Onderzoek van paarden voormaag laesies voor bacteriën, waaronder Helicobacter spp met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie

Onderzoek van paarden voormaag laesies voor bacteriën, waaronder Helicobacter spp
met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie

Abstracte achtergrond
De paarden voormaag wordt vaak aangetast door erosie en zweren. Het doel van deze studie was het evalueren van bacteriën, waaronder Helicobacter kan worden betrokken bij de etiologie van maag glandulaire lesies waargenomen bij paarden.
Resultaten
maag laesies, en normaal uitziende mucosa werden verkregen van geslacht voor paarden menselijke consumptie. Alle monsters werden getest op urease-activiteit met de Pyloritek ® assay, terwijl mucosale bacteriële gehalte werd beoordeeld volgens Fluorescentie In Situ Hybridisatie
. In geselecteerde sub monsters werd bacteriën karakterisering verder gezet door klonering en sequencing. Mucosalaesies werden gevonden in 36/63 magen en opgenomen hyperplastische rugae, polypoid structuren en focale erosies. Geen van de monsters waren positief voor urease-activiteit of FISH gebruik van het genus Helicobacter specifieke probe getest. In de monsters van de laesies, evenals normale monsters, klonen met 99% gelijkenissen met Lactobacillus salivarius Kopen en Sarcina werden ventriculi, vond. Escherichia
zoals bacterie klonen en Enterococcus klonen werden aangetoond in een focale erosie. Op basis van een fylogenetische boom deze klonen hadden 100% gelijkenis met Escherichia fergusonii en Enterococcus faecium
. De Enterococcus werden gevonden koloniseren het mucosale oppervlak, terwijl E. fergusonii
organismen ook intraepithelial werden gedemonstreerd.
Conclusie
Gastric Helicobacter spp. kon niet worden geverifieerd als zijnde betrokken bij letsels van de voormaag van het paard. Omdat E. fergusonii
is beschreven als een opkomende ziekteverwekker in zowel mensen als dieren, het vinden van deze bacterie in de maag erosie warrants verdere verduidelijking over de vraag of de maag infectie met dit type bacterie is belangrijk voor paarden.
Achtergrond
bij paarden laesies van de niet-glandulaire gedeelte van de maag hoge prevalentie en lijken te worden veroorzaakt door overmatige blootstelling zuur [1], maar weinig is beschreven met betrekking laesies in de glandulaire gedeelte. Laesies in het glandulaire regio werden aangetoond in 58% van 162 gehospitaliseerde paarden [2] en in 47% van 345 renpaarden [3] en terwijl de oorzaak van deze niet veel aandacht hebben gekregen, blootstelling aan zuur lijkt niet de primaire factor als geen correlatie tussen laesies van de twee gebieden van de maag gevonden [3].
Gastric bacteriën als oorzaak voor kliermaag laesies zijn voorgesteld voor vele diersoorten en de mens vormen deze een belangrijke risicofactor geverifieerd. De organismen die de maag heeft Helicobacter pylori
beschreven de vanwege de potentieel pathogene induceren chronische gastritis, maagzweren, adenocarcinomen en mucosa geassocieerde lymfoïde weefsel (MALT) lymfomen bij mensen [4-6]. Bacteriën van deze soort hebben ook maag weefselmonsters bevonden van dieren zoals honden, varkens, schapen en runderen [7-10].
Het paard, tegenstrijdig bewijs verlaat vraag of bacteriën die specifiek kunnen veroorzaken maaglesies optreden. Een aantal studies hebben aangetoond dat de maag Helicobacter spp
. zijn aanwezig in normaal uitziende mucosa door PCR en immunochemie [11, 12], terwijl andere geen verband aangetoond tussen de aanwezigheid van laesies en bacteriën [13] hebben gevonden. Zoals maag bacteriesoorten zijn bevestigd of gesuggereerd als deel van de pathogenese van bepaalde maagproblemen van de mens en andere diersoorten, was het doel van deze studie te beoordelen of bacteriën kunnen worden betrokken bij de pathologie waargenomen in de paarden glandulaire maag. Een hoofddoel was om meer bewijs over de aanwezigheid en lokalisatie van bacteriën in het algemeen op het slijmvlies niveau van de paarden glandulaire maag te verschaffen. Bijzondere nadruk werd gelegd op het verkrijgen van informatie over de aanwezigheid en betrokkenheid van elke Helicobacter species
in de mucosalaesies zetten. De fluorescentie in situ
hybridisatie (FISH) werd toegepast voor experimentele doeleinden heeft het gebruik van rRNA-gerichte probes voor zowel de totale bacteriële populatie en gedefinieerd genus /species mogelijk maakt. Deze benadering maakt het mogelijk het bacteriële morfologie, overvloed, locatie in de weefsels, en zelfs aanwijzingen op de groeisnelheid en fysiologische activiteiten [14].
Resultaten
Gross glandulaire lesies werden waargenomen in 36 van de 63 onderzochte magen (57,1 %). De meeste laesies werden waargenomen in het antrum gebied (91,7%). In zes magen werden lesies aanvullend of uitsluitend gezien in de cardia of corpus regio. Geen lesies werden gevonden in het duodenum Ondernemingen De lesies werden in drie groepen ingedeeld:. Polypous (2 magen met polypoïde massa in zowel de cardia antrum met afmetingen tussen 1 en 5 cm in diameter), ii: Hyperplastische rugae laesies (13 magen) of iii. hyperemisch, eroderende of ulceratieve laesies die werden waargenomen bij 21 magen Ondernemingen de hyperplastische rugae werden allemaal gezien in het antrum en varieerde van die intense hyperemie met wondvocht rugae met normaal verschijnen slijmvliesoppervlak. Bruto verdikking van het antrum rugae voornaamste oorzaak hyperplasie van de maag foveolae opzichte van de respectievelijke normale monsters. De overige lesies bleken alle solitair laesies van niet meer dan ongeveer 1 x 2 cm grootte. Aandachtsgebieden van erosieve gastritis was de meest voorkomende bevindingen van dit soort letsels en gekarakteriseerd als vervelling van de oppervlakkige cellen van het luminale epitheel met een gelijktijdige fibrinopurulent afscheiding, luminale cellulaire puin en een overwegend mononucleaire cel infiltratie van de lamina propria. Dieper erosies in 9 magen uitgehold zowel het gebied van de maag kuilen en delen van de klieren, die werd waargenomen met gastritis alleen de directe weefsels. Ware maagzweer bleek de volle dikte van de lamina propria, waardoor de lamina muscularis het lumen. Maximaal twee lesies werden gevonden in elk van deze magen.
Helicobacter en urease activiteitstest
De genus Helicobacter specifieke probe geen positieve signalen werden gevonden in een van de weefselmonsters 79 (36 gepaarde monsters en 7 controles) . In overeenstemming met de resultaten van de FISH, geen van de monsters bleken te zijn urease-activiteit niet. Bedieningsinrichtingen van alle testen werden urease positieve als indicatie van een functionele test kit gevonden.
Bacteriën algemeen
algemeen slechts weinig bacteriën gerelateerd waargenomen dat het slijmvliesoppervlak in zowel de gewonde en in de gezonde maag samples. Zouden in totaal vier verschillende morfologische typen bacteriële cellen worden gevisualiseerd met de Eubacteria probe: 1) kleine, korte (0,2-0,5 urn) coccoïde staven, 2) verschillende stangen (1 x 3 pm), 3) langketenige staven (maximaal 60 pm) of 4) grote (2-3 micrometer diameter) coccoïde bacteriën duidelijk te verdelen in paren. Typisch indien aanwezig, werden bacteriën waargenomen in clusters geassocieerd met voerdeeltjes of dicht bij het slijmvliesoppervlak
Bewijs van bacteriële gastritis werd gevonden in een maag laesie grove gekarakteriseerd als solitair erosie, 1 x 2 cm grote Het centrum hyperemisch en omgeven door een proliferatieve epitheliale velg (afb. 1). Microscopisch, focale erosie van het slijmvlies met dat bol staat van erytrocyten en leukocyten, voornamelijk neutrofiele afkomst, werd gezien. De exudaten werden bovendien gezien in de maag pits. Een cellulaire ontstekingsreactie met mononucleaire cellen werd gezien uitstrekkende zo diep in de lamina muscularis. Het oppervlak van het ontstoken slijmvlies en het gastrische pits bleken zwaar gekoloniseerd door coccoïde korte staven toepassing van de probe voor algemene bacteriën (fig. 2). De korte staven werden met name waargenomen infiltreren in de erosie. Zij werden ook waargenomen in intracellulaire epitheelcellen, maar ook binnen neutrofiele granulocyten. De bacteriële kolonisatie van de maag werd beperkt tot de laesie als geen bacteriën werden waargenomen in de overeenkomstige gezonde slijmvlies monster. Figuur 1 Focal erosieve laesie (witte pijl) aan te tonen bacteriële gastritis bij histologisch onderzoek. Laesie was ongeveer 2 × 2 cm en gelegen in het antrum in de buurt van de pyloric ingang.
Figuur 2 maagslijmvlies met erosieve gastritis geassocieerd met bacteriën. Het slijmvliesoppervlak en aangrenzende celresten wordt zwaar gekoloniseerd door bacteriën (rood). Enkele bacteriën worden gezien in de intracellulaire intact epitheel (pijlpunt) als binnen gedegenereerde en necrotische epitheelcellen (pijl). Bovendien zijn bacteriën in granulocyten. Fluorescente in situ hybridisatie met de probe gericht Bacteria, filterset 43, bar = 25 pm.
Klonering en sequencing
basis van de morfologie en de intensiteit van bacteriën aangetoond met FISH, submonsters van de C /C monsters werden geselecteerd klonering en sequentiebepaling van die monsters waaronder die met bacteriële gastritis. Website van gekozen deelmonsters magen tonen verschillende bacteriën morfologieën, twee verschillende klonen werden gevonden in normaal uitziende mucosa monsters (samples c), één kloon had 99% overeenkomst tot Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AB370881) en het andere type van klonen had 99% gelijkenis met Sarcina ventriculi
DSM 316 (X76650).
van de laesies (C monsters), werden klonen ook gevonden met 99 % gelijkenis met Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AF182725). Van het slijmvlies met bacteriële gastritis, vier van de tien klonen geëvenaard 100% Enterococcus faecium
, terwijl de overige zes klonen (verkregen sequentie gedeponeerd bij GenBank met de toetreding no. GQ423062) behoorde tot een Escherichia zoals
bacterie. Een fylogenetische boom werd geconstrueerd met de zes Escherichia
zoals klonen uit de laesie en hadden allemaal 100% gelijkenis met het type stammen van zowel E. fergusonii Kopen en Shigella flexneri
(figuur 3). Toepassing van een gamma-proteobacteria specifieke probe korte staven infiltreren het epitheel alsook intracellulaire gevonden in neutrofiele granulocyten werden geverifieerd als Escherichia
dergelijke bacterie terwijl Enterococcus faecium
organismen geïdentificeerd kolonisatie de epitheliale oppervlak door Enterococcus specifieke probe (figuur 4 en 5). Figuur 3 een fylogenetische boom van 16S rRNA gensequentie overeenkomst, waarop de plaats van de zes klonen die tot Gammaproteobacteria in Paard 50L en de meest nauw verwante soort stammen die behoren tot het genus Escherichia. De zes klonen (acc.no. GQ423062) had 100% overeenkomst met Shigella flexneri Kopen en E. fergusonii
. Enterobacter sakazakii (AB004746) als een buitengroep. Sequence toetreding nummers worden gepresenteerd.
Figuur 4 maagslijmvlies van het paard 50L met erosieve gastritis geassocieerd met bacteriën. Het aanbrengen van een fluoresceïne-gelabelde probe voor Gammaproteobacteria en een Cy3 gelabelde probe voor Enterococcus, een E. coli
als organisme (groen) (pijlpunt) bleek intracellulaire binnen epitheelcellen en op het epitheliale oppervlak, terwijl E. faecium (rood) ( ' white Star '(alleen gekoloniseerd de epitheliale oppervlak. Filter set 43/38, bar = 10 micrometer.
Figuur 5 maagslijmvlies van het paard 50L met erosieve gastritis geassocieerd met bacteriën. hoge vergroting demonstreren E. coli
zoals stangen ( groen) binnen geëxtrudeerde epitheelcellen. Fluorescent in situ hybridisatie met de probe gericht Gammaproteobacteria, filter instellen 38, bar = 10 micrometer.
Discussie
Vorige studies waarbij de paarden maag hebben, bv gebruikt PCR gericht op de 16S rRNA gen van bijzonder
Helicobacter spp. [12]. de nadelen onder gebruikmaking van PCR is dat de hoeveelheid en locatie van de bacteriën niet bekend en het is onzeker of de bacteriën levend zijn of zelfs als het DNA naakte. Daarom werd besloten dat met de FISH techniek beter en meer informatie van de bacteriën in de voormaag van het paard zou opleveren, aangezien deze problemen worden overwonnen met deze techniek. Deze techniek is eerder gebruikt om de ruimtelijke verdeling van Helicobacter spp
beschrijven. in het maagdarmkanaal van honden en in de maag van gezonde paarden de microbiota van de normaal uitziende squameuze en glandulaire mucosa [15, 16] tonen. Voor zover ons bekend is dit de eerste studie met behulp van FISH om letsels van de glandulaire maag te onderzoeken.
In de huidige studie een geval van gastritis geassocieerd met bacteriële kolonisatie werd geopenbaard. Vooral de verdeling van bacteriën suggereerde een verbinding met de pathologie waargenomen. De hoeveelheid bacteriën aanzienlijk verhoogd rond de laesie en werden stevig gehecht aan de epitheliale cellen met de bacteriën zich in de crypten en intracellulair. De klonering toonde aan dat het een dubbele infectie met Enterococcus faecium Kopen en een Escherichia
zoals bacterie, maar het werd vervolgens met behulp van de in situ hybridisatie
met een gamma-proteobacteria sonde dat enkel de Escherichia
zoals bacterie die de oppervlakkige zweren geïnfiltreerd en bleken intracellulaire in epitheelcellen en in neutrofiele granulocyten. Enterobacteriën infectie in de darm is een bekend verschijnsel, maar het is zeldzaam om deze infecties in de maag te vinden en het is nooit eerder gerapporteerd bij volwassen paarden. Dit resultaat is zeer intrigerend, maar verdere studies nodig om duidelijk te maken hoe vaak dit fenomeen is bij paarden. Ook, of dit type infectie is van primaire of secundaire herkomst zou verdere verduidelijking nodig. De Escherichia
zoals klonen hadden allemaal 100% 16S rRNA-gen gelijkenis met beide E. fergusonii Kopen en Shigella flexneri
. Dus in dit onderzoek kan niet experimenteel preciseren welke van de twee organismen die aanwezig zijn in deze klier letsel waren. Echter heeft de mens is dat het de enige natuurlijke gastheer zijn voor Shigella
[17] dat E. fergusonii
is geassocieerd met een breed scala van intestinale en extra-intestinale infecties bij mens en dier waaronder paarden [18 , 19]. Het is dan ook zeer waarschijnlijk dat de Escherichia
dergelijke bacterie gevonden in deze studie maakt deel uit van E. fergusonii
. Studies hebben gemeld E. fergusonii
als opkomende pathogenen en gekoppeld aan vooral bacteriëmie en wondinfectie maar de precieze rol bij infecties bij mens en dier nog moet verduidelijkt worden [20].
Microbiology in de monsters
het milieu in de kliermaag algemeen zeer vijandig naar microben [21]. Het staat vast dat, in tegenstelling tot mensen en honden die maaltijd feeders, paarden doorlopend zuurproducenten waarschijnlijk door een continu voedingspatroon [22, 23]. De pH in het ventrale deel van de paarden maag stabiel is bij ongeveer pH 1-3 gedurende de periode van 24 uur [24] bijgevolg de relatief lage diversiteit van bacteriën waargenomen in mucosale monsters in deze studie was niet onverwacht. Ondernemingen De karakteristieke morfologische fenotype van grote kokken groeien in reguliere tetrads werd opgericht om een ​​kloon met een 99% gelijkenis met Sarcina ventriculi
zijn. Dit organisme is bekend om te kunnen groeien maaginhoud en heeft het kenmerk tetrade structuur bij kweek van pH 1- pH 3 [25]. In de huidige studie, kan het vinden van deze organismen niet worden vastgesteld deel van elke pathologie, omdat zij in lage aantallen in de gepaarde monsters (d.w.z. laesie en normaal), en in de controlemonsters. Sarcina-achtige bacteriën gevonden in een aantal soorten, wanneer zij zijn verondersteld lebmaag bloat, bloedingen en zweren in lammeren en geitkalveren veroorzaken [26, 27] en een mogelijk verband dilatatie in zowel honden en paarden ook gesuggereerd [28]. Geen bewijs van gasvoorkomens werd macroscopisch waargenomen in elk van deze paarden en dus het lijkt niet dat de aanwezigheid van Sarcina ventriculi
bijgedragen aan de pathologie waargenomen in deze paarden.
Het was niet verwonderlijk dat Lactobacillus (Lactobacillus salivarius
) werd gevonden in de bestudeerde weefsels en van tevoren is gemeld dat verschillende Lactobacillus
spp., waaronder L. salivarius
, bij gezonde paarden [16, 29] zijn. Het proximale maag paarden functioneert als opslag voor diervoeder, en een compartiment voor intragastrische fermentatie. Het ecosysteem in dit gebied bestaat uit zowel anaërobe en lactaat gebruik bacteriën in grote aantallen, die verantwoordelijk zijn voor de toename van vluchtige vetzuren na fermentatie van koolhydraten [30] zijn. Vooral Lactobacilli bleken vast te houden aan het epitheel in het proximale deel van de paarden maag [31] en deze bacteriën zal waarschijnlijk doorgeven aan de glandulaire maag als onderdeel van de normale turn-over. We hebben alleen onderzocht deelmonsters en meer bacteriële taxa is te vinden in het gezonde deel van de voormaag als een meer uitgebreide microbiota gemeenschap studie werd gedaan.
Geldigheid van de bevindingen van Helicobacter
Geen van de weefselmonsters van het antrum regio aangetoond positieve signalen van de Helicobacter spp
. sonde in deze studie en geen spiraalvormige bacteriën werden waargenomen met de FISH techniek niet. In een recente studie van Venezuela, werden spiraalvormige bacteriën gemeld in biopten van de cardiale gebied van paarden maag gekleurd met de Warthin-Starry vlek [12]. Helicobacter spp
. bekend kunnen de maag koloniseren grote hoeveelheden cytoplasmatische urease [32] De snelle ureasetest in dit onderzoek Pyloritek ®, detecteert de urease-activiteit van het weefselmonster door de productie van ammoniak als ureum aanwezig is. Het wordt uitgebreid gebruikt in de humane praktijk gastritis veroorzaakt door Helicobacter spp
detecteren. De positieve en negatieve voorspellende waarden lagen tussen 98,1-100% en 95,8-100%, respectievelijk in een studie, waarbij menselijke patiënten voor en na uitroeiing van de bacterie [33]. In deze studie werden geen positieve tests gevonden, wat aangeeft dat de biopten in deze studie bevatte geen bacteriën met de mogelijkheid om urease produceren.
Conclusies
Gastric Helicobacter
spp. werd niet gevonden en kon niet worden gekoppeld aan de maag laesies van de 36 paarden geanalyseerd in deze studie. De pathologie gevonden in deze studie omvatte polypoid structuren, hyperplastische rugae en kleine erosies, maar bacteriële betrokkenheid werd gevonden in slechts één geval van een erosie. In dit letsel, een Escherichia-achtige kloon, waarschijnlijk E. fergusonii
, werd gevonden intracellulaire. Of dit een primair of secundaire infectie kon niet worden geconcludeerd. Zeer beperkte hoeveelheden bacteriën in het algemeen gevonden in de paarden glandulaire regio zoals verwacht. Aldus detectie van een matige tot grote hoeveelheden bacteriën in de glandulaire mucosa niveau als in de crypten moet reden voor bezorgdheid dit lijkt niet een normale bevinding bij paarden glandulaire maag. Verdere studies waarbij bacteriën en de relatie met de maag laesies van paarden met bevestigde klinische symptomen zijn gerechtvaardigd, aangezien deze paarden niet waren opgenomen in de huidige studie.
Methoden
Paarden en onderzoeksopzet
De studie werd gedaan als een cross-sectionele studie van magen uit een populatie van 63 slachthuis paarden in Denemarken. Paarden werden goedgekeurd door de Veterinary Officer zo gezond voor de slacht. Paarden werden verdoofd met een penschiettoestel en leeggebloed. De maag, met inbegrip van 5-10 cm van het distale slokdarm en 10 cm van het proximale duodenum, werd onmiddellijk nadat de ingewanden verwijderd en geopend langs de grote curvatuur. Voedselmassa werden verwijderd en indien nodig werd de mucosa voorzichtig gespoeld met minimaal leidingwater vóór inspectie. Slechts magen met macroscopische laesies in de glandulaire mucosa bevatten, evenals zeven control magen zonder grove bewijs van gastrische lesies.
Glandular laesies gedefinieerd als het slijmvlies met een abnormale macroscopische verschijning dwz hyperemisch, grotere dikte, erosies of zweren . De anatomische posities van de lesies werden genoteerd als: de cardia, corpus of antrum gebied (fig. 6). Figuur 6 anatomische gebieden van het maag geopend langs de grote curvatuur. De non-glandulaire regio heeft een witte verschijnen epitheel, terwijl de klieren regio tinten rood. Ze worden van elkaar gescheiden door de Margo plicatus
. Deze drie regio's zijn onder meer: ​​Cardia als het kleine strip gebied net onder en langs de margo plicatus
, het corpus gebied dat zuur, pepsinogen en slijm afscheidende klieren (donker rood) en de antrum gebied dat primarly slijm en gastrine afscheidende klieren.
Bemonsteringsprocedure
uit elke glandulaire maag met laesies, drie weefselmonsters verkregen wanneer de grootste laesie (a, B, C) en drie gepaarde normaal uitziende weefselmonsters (a, b, c) vanaf dezelfde anatomisch gebied, maar in ieder geval ten minste 5 cm. A /a: een kleine biopsie formaat (0,5 x 0,5 cm) mucosa monster werd verkregen onmiddellijk ureasetest de Pyloritek ® bepaling volgens de instructies van de fabrikant. De tests werden afgelezen na een 60 minuten standaard tijd en de resultaten genoteerd als positief of negatief. Monsters B /b: 3 x 3 cm volledige dikte weefselmonster inclusief mucosa en submucosa werden verkregen voor vis en in 10% gebufferde formaline gefixeerd. . Na 24 uur fixatie werden de monsters overgebracht naar 70% ethanol, paraffine ingebedde, gesegmenteerd op 3 pm en gemonteerd op SuperFrost /plus dia's (Menzel-Gläser, Braunschweig Duitsland)
Monsters C /c: een derde paar weefsel monsters voor klonering en sequentie werd verkregen en snel bevroren met behulp van droogijs (Als laesiegrootte toeliet).
van de zeven control magen zonder macroscopische maaglesies, monsters a, b en c werden uit de normaal uitziende slijmvlies van de antrum. Drie van deze paarden werden bovendien bemonsterd in de cardia, corpus en de twaalfvingerige darm ook. Ondernemingen De bemonstering vond plaats van augustus tot oktober 2007. Historische gegevens met betrekking tot de vorige gezondheid van de paarden kon niet worden verkregen.
Fluorescent In Situ hybridisatie bacteriën
voor microbiële detectie werden de weefselcoupes gelijktijdig gehybridiseerd met twee 16S rRNA probes gelabeld met verschillende fluoroforen. De oligonucleotide probe S-D-BACT-0338-a-A-18 gericht Bacteria (5'GCTGCCTCCCGTAGGAGT3) [34] was 5 'gelabeld met fluoresceïne isothiocyanaat en isothiocyanaat derivaten Cy3. De oligonucleotideprobe HEL717 gericht Helicobacter genus (5'AGGTCGCCTTCGCAATGAGTA3) [35] was 5 'gemerkt met Cy3 isothiocyanaat derivaat. Om het klonen resultaten te controleren een derde en vierde sonde, LC-gProt-1027-aa-17 (5'GCCTTCCCACATCGTTT3 ') richten 23S van Gammaproteobacteria was 5' gelabeld met het fluoresceïne isothiocyanaat en probe SG-Enteroco-184 (5'CAAATCAAAACCATGCGG3 ) was Cy3 gemerkte gericht 16S rRNA van Enterococcus spp
[36]. Alle probes werden gesynthetiseerd bij DNA Technology, Aarhus, Denemarken. De objectglaasjes werden van paraffine ontdaan in xyleen en overgebracht naar 100% alcohol gedurende 30 minuten voor hybridisatie. De hybridisatie werd uitgevoerd bij 45 ° C met 40 ml hybridisatiebuffer (100 mM Tris [pH 7,2], 0,9 M NaCl, 0,1% natriumdodecylsulfaat) en 200 ng van elke probe gedurende 16 uur in een Sequenza Slide Rek (Thermo Shandon, Cheshire, UK). De monsters werden vervolgens drie keer gewassen in voorverwarmde (45 ° C) hybridisatie buffer gedurende 15 minuten en vervolgens driemaal in voorverwarmde (45 ° C) wasoplossing (100 mM Tris [pH 7,2], 0,9 M NaCl). De monsters werden met water gespoeld, aan de lucht gedroogd en aangebracht in Vectashield (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) voor epifluorescentie microscopie. Een Axioimager M1 epifluorescentie microscoop uitgerust voor epifluorescentie met een 100 W HBO-lamp en filter sets 43 en 38 werden gebruikt voor Cy3 visualiseren en fluoresceïne respectievelijk. Beelden werden verkregen met een Axiocam MRM versie 3 FireWiremonocrome camera en de software AxioVision versie 4.5 (Carl Zeiss, Oberkochen, Duitsland).
Evaluatie van epifluorescentie microscopie werd uitgevoerd door beschrijving van de persoonlijke bedrag morfologische weergave en locatie van fluorescerende cellen blijkt in elk weefselmonster. Bovendien werden alle coupes gekleurd met H &E en histopathologisch onderzocht 16S rDNA amplificatie en klonen
Na de detectie van bacteriën via FISH, werden monsters van sub paarden tonen bacteriën van verschillende morfologieën gekozen 16S rRNA gen
. klonen. Het DNA werd geïsoleerd uit 4 weefselmonsters door het Easy-DNA-kit (Invitrogen, Tåstrup, Denemarken) volgens de instructies van de fabrikant. Het 16S rRNA-gen werd geamplificeerd met behulp van primers SD-Bact-0008-AS-20 (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ') [37] en S - * - Univ-1492-aA-19 (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') [38]. PCR cycling bestond uit een initiële denaturatie bij 94 ° C gedurende 6 min; gevolgd door 30 cycli van denaturatie bij 94 ° C gedurende 30 seconden, hybridisatie bij 55 ° C gedurende 45 s en verlenging bij 72 ° C gedurende 2 min; en een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 3 min. Geamplificeerde DNA werd gecontroleerd door elektroforese op agarosegels. De PCR producten werden gezuiverd met het QIAquick PCR zuiveringssamenstel kolommen (Qiagen GmbH, Hilden, Duitsland). Stompe uiteinden DNA werd het volgende gemengd in een 0,5-ml microcentrifuge buis 4 pl 5 x T4 DNA polymerase buffer, 14,7 pi gezuiverd PCR product te creëren 0,8 pl dNTP (2,5 mmol l -1 elk) en 0,5 ui (1,2 U) T4 DNA-polymerase (Invitrogen) en geïncubeerd bij 12 ° C gedurende 15 minuten. T4 DNA polymerase werd door warmte geïnactiveerd, en de stompe uiteinden werd DNA gezuiverd met het QIAquick PCR zuiveringssamenstel kolommen (Qiagen GmbH) en geëlueerd in een uiteindelijk volume van 10 ui dubbel gedestilleerd water. Volgende beschrijvingen van de fabrikant werd de klonering uitgevoerd met behulp van een stompe Zero TOPO klonering kit (Invitrogen). Tien kolonies van elke klonen werden opgepikt en gesequenced op een automatische sequentie analyse (ABI PRISM 373 DNA Sequencer, PE Biosystems, Foster City, CA, USA) met behulp van de twee standaard vector primers (T3 en T7) in de kit. De sequentie werd geassembleerd in BioNumerics versie 4.0 (Toegepaste Wiskunde, Sint-Martens-Latem, België) en gecontroleerd op hersenschimmen zowel door stralen van de individuele sequenties in GenBank http:.... //Www NCBI NLM nih gov en door de software Pijlstaart versie 1.1 http:... //www Cardiff ac uk /biosi /onderzoek /Biosoft /. De fylogenetische analyse van de klonen die behoren tot de Escherichia
genus werd gedaan door het downloaden van 16S rRNA-gen sequenties langer dan 1200 bp van het RDP v.9 database van het Escherichia
type stammen. Http: //rdp cme . MSU. edu. De sequenties werden geknipt met dezelfde lengte van 1327 bp en uitgelijnde paarsgewijze (UPGMA) gevolgd door een globale sequentie-uitlijning. Een laatste fylogenetische boom werd geconstrueerd met behulp van de WARD algoritme waarin Enterobacter sakazakii
(AB004746) werd gebruikt als outgroup.
Verklaringen
Dankwoord
De auteurs willen bedanken Hanne H. Møller, Katja Kristensen en Johanna Z Amenuvor voor technische bijstand in de laboratoria. Ook dank aan Stina Vesterholm voor het helpen van het verzamelen van weefsels. Dit werk werd ondersteund door Kongeriget Danmark Horseinsurance g /s en Intervet Denemarken. Sponsors had geen betrokkenheid bij de praktische gedeelte of de conclusies van dit onderzoek.
Authors 'originele ingediende dossiers voor afbeeldingen
Hieronder staan ​​de links naar de auteurs oorspronkelijke ingediende dossiers voor afbeeldingen. 'Originele bestand voor figuur 1 12866_2009_1040_MOESM2_ESM.tiff Authors' 12866_2009_1040_MOESM1_ESM.tiff Auteurs originele bestand voor 'originele bestand voor figuur 3 12866_2009_1040_MOESM4_ESM.tiff Authors' figuur 2 12866_2009_1040_MOESM3_ESM.pdf Auteurs originele bestand voor figuur 4 originele bestand 12866_2009_1040_MOESM5_ESM.tiff Authors 'voor figuur 5 oorspronkelijke bestand 12866_2009_1040_MOESM6_ESM.jpeg Authors 'voor figuur 6

• Oprichting en identificatie van een konijn model van peritonitis carcinomatosa uit de maag cancer
• NO-geïnduceerde beweeglijkheid effecten maagfundus en pylorus van sGCβ1his105phe mutante muizen