L'examen des lésions de l'estomac glandulaire équins pour les bactéries, y compris Helicobacter spp par fluorescence in situ hybridisation

examen des lésions de l'estomac glandulaire équins pour les bactéries, y compris Helicobacter spp
par fluorescence de l'hybridation in situ de
Résumé de l'arrière-plan
L'estomac glandulaire équine est généralement affectée par l'érosion et l'ulcération. Le but de cette étude était d'évaluer si les bactéries, y compris Helicobacter, pourraient être impliqués dans l'étiologie des lésions glandulaires gastriques observés chez les chevaux.: Résultats
lésions de l'estomac, ainsi que la muqueuse apparaissant normales ont été obtenues à partir des chevaux abattus pour la consommation humaine. Tous les échantillons ont été testés pour l'activité uréasique utilisant le Pyloritek ® test, tandis que la teneur en bactéries muqueuse a été évaluée en utilisant Fluorescence In Situ de Hybridation. Dans les sous échantillons sélectionnés, les bactéries caractérisation a été poursuivie par le clonage et le séquençage. Les lésions muqueuses ont été trouvés dans les estomacs et 36/63 inclus rugae hyperplasiques, structures polypoïdes et des érosions focales. Aucun des échantillons ont été testés positifs pour l'activité uréase ou FISH en utilisant la sonde spécifique du genre Helicobacter. Dans les échantillons de lésions, ainsi que des échantillons normaux, clones avec 99% des similitudes avec Lactobacillus salivarius
et Sarcina ventriculi
ont été trouvés. Escherichia
comme des clones de bactérie et clones Enterococcus ont été démontrées dans l'une érosion focale. Basé sur un arbre phylogénétique ces clones avaient 100% de similarité avec Escherichia fergusonii et Enterococcus faecium
. Le Enterococcus ont été trouvés colonisant la surface de la muqueuse, tandis que E.
fergusonii organismes ont également été démontrées intraépithéliale.
Conclusion
gastrique Helicobacter spp. n'a pas pu être vérifié comme étant impliqués dans les lésions de l'estomac glandulaire du cheval. Depuis E. fergusonii
a été décrit comme un pathogène émergent chez les humains et les animaux, la découverte de cette bactérie dans des bons de souscription d'érosion gastrique des éclaircissements pour savoir si l'infection gastrique avec ce type bactérie est important pour les chevaux.
Fond
Chez les chevaux, les lésions de la partie non-glandulaire de l'estomac sont très répandues et semblent être causés par une exposition excessive d'acide [1], mais peu a été décrit en ce qui concerne les lésions dans la partie glandulaire. Lésions situées dans la région glandulaire ont été démontrées dans 58% des 162 chevaux hospitalisés [2] et dans 47% des 345 chevaux de course [3] et alors que la cause de ces n'a pas reçu beaucoup d'attention, l'exposition de l'acide ne semble pas être le principal facteur , comme aucune corrélation entre les lésions des deux régions de l'estomac a été trouvé [3].
bactéries gastriques comme la cause de lésions de l'estomac glandulaire ont été proposées pour de nombreuses espèces animales et chez l'homme ceux-ci constituent un facteur de risque majeur vérifié. Parmi les organismes gastriques trouvés, Helicobacter pylori
a été décrit plus en raison de son potentiel pathogène d'induire une gastrite chronique, les ulcères, les adénocarcinomes et les muqueuses tissu lymphoïde associé (MALT) lymphome chez l'homme [4-6]. Les bactéries de ce genre ont également été trouvées dans des échantillons de tissus gastriques des animaux, y compris les chiens, les porcs, les moutons et les bovins [7-10].
Chez le cheval, des preuves contradictoires sort quant à savoir si les bactéries qui peuvent causer des lésions gastriques spécifiquement se produisent. Quelques études ont indiqué que Helicobacter gastrique spp
. sont présents dans la muqueuse apparaissant normale en utilisant la PCR et de l'immunochimie [11, 12], tandis que d'autres ont trouvé aucune preuve d'un lien entre la présence de lésions et des bactéries [13]. Comme espèces bactériennes gastriques ont été confirmés ou suggérés dans le cadre de la pathogenèse de certains types de pathologies gastriques chez les humains et d'autres espèces animales, le but de cette étude était d'évaluer si les bactéries pourraient être impliqués dans la pathologie observée dans l'estomac glandulaire équine. Un objectif principal était de fournir davantage de preuves concernant la présence et la localisation des bactéries en général au niveau de l'estomac glandulaire équine de la muqueuse. Un accent particulier a été mis sur l'obtention d'informations sur la présence et la participation de toute Helicobacter espèces
dans les lésions des muqueuses. L'hybridation fluorescente (FISH) La technique de in situ a été utilisée à cette fin qui permet l'utilisation de sondes ARNr ciblées à la fois pour la population bactérienne totale et genre /espèce définies. Cette approche permet la détermination de la morphologie bactérienne, l'abondance, l'emplacement dans les tissus, et même des indications sur les taux de croissance et les activités physiologiques [14]. Résultats de
lésions glandulaires brutes ont été observées dans 36 des 63 estomacs examinés (57,1 %). La majorité des lésions ont été observées dans la région antrale (91,7%). Dans six estomacs, les lésions ont été observées en plus ou exclusivement dans la région du cardia ou corpus. Aucune lésion n'a été trouvé dans le duodénum
Les lésions ont été classés en trois groupes:. Polypeuses (2 estomacs avec des masses polypoïdes situées à la fois dans le cardia et l'antre avec des tailles comprises entre 1 et 5 cm de diamètre), ii: rugae hyperplasiques lésions (13 estomacs) ou iii:. hyperhémiques, érosives ou ulcéreuses lésions, qui ont été vus dans 21 estomacs
le rugae hyperplasiques ont tous été vus dans l'antre et allaient d'avoir une hyperémie intense avec exsudat à rugae avec normalement apparaissant surface muqueuse. épaississement brut de l'rugae antrale a été causée principalement par une hyperplasie de la fovéoles gastrique par rapport aux échantillons normaux respectifs. Les lésions restantes ont toutes été jugées petites lésions solitaires ne dépassant pas environ 1 x 2 cm. Domaines d'intervention de gastrite érosive a été les résultats les plus communes de ces lésions de type et caractérisés comme desquamation des cellules superficielles de l'épithélium luminal avec un exsudat fibrino concurrente, les débris cellulaires luminal et un infiltrat de cellules principalement mononucléaires de la lamina propria. érosions profondes trouvées dans les estomacs 9 érodées à la fois la zone des fosses gastriques et des parties des glandes, qui a été observée avec gastrite seulement des tissus immédiats. Un vrai ulcère a été trouvé l'extension de la pleine épaisseur de la lamina propria, exposant la musculeuse lamina à la lumière. Un maximum de deux lésions ont été trouvés dans chacun de ces estomacs.
Helicobacter et l'activité uréasique essai
En utilisant la sonde spécifique genre Helicobacter pas de signaux positifs ont été trouvés dans l'un des échantillons de tissus 79 (36 échantillons appariés et 7 contrôles) . En accord avec ces résultats du FISH, aucun des échantillons testés positifs pour l'activité uréasique soit. Les contrôles internes de tous les tests d'uréase ont été trouvés positifs comme une indication d'un kit de test fonctionnel.
bactéries dans
général En général, seules quelques bactéries ont été observées liées à la surface de la muqueuse dans les deux blessés, ainsi que dans l'estomac sain échantillons. Dans l'ensemble, les quatre différents types morphologiques de cellules bactériennes peuvent être visualisées avec la sonde eubactéries: 1) les petits courts (de 0,2 à 0,5 um) tiges coccoïdes, 2) des tiges distinctes (1 x 3 um), 3), des tiges à chaîne longue (jusqu'à 60 um) ou 4) de grand diamètre um 2-3), les bactéries (coccus divisant clairement en paires. En règle générale, lorsqu'il est présent, les bactéries ont été observées dans les groupes associés à des particules d'alimentation ou situés à proximité de la surface de la muqueuse
Preuve de la gastrite bactérienne a été trouvé dans une lésion de l'estomac grossièrement caractérisée comme une érosion solitaire, 1 × 2 cm de taille, le centre étant hyperémie et entouré par un rebord épithéliale proliférative (Fig. 1). Microscopiquement, l'érosion focale de la muqueuse avec suintement des érythrocytes et des leucocytes, principalement d'origine neutrophile, a été vu. Les exsudats ont en outre été observés dans les fosses gastriques. Une réaction inflammatoire cellulaire avec des cellules mononucléaires a été vu étendant aussi profond que dans la musculeuse lamina. La surface de la muqueuse enflammée et les fosses gastriques ont été trouvés fortement colonisés par cocciforme de barres courtes pour appliquer la sonde bactérienne générale (fig. 2). Les tiges courtes ont été observées en particulier l'infiltration de l'érosion. Ils ont également été observées intracellulaire dans les cellules epitheliales, ainsi que dans les granulocytes neutrophiles. La colonisation bactérienne de l'estomac a été limitée à la lésion car aucune bactérie n'a été observé dans l'échantillon de muqueuse saine correspondante. Figure 1 lésion érosive focale (flèche blanche) démontrant la gastrite bactérienne à une évaluation histologique. Lésion était d'environ 2 x 2 cm et situé dans l'antre près de l'entrée du pylore.
Figure 2 muqueuse gastrique avec gastrite érosive associée à des bactéries. La surface de la muqueuse et les débris cellulaires adjacents est fortement colonisées par des bactéries (rouge). Certaines bactéries sont considérées intracellulaire dans l'épithélium intact (pointe de flèche), ainsi que dans les cellules épithéliales dégénérées et nécrosées (flèche). En outre, les bactéries se trouvent dans les granulocytes. Fluorescent hybridation in situ avec la sonde ciblant les bactéries dans, jeu de filtres 43, bar = 25 um Clonage et séquençage du
. Sur la base de la morphologie et de l'intensité des bactéries démontrées en utilisant FISH, des sous-échantillons des échantillons /c C ont été sélectionnés pour le clonage et le séquençage de représentant des échantillons, y compris celui avec la gastrite bactérienne.
Parmi les sous-échantillons choisis de l'estomac montrant diverses bactéries morphologies, deux types de clones différents ont été trouvés dans des échantillons de muqueuse apparaissant normales (échantillons de c), un clone avait 99% de similarité Lactobacillus salivarius à
JCM 1231 (AB370881) et l'autre type de clones avaient 99% de similitude avec Sarcina ventriculi
DSM 316 (X76650).
des lésions (échantillons C), des clones ont également été trouvés avec 99 % de similarité avec Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AF182725). De la muqueuse avec la gastrite bactérienne, quatre des dix clones appariés 100% Enterococcus faecium
, tandis que les six clones restants (séquence obtenue déposée à GenBank avec le no. GQ423062) appartenait à une Escherichia comme
bactérie. Un arbre phylogénétique a été construit avec les six Escherichia
comme des clones de la lésion et tous avaient 100% de similitude avec les souches de type à la fois E.
fergusonii et Shigella flexneri
(fig 3). L'application d'une sonde spécifique de protéobactéries gamma les tiges courtes infiltrant l'épithélium, ainsi que l'on trouve intracellulaire dans les granulocytes neutrophiles, ont été vérifiés comme Escherichia
comme bactérie Enterococcus faecium tout
organismes ont été identifiés colonisant la surface épithéliale par la sonde spécifique Enterococcus (figure 4 et 5). Figure 3: Un arbre phylogénétique des séquences d'ARNr 16S des gènes de similarité, montrant la position des six clones appartenant à Gammaproteobacteria trouvée dans cheval 50L et les souches les plus étroitement apparentées du type appartenant au genre Escherichia. Les six clones (acc.no. GQ423062) avaient 100% de similarité avec Shigella
flexneri et E. fergusonii
. Enterobacter sakazakii (AB004746) a été utilisé comme un exogroupe. numéros d'accession de la séquence sont présentés.
Figure 4 muqueuse gastrique du cheval 50L avec gastrite érosive associées à des bactéries. L'application d'une sonde marquée à la fluorescéine pour Gammaproteobacteria et une sonde marquée au Cy3 pour Enterococcus, une bactérie E. coli comme organisme
(vert) (pointe de flèche) a été trouvée intracellulaire dans les cellules épithéliales et sur la surface de l'épithélium tandis que E.faecium (rouge) ( ' étoile blanche '(seulement colonisé la surface épithéliale. le jeu de filtre 43/38, bar = 10 pm.
Figure 5 muqueuse gastrique du cheval 50L avec gastrite érosive associées à des bactéries. Fort grossissement montrant E. coli
comme des tiges ( vert) dans les cellules épithéliales extrudés. fluorescent hybridation in situ avec la sonde de ciblage Gammaproteobacteria dans, jeu de filtres 38, bar = 10 pm Rapport
des études antérieures impliquant l'estomac équine. ont par exemple utilisé PCR ciblant le gène ARNr 16S de particulier Helicobacter
spp. [12]. les inconvénients en utilisant la PCR sont que la quantité et la localisation des bactéries ne sont pas connues et on ne sait pas si les bactéries sont vivantes ou même si l'ADN est nu. Par conséquent, il a été décidé que l'utilisation de la technique FISH offrirait une meilleure et plus d'informations des bactéries présentes dans l'estomac glandulaire du cheval, car ces questions sont surmontés avec cette technique. Cette technique a déjà été utilisée pour décrire la distribution spatiale de Helicobacter spp. dans le tractus gastro-intestinal des chiens et dans l'estomac des chevaux sains pour démontrer la flore microbienne de l'apparition muqueuse squameuse et glandulaire normale [15, 16]. Au meilleur de notre connaissance, il est la première étude en utilisant FISH pour examiner les lésions de l'estomac glandulaire.
Dans la présente étude un cas de gastrite associée à la colonisation bactérienne a été révélé. En particulier, la distribution des bactéries a suggéré un lien avec la pathologie observée. La quantité de bactéries a été nettement augmentée autour de la lésion et on adhère fermement aux cellules épithéliales, les bactéries se prolongeant dans cryptes et intracellulaire localisé. Le clonage a montré qu'il était une double infection par Enterococcus faecium
et une Escherichia
comme bactérie, mais il a ensuite été vérifiée en utilisant l'hybridation de situ avec de gamma protéobactéries dans la sonde qu'il était seulement le Escherichia
comme bactérie qui a infiltré les ulcérations superficielles et ont été trouvés intracellulaire dans les cellules épithéliales et dans les granulocytes neutrophiles. infection entérobactéries dans l'intestin est un phénomène courant, mais il est rare de trouver ces infections dans l'estomac et il n'a jamais été rapporté chez les chevaux adultes. Ce résultat est très intéressant, mais d'autres études doivent préciser comment ce phénomène est commun chez les chevaux. En outre, si ce type d'infection est d'origine primaire ou secondaire nécessiterait des éclaircissements supplémentaires. L'Escherichia
comme des clones avaient tous 100% 16S ARNr gène similitude à la fois E.
fergusonii et Shigella flexneri
. Ainsi, dans cette étude, il ne peut pas être précisé expérimentalement lequel de ces deux organismes qui étaient présents dans cette lésion glandulaire. Cependant, les humains ont été signalés à être le seul hôte naturel pour Shigella
[17], tandis que E. fergusonii
a été associée à une grande variété de intestinales et extra-intestinales infections chez les humains et les animaux, y compris les chevaux [18 19]. Il est donc très probable que le Escherichia
comme bactérie trouvée dans cette étude appartient à E. fergusonii
. Des études ont rapporté E. fergusonii
comme un pathogène émergent et associé à particulier bactériémie et infection de la plaie, mais son rôle précis dans les infections chez les humains et les animaux doit encore être élucidé [20] de. Microbiologie dans les échantillons
l'environnement dans l'estomac glandulaire est généralement très hostile envers les microbes [21]. Il est bien établi que, contrairement aux humains et les chiens qui sont alimentateur repas, les chevaux sont producteurs d'acide continus, probablement en raison d'un motif d'alimentation continue [22, 23]. Le pH dans la partie ventrale de l'estomac équin est stable à environ pH 1-3 pendant toute la période de 24 heures [24], par conséquent, la faible diversité relative des bactéries observées dans les échantillons de la muqueuse dans cette étude était pas inattendue.
La caractéristique phénotype morphologique de grande cocci de plus en plus tétrades réguliers a été créé pour être un clone avec une similitude de 99% à Sarcina ventriculi
. Cet organisme est connu pour être en mesure de croître dans les contenus stomacaux et a la structure de tétrade caractéristique lorsqu'elles sont cultivées à partir de pH 1- pH 3 [25]. Dans l'étude actuelle, la conclusion de ces organismes n'a pas pu être mis en place pour faire partie d'une pathologie spécifique, comme ils ont été trouvés en faible nombre dans les échantillons appariés (à savoir la lésion et normale), ainsi que dans les échantillons de contrôle. bactéries Sarcina semblables ont été trouvés dans une variété d'espèces, où ils ont été supposés provoquer le ballonnement caillette, d'hémorragies et d'ulcères chez les agneaux et les chevreaux [26, 27] et un lien possible de dilatation gastrique chez les chiens et les chevaux a aussi été suggéré [28]. Aucune preuve de l'accumulation de gaz a été observé macroscopiquement dans aucun de ces chevaux, et par conséquent, il ne semble pas que la présence de Sarcina ventriculi
contribué à la pathologie observée chez ces chevaux.
Ce ne fut pas surprenant que Lactobacillus (Lactobacillus salivarius
) a été trouvé dans les tissus étudiés et il a été précédemment rapporté que spp plusieurs Lactobacillus., y compris L. salivarius
sont présents chez des chevaux sains [16, 29]. Les fonctions proximales équins d'estomac comme le stockage pour l'alimentation, ainsi que d'un compartiment pour la fermentation intragastrique. L'écosystème dans cette région se compose de deux bactéries anaérobies et de lactate utilisant en grand nombre, qui sont responsables de l'augmentation des acides gras volatils lors de la fermentation des hydrates de carbone [30]. Surtout des lactobacilles ont été trouvés en adhérant à l'épithélium dans la partie proximale de l'estomac équine [31] et ces bactéries seront probablement passer à l'estomac glandulaire dans le cadre du turn-over normal. Nous avons seulement examiné les sous-échantillons et les taxons plus de bactéries se trouvent dans la partie saine de l'estomac glandulaire si une étude plus complète de la communauté de microbiote a été fait.
Validité des conclusions de Helicobacter
Aucun des échantillons de tissus provenant de l'antre région a montré des signaux positifs de l'Helicobacter spp
. sonde dans cette étude et aucune bactérie en forme de spirale ont été observées en utilisant la technique FISH non plus. Dans une étude récente du Venezuela, les bactéries en forme de spirale ont été signalés dans des biopsies de la région cardiaque de l'estomac équin teinté avec la tache Warthin-Starry [12]. Helicobacter spp
. connus pour être capables de coloniser l'estomac produisent de grandes quantités de uréase cytoplasmique [32] Le test d'uréase rapide utilisé dans cette enquête, Pyloritek ®, détecte l'activité uréase de l'échantillon de tissu par la production d'ammoniac lorsque l'urée est présente. Il est largement utilisé dans la pratique humaine pour détecter la gastrite provoquée par Helicobacter spp
. Les valeurs prédictives positives et négatives se situaient entre 98,1 à 100% et de 95,8 à 100%, respectivement dans une étude testant des patients humains avant et après l'éradication de la bactérie [33]. Dans cette étude, pas de tests positifs ont été trouvés, ce qui indique que les biopsies de la présente étude ne contenaient pas de bactéries avec la capacité de produire uréase.
Conclusions
spp gastrique Helicobacter. n'a pas été trouvé et ne pouvait être liée aux lésions de l'estomac des 36 chevaux analysés dans cette étude. La pathologie constatée dans cette étude comprenait des structures polypoïdes, rugae hyperplasiques et de petites érosions, mais la participation bactérienne a été trouvée dans un seul cas d'une érosion. Dans cette lésion, un clone d'Escherichia-like, très probablement E. fergusonii
, a été trouvé intracellulaire. Que ce fût une infection primaire ou secondaire n'a pas pu être conclu. de très faibles quantités de bactéries en général ont été trouvées dans la région glandulaire équine comme prévu. Ainsi, la détection d'un modéré à des quantités élevées de toutes les bactéries au niveau de la muqueuse glandulaire, ainsi que dans les cryptes devrait être un motif de préoccupation, car cela ne semble pas être une conclusion normale dans l'estomac glandulaire équine. D'autres études portant sur les bactéries et la relation avec les lésions gastriques des chevaux présentant des signes cliniques confirmés sont garantis, que ces chevaux ne sont pas inclus dans l'étude actuelle
. Méthodes
Chevaux et conception de l'étude
L'étude a été réalisée en tant que étude transversale des estomacs d'une population de 63 chevaux de l'abattoir au Danemark. Les chevaux ont été approuvés par le vétérinaire en bonne santé pour l'abattage. Les chevaux ont été assommés avec une tige perforante et saignés. L'estomac, y compris 5 - 10 cm de l'oesophage distal et 10 cm du duodénum proximal, a été retiré immédiatement après l'éviscération et a ouvert le long de la grande courbure. Ingérées ont été éliminés, et si nécessaire, la muqueuse a été doucement rincé avec un minimum d'eau du robinet avant l'inspection. Seuls les estomacs avec des lésions macroscopiques de la muqueuse glandulaire ont été inclus, ainsi que sept estomacs de contrôle sans aucune preuve brute des lésions gastriques.
Lésions glandulaires ont été définis comme la muqueuse ayant un aspect macroscopique anormal ie hyperhémiques, augmentation de l'épaisseur, des érosions ou des ulcères . Les positions anatomiques des lésions ont été notées comme: La région du cardia, corpus ou antrum (Fig. 6). Figure 6 régions anatomiques de l'estomac ont ouvert le long de la grande courbure. La région non glandulaire a un épithélium apparaissant blanc, tandis que la région glandulaire est des nuances de rouge. Elles sont séparées par le Margo plicatus
. Les trois régions échantillonnées comprennent: Cardia que la petite surface de la bande juste au-dessous et le long de la margo plicatus
, la région de corpus contenant de l'acide, pepsinogène et de mucus sécrétant glandes (rouge foncé) et la région de antrum contenant du mucus primarly et gastrine glandes sécrétant. procédure d'échantillonnage

a partir de chaque estomac avec des lésions glandulaires, trois échantillons de tissus obtenus lorsque de la plus grande lésion (a, b, C), ainsi que trois échantillons normaux appariés de tissu apparaissant (a, b, c) de la même région anatomique, mais au moins au moins 5 cm de distance. A /a: une petite taille de biopsie (0,5 × 0,5 cm) échantillon de la muqueuse a été obtenue pour le test uréase immédiat avec le Pyloritek test ® selon les instructions du fabricant. Des essais ont été lus après un temps standard de 60 minutes et les résultats notés comme positifs ou négatifs. Les échantillons B /b: un échantillon de tissu d'épaisseur totale de 3 × 3 cm, y compris la muqueuse et la sous-muqueuse ont été obtenus pour FISH et fixé dans 10% de formaline tamponnée. Les échantillons de 24 heures après la fixation des échantillons ont été transférés à 70% d'éthanol, paraffine, sectionnées à 3 pm et montés sur SuperFrost /plus diapositives (Menzel-Gläser, Braunschweig Allemagne) C /c:. une troisième paire de tissus échantillons pour le clonage et le séquençage ont été obtenus et congèle à l'aide de la glace sèche (Si la taille de la lésion lui a permis).
des sept estomacs de contrôle sans lésions gastriques macroscopiques, des échantillons a, b et c ont été prises à partir de la muqueuse apparaissant normale du antrum. Trois de ces chevaux ont été échantillonnés en outre dans le cardia, corpus et du duodénum ainsi.
Les procédures d'échantillonnage a eu lieu d'Août à Octobre 2007. Les données historiques relatives à la santé précédente des chevaux ne pouvaient pas être obtenus.
Fluorescent In Situ hybridation pour les bactéries
pour la détection microbienne, les coupes de tissu ont été hybridées simultanément avec deux ARNr 16S des sondes marquées avec des fluorophores différents. La sonde d'oligonucléotide S-D-BACT-0338-a-A-18 Les bactéries de ciblage (5'GCTGCCTCCCGTAGGAGT3 ') [34] est 5' marqué à la fluorescéine isothiocyanate, et avec un dérivé d'isothiocyanate Cy3. La HEL717 sonde d'oligonucléotides ciblant le genre Helicobacter (de 5'AGGTCGCCTTCGCAATGAGTA3 ') [35] était 5' marqué avec isothiocyanate dérivé Cy3. Pour vérifier les résultats de clonage d'un troisième et quatrième sonde, LC-gProt-1027-aA-17 (5'GCCTTCCCACATCGTTT3 ') ciblant ARNr 23S de Gammaproteobacteria était 5' marqué avec le isothiocyanate de fluorescéine et de la sonde SG-Enteroco-184 (5'CAAATCAAAACCATGCGG3 ') a été Cy3 marqué ciblage ARNr 16S de Enterococcus de spp [36]. Toutes les sondes ont été synthétisés au DNA Technology, Aarhus, Danemark. Les lames ont été déparaffinées dans du xylene et on les transfère à 100% d'alcool pendant 30 min avant l'hybridation. L'hybridation a été effectuée à 45 ° C avec 40 ml de tampon d'hybridation (100 mM de Tris [pH 7,2], 0,9 M de NaCl, 0,1% de dodécylsulfate de sodium) et 200 ng de chaque sonde pendant 16 heures dans une grille coulissante Sequenza (Thermo Shandon, Cheshire, Royaume-Uni). Les échantillons ont ensuite été lavées trois fois dans préchauffée (45 ° C) tampon d'hybridation pendant 15 minutes et par la suite trois fois dans une solution préchauffée (45 ° C), de lavage (Tris 100 mM [pH 7,2], 0,9 M de NaCl). Les échantillons ont été rincés dans de l'eau, séché à l'air et monté dans Vectashield (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) pour la microscopie à épifluorescence. Un microscope à épifluorescence Axioimager M1 équipé pour épifluorescence avec une lampe de 100 W HBO et d'un filtre fixe 43 et 38 ont été utilisés pour visualiser Cy3 et la fluorescéine, respectivement. Les images ont été obtenues à l'aide d'une version 3 caméra FireWiremonocrome AxioCam MRm et la version AxioVision du logiciel 4.5 (Carl Zeiss, Oberkochen, Allemagne). L'évaluation de la microscopie épifluorescence a été réalisée par la description de la quantité subjective, l'apparence morphologique et l'emplacement des cellules fluorescentes apparent dans chaque échantillon de tissu. En outre, toutes les coupes de tissu ont été colorées par H & E et évalués histopathologique ADNr 16S amplification et le clonage
Après la détection de bactéries à base de poisson, les sous échantillons de chevaux montrant des bactéries de différentes morphologies ont été choisies pour des ARNr 16S. clonage. L'ADN a été isolé à partir de 4 échantillons de tissus en utilisant le kit Easy-DNA (Invitrogen, Taastrup, Danemark) selon les instructions du fabricant. Le gène de l'ARNr 16S a été amplifié en utilisant des amorces SD-Bact-0008-AS-20 (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ') [37] et S - * - Univ-1492-AA-19 (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') [38]. cycle de PCR consistait en une dénaturation initiale à 94 ° C pendant 6 min; suivi de 30 cycles de dénaturation à 94 ° C pendant 30 s, annelage à 55 ° C pendant 45 s et extension à 72 ° C pendant 2 min; et une extension finale à 72 ° C pendant 3 min. L'ADN amplifié a été vérifiée par électrophorèse sur des gels d'agarose. Les produits de PCR ont été purifiés en utilisant le QIAquick PCR purification kit colonnes (Qiagen GmbH, Hilden, Allemagne). Pour créer des extrémités franches de l'ADN ce qui suit a été mélangé dans un tube de microcentrifugation de 0,5 ml, 4 pi de 5 tampon de polymerase × ADN T4, 14,7 pi de produit de PCR purifié 0,8 ul de dNTP (2,5 mmol l -1 chacun) et 0,5 pi (1,2 U) d'ADN polymerase T4 (Invitrogen) et on a incubé à 12 ° C pendant 15 min. L'ADN polymerase de T4 a été inactivé par la chaleur, et on a purifié l'ADN à extrémités franches en utilisant le QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN GmbH colonnes) et on l'élue dans un volume final de 10 ul d'eau bidistillée. Suite aux descriptions du fabricant du clonage a été réalisé en utilisant un kit de clonage TOPO émoussée Zéro (Invitrogen). Dix colonies de chaque clonage ont été prélevées et séquencées sur un analyseur de séquence automatique (ABI PRISM 373 DNA Sequencer; PE Biosystems, Foster City, CA, USA) en utilisant les deux amorces de vecteur standard (T3 et T7) inclus dans le kit. La séquence a été assemblé en version bionumérique 4.0 (mathématiques appliquées, Sint-Martens-Latem, Belgique) et vérifié pour les deux chimères par le dynamitage des séquences individuelles dans GenBank http:.... //Www NCBI nlm nih gov et par la version du logiciel Pintail 1.1 http:... //www cardiff ac uk /biosi /recherche /Biosoft /. L'analyse phylogénétique des clones appartenant au genre de l'Escherichia a été fait en téléchargeant 16S séquences de gènes ARNr plus de 1200 pb à partir de la base de données RDP v.9 du type de l'Escherichia souches http:. //Rdp cme . msu. edu. Les séquences ont été coupées à la même longueur de 1327 pb et alignées par paires (UPGMA) suivi d'un alignement global de séquence. Un arbre phylogénétique final a été construit en utilisant l'algorithme de WARD où Enterobacter sakazakii
(AB004746) a été utilisé comme exogroupe. Déclarations de
Remerciements
Les auteurs souhaitent remercier Hanne H. Møller, Katja Kristensen et Johanna Z Amenuvor pour l'assistance technique dans les laboratoires. Aussi grâce à Stina Vesterholm pour aider les tissus de collecte. Ce travail a été soutenu par Horseinsurance g /s de Kongeriget Danmark et Intervet Danemark. Sponsors avaient pas participé à la partie pratique ou les conclusions de cette étude.
Auteurs fichiers originaux soumis pour les images
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