicobacter spp genom fluorescens in situ hybridisation

undersökning av hästdjur glandulärmagen lesioner för bakterier, inklusive Helicobacter spp Musik av fluorescens in situ hybridisering
Bild Sammanfattning
Bakgrund
häst~~POS=TRUNC glandulärmagen vanligen påverkas av erosion och sår. Syftet med denna studie var att bedöma om bakterier, inklusive Helicobacter kunde vara inblandade i etiologin av gastriska glandulära lesioner ses hos hästar.
Resultat
Mage skador, liksom normala förekommer slemhinna erhölls från hästar som slaktats för livsmedel. Samtliga prover testades för ureasaktivitet med hjälp av Pyloritek ® analys medan mucosal bakteriehalt utvärderades med hjälp av fluorescens in situ
hybridisering. I utvalda underprover, var bakterie karakterisering eftersträvas ytterligare genom kloning och sekvensering. Slemhinneskada hittades i 36/63 magar och ingår hyperplastisk rugae, polypoid strukturer och bränn erosioner. Inget av proverna testades positivt för ureasaktivitet eller FISH använder Helicobacter släktet specifik prob. I prover av lesioner, liksom normala prover, kloner med 99% likheter med Lactobacillus saliv Mössor och Sarcina ventriculi
hittades. Escherichia
som bakteriekloner och Enterococcus kloner visades i en kontaktpunkt erosion. Baserat på ett fylogenetiskt träd dessa kloner hade 100% likhet med Escherichia fergusonii och Enterococcus faecium
. Enterococcus hittades kolonisera slemhinneytan, medan E. fergusonii
organismer också visat intraepithelial.
Slutsats
Gastric Helicobacter spp. kunde inte verifieras som delaktiga i lesioner i glandulärmagen av hästen. Eftersom E. fergusonii
har beskrivits som en framväxande patogen hos både människor och djur, fastställandet av denna bakterie i mag erosion optioner ytterligare förtydliganden huruvida gastric infektion med denna typ bakterie är viktigt för hästar.
Bakgrund
hos hästar, skador på icke-körtel delen av magsäcken är mycket vanliga och verkar ha orsakats av överdriven exponering syra [1], men lite har beskrivits om skador i körtel delen. Skador som finns i körtelområdet visades i 58% av 162 sjukhus hästar [2] och 47% av 345 tävlingshästar [3] och medan orsaken till dessa inte har fått mycket uppmärksamhet, syra exponering verkar inte vara den primära faktorn , eftersom ingen korrelation mellan lesioner i de två regionerna i magen har visat sig [3].
Gastric bakterier som orsak för glandulärmagen lesioner har föreslagits för många djurarter och människor dessa utgör en viktig verifierad riskfaktor. Av de gastric organismer som förekommer, Helicobacter pylori
har beskrivit mest på grund av dess sjukdomsframkallande förmåga att inducera kronisk gastrit, magsår, adenokarcinom och slemhinna lymfoid vävnad (MALT) lymfom hos människor [4-6]. Bakterier av detta släkte har också påträffats i mag vävnadsprover från djur, inklusive hundar, grisar, får och nötkreatur [7-10].
Hästen lämnar motstridiga bevis om huruvida bakterier som specifikt kan orsaka magsår inträffa. Några studier har visat att gastric Helicobacter spp
. förekommer i normal visas slemhinna med hjälp av PCR och immun [11, 12], medan andra inte funnit några bevis för ett samband mellan förekomsten av skador och bakterier [13]. Som gastric bakteriearter har bekräftats eller föreslagits som en del av patogenesen av vissa typer av gastric patologi i människor och andra djurarter, syftet med denna studie var att bedöma om bakterier kan vara involverade i patologin observerade i häst glandulär magsäck. En huvudfokus var att ge mer bevis om närvaro och lokalisering av bakterier i allmänhet på slemhinnan nivå häst glandulär magsäck. Särskild tonvikt lades på att få information om närvaro och deltagande av alla Helicobacter arter
i slemhinneskador. Den fluorescens in situ
hybridisering (FISH) teknik användes för detta ändamål, som tillåter användning av rRNA-målinriktade sönder för både den totala bakteriepopulationen och definierade släktet /arten. Detta tillvägagångssätt medger bestämning av bakteriell morfologi, överflöd, plats i vävnaderna, och även indikationer på tillväxt och fysiologiska aktiviteter [14] Resultat.
Bruttokörtel lesioner sågs i 36 av de 63 magar undersökts (57,1 %). Majoriteten av lesioner sågs i antrum regionen (91,7%). I sex magar, var lesioner dessutom eller uteslutande ses i den övre magmunnen eller corpus region. Inga lesioner påträffades i duodenum
Lesionerna klassificerades i tre grupper som:. Polypous (2 magar med polypoid massor belägna i både den övre magmunnen och antrum med storlekar mellan 1 och 5 cm i diameter), ii: hyperplastisk rugae lesioner (13 magar) eller III. hyperemiska, eroderande eller ulcerös lesioner som sågs i 21 magar
hyper rugae var alla sett i antrum och varierade från att ha intensiv hyperemi med sårvätska till rugae med normalt förekommer slemhinneytan. Brutto förtjockning av antrum rugae orsakades främst av hyperplasi av den gastriska foveolae jämfört med respektive normala prover. De återstående lesioner befanns alla vara små ensliga lesioner av högst ca 1 x 2 cm i storlek. Fokusområden av erosiv gastrit var de vanligaste resultaten av dessa typer lesioner och betecknas som sårskorpa av de ytliga cellerna i luminala epitel med en samtidig fibrinopurulent exsudat, luminala cellrester och ett övervägande mononukleära celler infiltrat av lamina propria. Djupare erosioner som finns i 9 magar urholkas både regionen av mag gropar och delar av körtlar, som observerades med gastrit bara de omedelbara vävnader. En sann ulcer befanns sträcka sig längs hela tjockleken av lamina propria, utsätta lamina muscularis till lumen. Högst två lesioner påträffades i var och en av dessa magar.
Helicobacter och Ureasaktivitet testet
Använda släktet Helicobacter-specifika sonden inga positiva signaler påträffades i någon av de 79 vävnadsprover (36 parade prover och 7 kontroller) . I överensstämmelse med dessa resultat av FISH, ingen av proven testade positivt för ureasaktivitet heller. Intern kontroll av alla ureastester visade positivt som tecken på en funktionell testutrustning.
Bakterier i allmänhet
I allmänhet bara få bakterier observerades relaterad till slemhinneytan i både skadade liksom i frisk mage prover. Sammanfattningsvis kunde fyra morfologiska olika typer av bakterieceller visualiseras med eubakterier sond: 1) små, korta (0,2-0,5 um) kockoida stänger, 2) olika stavar (1 x 3 um), 3) långkedjiga stavar (upp till 60 pm) eller 4) stora (2-3 um diameter) kockoida bakterier tydlig fördelning i par. Vanligtvis när de är närvarande, var bakterier observerades i kluster i samband med foderpartiklar eller ligger nära slemhinneyta
Bevis på bakteriell gastrit återfanns i en mage skada grovt karakteriseras som en ensam erosion, 1 x 2 cm i storlek, centrum är hyperemiska och omgiven av en proliferativ epitelial kant (fig. 1). Mikroskopiskt, fokal erosion av slemhinnan med sipprar av erytrocyter och leukocyter, huvudsakligen av neutrofil ursprung, sågs. Utsöndringar var dessutom ses i mag gropar. Ett cellulärt inflammatorisk reaktion med mononukleära celler sågs sträcker sig så djupt som i lamina muscularis. Ytan av den inflammerade slemhinnan och de gastriska gropar befanns kraftigt koloniserade av kockoida till korta stavar applicera sonden för allmänna bakterier (fig. 2). De korta stavarna särskilt observeras infiltrera erosion. De observerades också intracellulära i epitelceller, liksom inom neutrofila granulocyter. Bakterie koloniseringen av magen begränsades till skadan eftersom inga bakterier sågs i motsvarande frisk slemhinna prov. Figur 1 Focal erosiv lesion (vit pil) visar bakteriell gastrit vid histologisk utvärdering. Lesion var ca 2 x 2 cm och ligger i antrum nära pyloric ingången.
Figur 2 magslemhinnan med erosiv gastrit i samband med bakterier. Slemhinneytan och angränsande cellrester är kraftigt koloniserade av bakterier (röd). Några bakterier ses intracellulärt i den intakta epitel (pilspets) samt inom degenererad och nekrotiska epitelceller (pil). Dessutom är bakterier inom granulocyter. Fluorescerande in situ-hybridisering med sonden targeting Bakterier, filteruppsättning 43, bar = 25 ^ m.
Kloning och sekvense
Baserat på morfologin och intensiteten av bakterier demonstrerades med användning av FISH, delprover av C /c-prover valdes ut för kloning och sekvensering av representerande prover inklusive en med bakteriellt gastrit.
av de valda delprover på magar som visar olika bakterier morfologier, användes två olika typer av kloner hittades i normala förekommer mukosa prover (c prover), en klon hade 99% likhet till Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AB370881) och den andra typen av klonerna hade 99% likhet med Sarcina ventriculi
DSM 316 (X76650).
från lesionerna (C prover) kloner också funnit med 99 % likhet med Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AF182725). Från slemhinnan med bakteriellt gastrit, fyra av tio kloner matchade 100% Enterococcus faecium
, medan de återstående sex kloner (erhållna sekvensen deponerats vid GenBank med accessionsnummer. GQ423062) tillhörde en Escherichia som
bakterie. Ett fylogenetiskt träd konstruerades med sex Escherichia
liknande kloner från lesionen och alla hade 100% likhet med de stammar både E. fergusonii
och Shigella flexneri
(fig 3). Tillämpa en gamma Proteobacteria specifik sond de korta stavarna infiltrerar epitelet, liksom funnit intracellulär inom neutrofila granulocyter, verifierades som Escherichia
som bakterie medan Enterococcus faecium
organismer identifierades kolonisera epitelytan av Enterococcus specifika sonden (fig 4 och 5). Figur 3 ett fylogenetiskt träd av 16S rRNA-genen sekvenslikhet, som visar läget för de sex klonerna tillhör Gammaproteobacteria finns i Horse 50L och de närbesläktade stammar som tillhör Escherichia släktet. De sex kloner (acc.no. GQ423062) hade 100% likhet med Shigella flexneri Mössor och E. fergusonii
. Enterobacter sakazakii (AB004746) användes som en utgrupp. nummer sekvens anslutnings presenteras.
Figur 4 magslemhinnan häst 50L med erosiv gastrit i samband med bakterier. Tillämpa en fluoresceinmärkt sond för Gammaproteobacteria och en Cy3 märkt sond för Enterococcus, en E. coli
som organism (grön) (pilspets) konstaterades intracellulär inom epitelceller och epitelytan medan E. faecium (röd) ( ' vit stjärna "(endast koloniserades epitelytan. Filter set 43/38, bar = 10 mikrometer.
Figur 5 magslemhinnan häst 50L med erosiv gastrit i samband med bakterier. Hög förstoring visar E. coli
som stavar ( grön) inom extruderade epitelceller. Fluorescent in situ hybridisering med sonden inriktning Gammaproteobacteria, filtersatsen 38, bar = 10 mikrometer Diskussion
Tidigare studier med häst mage.
har t.ex. använda PCR med inriktning på 16S rRNA-genen av särskilt Helicobacter
spp. [12]. nackdelarna med hjälp av PCR är att mängden och placeringen av bakterierna inte är känd och det är osäkert om bakterierna är levande eller ens om DNA är naken. Hence, beslutades att använda FISH-tekniken skulle ge bättre och mer information av de bakterier som finns i den glandulära magen hos hästen, eftersom dessa frågor övervinns med denna teknik. Denna teknik har tidigare använts för att beskriva den rumsliga fördelningen av Helicobacter
spp. i mag-tarmkanalen hos hundar och i magen hos friska hästar för att demonstrera mikrobiota av normalt utseende skvamös och glandulär slemhinna [15, 16]. Så vitt vi vet är detta den första studien med användning av FISH att undersöka lesioner i glandulärmagen.
I föreliggande studie ett fall av gastrit associerad med bakteriell kolonisering uppenbarades. Särskilt fördelningen av bakterier föreslog ett samband med patologin observeras. Mängden bakterier var markant ökat runt lesionen och var tätt vidhäftas till epitelcellerna, med bakterierna, som sträcker sig in i de kryptor och belägen intracellulärt. Kloningen visade att det var en dubbel infektion med Enterococcus faecium Mössor och en Escherichia
som bakterie, men det senare kontrolleras med hjälp av in situ
hybridisering med en gamma Proteobacteria sond att det var bara Escherichia
som bakterie som infiltrerat de ytliga sår och befanns intracellulär i epitelceller och inom neutrofila granulocyter. Enterobakteriella infektion i tarmen är ett vanligt fenomen, men det är ovanligt att hitta dessa infektioner i magen och det har aldrig tidigare rapporterats hos vuxna hästar. Detta resultat är mycket intressant men ytterligare studier behövs för att klargöra hur vanligt detta fenomen är i hästar. Även om denna typ av infektion är av primär eller sekundär ursprung skulle behöva ytterligare förtydliganden. Escherichia
som kloner alla hade 100% 16S rRNA-genen likhet med både E. fergusonii Mössor och Shigella flexneri
. Således, i denna studie, kan det inte precis experimentellt vilken av dessa två organismer som fanns närvarande i denna körtel lesion. Emellertid har människan rapporterats vara den enda naturliga värd för Shigella
[17], medan E. fergusonii
har associerats med ett brett utbud av intestinala och extra-intestinala infektioner hos både människor och djur, inklusive hästar [18 19]. Det är därför högst sannolikt att Escherichia
liknande bakterie som finns i denna studie tillhör E. fergusonii
. Studier har rapporterat E. fergusonii
som en framväxande patogen och i samband med särskilt bakteriemi och sårinfektioner, men dess exakta roll i infektioner hos både människor och djur återstår att belysas [20] Mikrobiologi i proverna <.
Br> miljön i körtel magen är i allmänhet mycket fientlig mot mikrober [21]. Det är väl etablerat att, till skillnad från människor och hundar som är måltids matare, hästar är kontinuerliga syreproducenter, förmodligen på grund av en kontinuerlig matning mönster [22, 23]. PH i ventrala delen av häst magen är stabilt kring pH 1-3 under 24 timmar [24], var inte oväntat följaktligen relativt låg mångfald av bakterier som observerats i slemhinnor prover i denna studie.
Karakteristiska morfologisk fenotyp av stora kocker som växer i vanliga tetrader bildades för att vara en klon med en 99% likhet med Sarcina ventriculi
. Denna organism är känd för att kunna växa i maginnehåll och har den karakteristiska Tetrade struktur när den odlas från pH 1 pH 3 [25]. I den aktuella studien, kan upptäckten av dessa organismer inte fastställas att vara en del av någon specifik patologi, eftersom de fanns i låga siffror i de parade proverna (dvs lesion och normal), liksom i kontrollprover. Sarcina liknande bakterier har hittats i en mängd olika arter, där de har tänkt att orsaka löpmagen svälla, blödning och sår i lamm och killingar [26, 27] och en möjlig koppling till gastric dilatation i både hundar och hästar har också föreslagits [28]. Inga tecken på gasfyndigheter observerades makroskopiskt i någon av dessa hästar och varför det inte verkar att förekomsten av Sarcina ventriculi
bidragit till patologin observerade i dessa hästar.
Det var inte förvånande att Lactobacillus (Lactobacillus saliv
) hittades i de studerade vävnaderna, och det har tidigare rapporterats att flera Lactobacillus
spp., inklusive L. salivarius
, är närvarande i friska hästar [16, 29]. De proximala häst magen fungerar som förvaring för foder, samt ett fack för intragastrisk jäsning. Ekosystemet i denna region består av både anaeroba och laktat användande bakterier i stort antal, som är ansvariga för ökningen av flyktiga fettsyror vid jäsning av kolhydrater [30]. Speciellt Lactobacilli befanns ansluter sig till epitelet i den proximala delen av hästens mage [31] och dessa bakterier kommer sannolikt övergå till glandulärmagen som en del av den normala turn-over. Vi har bara undersökt delprov och bakterie taxa kommer att finnas i den friska delen av körtel magen om en mer omfattande mikrobiota gemenskap studie gjordes.
Giltighet av resultaten av Helicobacter
Inget av vävnadsprover från antrum region visade positiva signaler från Helicobacter spp
. sond i denna studie och inga spiralformade bakterier noterades användning av FISH-teknik heller. I en färsk studie från Venezuela, var spiralformade bakterier rapporterats i biopsier från hjärt regionen häst magen färgas med Warthin-Starry fläck [12]. Helicobacter
. kända för att kunna kolonisera magen producerar stora mängder cytoplasma ureas [32] Den snabba ureastest som används i denna undersökning, Pyloritek ® detekterar ureasaktiviteten i vävnadsprovet genom produktion av ammoniak när urea är närvarande. Den används flitigt i den mänskliga praktiken att upptäcka gastrit orsakad av Helicobacter spp
. De positiva och negativa prediktiva värden var mellan 98,1 till 100% och från 95,8 till 100%, respektive i en studie testar humanpatienter före och efter utrotning av bakterien [33]. I denna studie sågs inga positiva test fann, vilket tyder på att de biopsier i denna studie innehöll inga bakterier med förmåga att producera ureas.
Slutsatser
Gastric Helicobacter
spp. hittades inte och kunde inte kopplas till magen lesioner av de 36 hästar som analyseras i denna studie. Patologi finns i denna studie ingick polypoid strukturer, hyper rugae och små erosioner, men bakteriell inblandning konstaterades i endast ett fall av en erosion. I denna skada, en Escherichia liknande klon, troligen E. fergusonii
, konstaterades intracellulär. Huruvida detta var en primär eller sekundär infektion kan inte slutföras. Mycket begränsade mängder av bakterier i allmänhet återfinnas i häst körtelregion som förväntat. Därför bör detektering av en måttlig till höga halter av eventuella bakterier på körtelslemhinnan nivå, liksom i de kryptor finnas anledning till oro, eftersom det inte verkar vara en normal fynd i häst glandulär magsäck. Ytterligare studier med bakterier och relationen till magsår av hästar med bekräftade kliniska tecken motiverat, eftersom dessa hästar inte ingick i den aktuella studien.
Metoder
Hästar och studiedesign
Studien gjordes som en tvärsnittsstudie av magar från en population av 63 slakteri hästar i Danmark. Hästar godkändes av veterinär som hälsosamt för slakt. Hästar bedövades med en bultpistol och tömdes på blod. Magen, inklusive 5 - 10 cm av distala matstrupen och 10 cm av den proximala duodenum, togs bort omedelbart efter urtagning och öppnas längs den större krökningen. Ingesta avlägsnades och om så är nödvändigt, var slemhinnan försiktigt sköljas med ett minimum av kranvatten före inspektion. Endast magar med stora skador i körtelslemhinnan ingick, liksom sju kontroll magar utan grov tecken på magsår.
Körtel lesioner definierades som slemhinnan har en onormal makroskopisk utseende dvs hyperemiska, ökad tjocklek, erosioner eller sår . De anatomiska positionerna för skadorna noterades som: Den övre magmunnen, corpus eller antrum regionen (Fig. 6). Figur 6 anatomiska regioner i magen öppnades utmed den större kurvaturen. Den icke-körtel region har en vit förekommer epitel, medan körtel regionen är nyanser av rött. De skiljs åt av Margo plicatus
. De tre regionerna samplade inkluderar: Cardia som liten remsa strax nedanför och längs margo plicatus
, corpus region som innehåller syra, pepsinogen och slem som utsöndrar körtlar (mörkröd) och antrum region som innehåller primärt slem och gastrin utsöndrar körtlar.
Urvalsförfarande förfarande~~POS=HEADCOMP
från varje mage med körtel skador, tre vävnadsprover där erhållits av de största skadan (A, B, C) samt tre parade normala förekommer vävnadsprover (a, b, c) från samma anatomisk region, men åtminstone minst 5 cm avstånd. A /a: en liten, biopsi storlek (0,5 x 0,5 cm) slemhinna prov erhölls för omedelbar ureastestning med Pyloritek ® analys enligt tillverkarens instruktioner. Test avlästes efter en 60 minuters standard tid och resultaten noterades som positiva eller negativa. Prov B /b: a 3 x 3 cm full tjocklek vävnadsprov inklusive slemhinna och submucosa erhölls för fisk och fixerades i 10% formalin. . Efter 24 timmar fixerings proverna överfördes till 70% etanol, paraffininbäddade, snittades vid 3 | j, m och monterade på Superfrost /Plus objektglas (Menzel-Gläser, Braunschweig Tyskland)
Prov C /c: ett tredje par av vävnad prover för kloning och sekvensering erhölls och snabbfrystes med användning av torr is (Om skadestorleken tillåter det).
från de sju kontroll magar med inga makroskopiska gastriska lesioner, proverna a, b och c togs från normalt utseende slemhinnan i antrum. Tre av dessa hästar var dessutom samplas i den övre magmunnen, corpus och tolvfingertarmen samt. Sälja The provtagningsförfaranden ägde rum från augusti till oktober 2007. Historiska uppgifter om tidigare hälsa hästarna inte kunde erhållas.
Fluorescent In Situ hybridisering för bakterier Idéer för mikrobiell upptäckt var vävnadssnitt hybridiserade samtidigt med två 16S rRNA prober märkta med olika fluoroforer. Oligonukleotidsonden S-D-BACT-0338-a-A-18 inriktnings bakterier (5'GCTGCCTCCCGTAGGAGT3) [34] var 5 'märkt med fluoresceinisotiocyanat och med isotiocyanat derivat Cy3. Oligonukleotidsonden HEL717 inriktning på Helicobacter släktet (5'AGGTCGCCTTCGCAATGAGTA3) [35] var 5 'märkt med isotiocyanat derivat Cy3. För att verifiera kloningsresultaten tredjedel och fjärde sond, LC-gProt-1027-aa-17 (5'GCCTTCCCACATCGTTT3) inriktning 23S rRNA av Gammaproteobacteria var 5 'märkt med fluoresceinisotiocyanat och sond SG-Enteroco-184 (5'CAAATCAAAACCATGCGG3 ") var Cy3 märkt inriktning 16S rRNA av Enterococcus
spp [36]. Alla prober syntetiserades vid DNA Technology, Århus, Danmark. Objektglasen avparaffinerades i xylen och överfördes till 100% alkohol under 30 min före hybridisering. Hybridiseringen genomfördes vid 45 ° C med 40 ml hybridiseringsbuffert (100 mM Tris [pH 7,2], 0,9 M NaCl, 0,1% natriumdodecylsulfat) och 200 ng av varje prob under 16 timmar i en Sequenza Slide Rack (Thermo Shandon, Cheshire, UK). Proven tvättades sedan tre gånger i förvärmd (45 ° C) hybridiseringsbuffert under 15 min och därefter tre gånger i förvärmd (45 ° C) tvättlösning (100 mM Tris [pH 7,2], 0,9 M NaCl). Proverna sköljdes i vatten, torkades och monterades i Vectashield (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) för epifluorescensmikroskopi luft. En Axioimager M1 epifluorescensmikroskop utrustat för epifluorescens med en 100-W HBO lampa och filter ställer 43 och 38 användes för att visualisera Cy3 och fluorescein resp. Bilder erhölls med användning av en AxioCam MRM version 3 FireWiremonocrome kamera och programvaran AxioVision version 4.5 (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland) Utvärdering av epifluorescensmikroskopi.
Utfördes genom beskrivning av ett subjektivt beloppet, morfologisk utseende och placering av fluorescerande celler uppenbara i varje vävnadsprov. Dessutom har alla vävnadssektioner färgades med H & E och utvärderades histopatologiskt
16S rDNA-amplifiering och kloning
Efter detektion av bakterier med FISH, var underprover från hästar som visar bakterier av olika morfologier som valts för 16S rRNA-genen. kloning. DNA isolerades från 4 vävnadsprov med hjälp av Easy-DNA-kit (Invitrogen, Tåstrup, Danmark) enligt tillverkarens anvisningar. 16S rRNA-genen amplifierades genom användning av primrar SD-Bact-0008-aS-20 (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ') [37] och S - * - Univ-1492-aA-19 (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') [38]. PCR-cykling bestod av en initial denaturering vid 94 ° C under 6 min; följt av 30 cykler av denaturering vid 94 ° C under 30 s, hybridisering vid 55 ° C under 45 s och förlängning vid 72 ° C under 2 min; och en slutlig förlängning vid 72 ° C under 3 min. Amplifierat DNA verifierades genom elektrofores på agarosgeler. PCR-produkterna renades med användning av Qiaquick PCR-reningskit-kolonner (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). För att skapa trubbiga ändar DNA Följande blandades i en 0,5-ml mikrocentrifugrör, 4 pl av 5 x T4-DNA-polymerasbuffert, 14,7 | il av renad PCR-produkt 0,8 pl av dNTP (2,5 mmol l -1 vardera) och 0,5 | il (1,2 U) T4-DNA-polymeras (Invitrogen) och inkuberades vid 12 ° C under 15 min. T4-DNA-polymeras var värmeinaktiverade, och den trubbiga ändar DNA renades med användning av QIAquick PCR-reningskit kolonner (Qiagen GmbH) och eluerades i en slutlig volym av 10 pl dubbeldestillerat vatten. Enligt tillverkarens beskrivningar kloningen utfördes genom användning av en Zero trubbig TOPO-kloningskit (Invitrogen). Tio kolonier från varje kloning plockades och sekvenserades på en automatisk sekvens-analysator (ABI PRISM 373 DNA Sequencer, PE Biosystems, Foster City, CA, USA) genom att använda de två standardvektor primers (T3 och T7) ingår i satsen. Sekvensen samlades i Bionumerics version 4.0 (Applied Math, Sint-Martens-Latem, Belgien) och kontrolleras för chimärer både genom sprängning de individuella sekvenser i Genbank http:.... //Www NCBI NLM NIH gov och av programvaran stjärtand version 1.1 http:... //www cardiff ac uk /biosi /forskning /Biosoft /. Den fylogenetisk analys av klonerna som tillhör Escherichia
släktet gjordes genom att ladda ner 16S rRNA gensekvenser längre än 1200 bp från RDP v.9 databas Escherichia
stammar http: //. Rdp CME . msu. edu. Sekvenserna trimmades till samma längd av 1327 bp och i linje parvis (UPGMA) följt av en global sekvensinpassning. En slutlig fylogenetiskt träd konstruerades med hjälp av WARD algoritm där Enterobacter sakazakii
(AB004746) användes som utgrupp.
Förklaringar
Tack
Författarna vill tacka Hanne H. Møller, Katja Kristensen och Johanna Z Amenuvor för tekniskt stöd i laboratorierna. Också tack vare Stina Vesterholm för att hjälpa samla vävnader. Detta arbete stöddes av Kongeriget Danmarks Horseinsurance g /s och Intervet Danmark. Sponsorer hade ingen inblandning i den praktiska delen eller slutsatser av denna studie.
Författarnas ursprungliga inlämnade handlingarna Images of Nedan finns länkar till författarnas ursprungliga inlämnade filer för bilder. 12866_2009_1040_MOESM1_ESM.tiff Författaroriginalfilen för figur 1 12866_2009_1040_MOESM2_ESM.tiff Författaroriginalfilen för figur 2 12866_2009_1040_MOESM3_ESM.pdf Författaroriginalfilen för figur 3 12866_2009_1040_MOESM4_ESM.tiff Författaroriginalfilen för figur 4 12866_2009_1040_MOESM5_ESM.tiff Författaroriginalfilen för figur 5 12866_2009_1040_MOESM6_ESM.jpeg författar~~POS=TRUNC för figur 6

• Upprättande och identifiering av en kaninmodell av peritoneal karcinomatos från magcancer
• NO-inducerad motilitet effekter i gastric fundus och pylorus av sGCβ1his105phe muterade möss