El examen de lesiones en el estómago glandular equinos para las bacterias Helicobacter spp, incluyendo por fluorescencia de examen hybridisation

in situ de lesiones en el estómago glandular equinos para las bacterias Helicobacter spp, incluyendo fotos: por fluorescencia in situ hibridación

Resumen Antecedentes

El estómago glandular equina se ve afectada frecuentemente por la erosión y ulceración. El objetivo de este estudio fue evaluar si la bacteria Helicobacter, incluyendo, podrían estar implicados en la etiología de las lesiones glandulares gástricos visto en caballos.
Resultados
lesiones en el estómago, así como la mucosa de apariencia normal se obtuvieron de los caballos sacrificados para el consumo humano. Todas las muestras se ensayaron para determinar la actividad ureasa usando el PyloriTek ® ensayo, mientras que el contenido bacteriano de la mucosa se evaluó usando Fluorescente In Situ
hibridación. En las sub-muestras seleccionadas, caracterización bacterias se siguió profundizando mediante clonación y secuenciación. lesiones de la mucosa fueron encontrados en los estómagos y 36/63 incluidos rugosidades hiperplásico, estructuras polipoides y erosiones focales. Ninguna de las muestras se ensayaron para la actividad ureasa positiva o por FISH utilizando la sonda específica del género Helicobacter. En muestras de lesiones, así como las muestras normales, los clones con 99% similitudes con Lactobacillus salivarius
y Sarcina se encontraron ventriculi
. Escherichia
como clones y clones bacteria Enterococcus se demostró en una erosión focal. Sobre la base de un árbol filogenético estos clones tuvieron 100% de similitud con Escherichia fergusonii Enterococcus faecium y
. El Enterococcus se encontraron colonizar la superficie de la mucosa, mientras que E. fergusonii
organismos también se demostraron intraepitelial.
Conclusión
gástrica por Helicobacter spp. no pudo ser verificada como implicada en las lesiones del estómago glandular del caballo. Desde E. fergusonii
ha sido descrito como un patógeno emergente en humanos y animales, el hallazgo de esta bacteria en órdenes de erosión gástrica más aclaraciones sobre si la infección gástrica con esta bacteria tipo es importante para los caballos.
Antecedentes
en los caballos, las lesiones de la parte no glandular del estómago son muy frecuentes y parecen ser causados ​​por la exposición excesiva de ácido [1], pero poco se ha descrito en relación con las lesiones en la parte glandular. Las lesiones localizadas en la región glandular se demostraron en el 58% de 162 caballos hospitalizados [2] y en el 47% de 345 caballos de carreras, mientras que la causa de estos no han recibido mucha atención, la exposición al ácido no parece [3] y de ser el principal factor , ya que hay una correlación entre las lesiones de las dos regiones del estómago ha sido encontrado [3].
bacterias gástricas como la causa de lesiones en el estómago glandular han sido sugeridos para muchas especies de animales y en el ser humano éstas constituyen un importante factor de riesgo comprobado. De los organismos gástricos encontrados, Helicobacter pylori
se ha descrito más debido a su potencial patógeno de inducir gastritis crónica, úlceras, adenocarcinomas y linfoma (MALT) mucosa tejido linfoide asociado en los seres humanos [4-6]. Las bacterias de este género también se han encontrado en muestras de tejido gástrico de los animales, incluyendo perros, cerdos, ovejas y ganado [7-10]. Hoteles en el caballo, sale de pruebas contradictorias acerca de si se producen las bacterias que específicamente pueden causar lesiones gástricas. Algunos estudios han indicado que la Helicobacter spp gástrico
. están presentes en la mucosa de apariencia normal mediante el uso de PCR e inmunoquímica [11, 12], mientras que otros no han encontrado evidencia de una relación entre la presencia de lesiones y bacterias [13]. Como especie bacteriana gástrica han sido confirmados o sugerido como parte de la patogénesis de ciertos tipos de patología gástrica en humanos y otras especies animales, el objetivo de este estudio fue evaluar si las bacterias podrían estar involucrados en la patología observada en el estómago glandular equina. Un objetivo principal era proporcionar más pruebas sobre la presencia y localización de las bacterias, en general, a nivel de la mucosa del estómago glandular equina. Se hizo especial hincapié en la obtención de información sobre la presencia y participación de cualquier especie Helicobacter Hoteles en las lesiones de la mucosa. La fluorescencia en la técnica de hibridación (FISH) situ
se utilizó para este fin que permite el uso de sondas dirigidas-rRNA, tanto para la población bacteriana total y género /especie definidas. Este enfoque permite la determinación de la morfología bacteriana, abundancia, localización en los tejidos, e incluso indicaciones sobre las tasas de crecimiento y las actividades fisiológicas [14].
: Resultados de la lesiones glandulares bruto se observaron en 36 de los 63 estómagos examinados (57,1 %). La mayoría de las lesiones se observaron en la región antro (91,7%). En seis estómagos, las lesiones fueron adicionalmente o exclusivamente vistos en la región del cardias o corpus. No se encontraron lesiones en el duodeno
Las lesiones se clasificaron en tres grupos como:. Poliposa (2 estómagos con masas polipoides ubicadas tanto en el cardias y el antro con tamaños entre 1 y 5 centímetros de diámetro), ii: rugosidades Hiperplásico lesiones (13) o estómagos. III: lesiones hiperémica, erosivas o ulcerosas, que fueron vistos en 21 estómagos Francia el rugosidades hiperplásico eran vistos en el antro y variaron de tener una intensa hiperemia con el exudado de pliegues con apariencia normal superficie de la mucosa. engrosamiento bruto de las rugosidades antro fue causada principalmente por hiperplasia de la foveolas gástrica en comparación con las respectivas muestras normales. Las lesiones restantes fueron encontrados para ser lesiones solitarias pequeños de no más de aproximadamente 1 x 2 cm de tamaño. áreas focales de gastritis erosiva fueron los hallazgos más comunes de estas lesiones de tipo y se caracteriza como el desprendimiento de las células superficiales del epitelio luminal con un exudado fibrinopurulenta concurrente, restos celulares luminal y un infiltrado de células predominantemente mononucleares de la lámina propia. erosiones profundas que se encuentran en 9 estómagos erosionado tanto en la región de las fosas gástricas y partes de las glándulas, que se observó con la gastritis única de los tejidos inmediatos. Se encontró un cierto úlcera se extiende todo el espesor de la lámina propia, la exposición de la capa muscular de lámina al lumen. Un máximo de dos lesiones fueron encontrados en cada uno de estos estómagos.
Actividad ureasa de Helicobacter y la prueba
Uso de la sonda específica del género Helicobacter no hay señales positivas se encontraron en ninguna de las muestras de tejido 79 (36 pares de muestras y controles 7) . De acuerdo con estos resultados de los peces, ninguna de las muestras dio positivo para la actividad ureasa tampoco. Los controles internos de todas las pruebas de ureasa se encontraron positivos como indicación de un kit de prueba funcional.
las bacterias en general
En general, sólo se observaron pocas bacterias relacionada a la superficie mucosa en tanto los heridos, así como en el estómago sano muestras. En general, cuatro diferentes tipos morfológicos de las células bacterianas pueden ser visualizados con la sonda Eubacteria: 1) pequeños, cortos (desde 0,2 hasta 0,5 M) barras de cocoides, 2) barras de distintos (1 × 3 micras), 3) las barras de cadena larga (hasta 60 micras) o 4) grandes (2-3 micras de diámetro) bacterias cocoides que divide claramente en dos. Típicamente, cuando está presente, se observaron bacterias en grupos asociados con partículas de alimento o localizados cerca de la superficie de la mucosa
Evidencia de gastritis bacteriana fue encontrado en una lesión estómago groseramente caracterizado como una erosión solitario, 1 x 2 cm de tamaño, siendo el centro hiperémica y rodeado por un borde epitelial proliferativa (Fig. 1). Microscópicamente, la erosión focal de la mucosa con supuración de los eritrocitos y leucocitos, principalmente de origen neutrofílica, fue visto. Los exudados se observaron, además, en las fosas gástricas. Una reacción inflamatoria celular con células mononucleares se observó que se extiende tan profundo como en la capa muscular lámina. La superficie de la mucosa inflamada y los hoyos gástricos se encontraron fuertemente colonizada por cocoides a varillas cortas de aplicar la sonda para bacterias generales (Fig. 2). Las barras cortas se observaron especialmente la infiltración de la erosión. También se observaron intracelular en las células epiteliales, así como dentro de los granulocitos neutrófilos. La colonización bacteriana del estómago se restringió a la lesión como no se observaron bacterias en la correspondiente muestra de mucosa sana. Figura 1 lesión erosiva focal (flecha blanca) que demuestra la gastritis bacteriana en la evaluación histológica. La lesión fue de aproximadamente 2 x 2 cm y se encuentra en el antro cerca de la entrada del píloro.
Figura 2 mucosa gástrica con gastritis erosiva asociada con bacterias. La superficie de la mucosa y los desechos celulares adyacentes es gravemente colonizadas por bacterias (rojo). Unos bacteria intracelular se ven en el epitelio intacto (punta de flecha), así como dentro de las células epiteliales degeneradas y necróticas (flecha). Además, las bacterias se encuentran dentro de los granulocitos. La hibridación fluorescente in situ con la sonda de focalización bacterias, filtro ajustado 43, bar = 25 micras.
La clonación y secuenciación
Sobre la base de la morfología y la intensidad de las bacterias demostrado usando FISH, se seleccionaron submuestras de las muestras C /C para clonación y secuenciación de representar las muestras incluyendo el uno con gastritis bacteriana.
de las submuestras elegidas de estómagos que demuestran diversas morfologías bacterias, se encontraron dos tipos diferentes de clones en muestras de mucosa de apariencia normal (muestras c), un clon tenía 99% de similitud para Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AB370881) y el otro tipo de clones tenía 99% de similitud con Sarcina ventriculi
DSM 316 (X76650).
de las lesiones (muestras C), también se encontró que los clones con 99 % de similitud con Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AF182725). A partir de la mucosa con la gastritis bacteriana, cuatro de diez clones corresponden 100% Enterococcus faecium
, mientras que los restantes seis clones (secuencia obtenida depositada en GenBank con el nº de acceso. GQ423062) pertenecía a una Escherichia como
bacteria. Un árbol filogenético fue construido con los seis Escherichia
como clones de la lesión y todos tenían el 100% de similitud con las cepas tipo de ambos E. fergusonii
y Shigella flexneri gratis (figura 3). La aplicación de una sonda específica de gamma proteobacteria las cortas varillas que infiltran el epitelio, así como se encuentra intracelular dentro de los granulocitos neutrófilos, se verificaron como la Escherichia
como bacteria, mientras que se identificaron de Enterococcus faecium
organismos colonización de la superficie epitelial de la sonda específica Enterococcus (Fig 4 y 5). Figura 3 Un árbol filogenético de 16S rRNA secuencia del gen de similitud, que muestra la posición de los seis clones pertenecientes a Gammaproteobacteria encuentra en Horse 50L y las cepas de tipo más estrechamente relacionados que pertenecen al género Escherichia. Los seis clones (acc.no. GQ423062) tuvieron 100% de similitud con Shigella flexneri
y E. fergusonii
. Enterobacter sakazakii (AB004746) se utilizó como un grupo afuera. se presentan los números de secuencia de adhesión.
Figura 4 mucosa gástrica de caballo 50L con gastritis erosiva asociada con bacterias. La aplicación de una sonda marcada con fluoresceína para Gammaproteobacteria y una sonda marcada Cy3 para Enterococcus, E. coli un
como organismo (verde) (punta de flecha) se encontró intracelular dentro de las células epiteliales y en la superficie epitelial mientras que E. faecium (rojo) ( ' estrella blanca '(sólo colonizó la superficie epitelial. conjunto de filtros 43/38, bar = 10 micras.
la figura 5 de la mucosa gástrica 50L caballo con gastritis erosiva asociada con bacterias. Gran ampliación demostrando E. coli
como varas ( verde) dentro de las células epiteliales extruidos. fluorescente hibridación in situ con la sonda de orientación Gammaproteobacteria, conjunto de filtros 38, bar = 10 micras.
Discusión
anteriores estudios con el estómago equina han utilizado por ejemplo por PCR en el gen 16S rRNA de todo Helicobacter spp
. [12]. las desventajas son que la PCR utilizando la cantidad y la ubicación de las bacterias no se conoce y no se sabe si las bacterias están vivas o incluso si el ADN está desnudo. Por lo tanto, se decidió que el uso de la técnica de FISH proporcionaría mejor y más información de las bacterias que se encuentran en el estómago glandular del caballo, ya que estos problemas son superados con esta técnica. Esta técnica se ha utilizado anteriormente para describir la distribución espacial de Helicobacter
spp. en el tracto gastrointestinal de los perros y en el estómago de los caballos sanos para demostrar la microbiota de la mucosa escamosa y glandular de apariencia normal [15, 16]. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio mediante FISH para examinar lesiones del estómago glandular.
En el presente estudio un caso de gastritis asociada con la colonización bacteriana fue revelado. Especialmente la distribución de bacterias sugirió una conexión con la patología observada. La cantidad de bacterias se incrementó marcadamente alrededor de la lesión y se adhiere fuertemente a las células epiteliales, con las bacterias que se extienden en las criptas y intracelular situado. La clonación demostró que se trataba de una infección por Enterococcus faecium doble con
y un Escherichia
como bacteria, pero fue posteriormente verificado mediante el
in situ hibridación con una sonda gamma proteobacterias que era sólo la Escherichia
como bacteria que se infiltró en las ulceraciones superficiales y no se encontraron intracelular en las células epiteliales y dentro de los granulocitos neutrófilos. infección por enterobacterias en el intestino es un fenómeno común, pero es raro encontrar estas infecciones en el estómago y que nunca antes se había reportado en caballos adultos. Este resultado es muy interesante, pero necesitan más estudios para aclarar qué tan común es este fenómeno en los caballos. Además, si este tipo de infección es de origen primario o secundario necesitaría más aclaraciones. La Escherichia
como clones todos tenían el 100% 16S rRNA similitud genética para ambos E. fergusonii
y Shigella flexneri
. Por lo tanto, en este estudio, no se puede precisó experimentalmente cuál de estos dos organismos que estaban presentes en esta lesión glandular. Sin embargo, los seres humanos han informado de que el único huésped natural para Shigella
[17] mientras que E. fergusonii
se ha asociado con una amplia variedad de infecciones intestinales y extra-intestinales en los seres humanos y animales, incluyendo caballos [18 , 19]. Por lo tanto, es más probable que la Escherichia
como bacteria que se encuentra en este estudio pertenece a E. fergusonii
. Los estudios han reportado E. fergusonii
como un patógeno emergente y especialmente asociado con bacteriemia e infección de la herida, pero su papel exacto en las infecciones en los seres humanos y los animales todavía tiene que ser dilucidado [20].
Microbiología en las muestras
el medio ambiente en el estómago glandular en general es muy hostil hacia los microbios [21]. Está bien establecido que, a diferencia de los seres humanos y los perros que son alimentadores de comida, los caballos son productores de ácido continuas, probablemente debido a un patrón de alimentación continua [22, 23]. El pH en la parte ventral del estómago equino es estable a alrededor de pH 1-3 durante todo el período de 24 horas [24], en consecuencia, la baja diversidad relativa de bacterias observadas en las muestras de la mucosa en este estudio no fue inesperado.
La característica fenotipo morfológico de grandes cocos que crecen en tétradas regulares se estableció para ser un clon con un 99% de similitud con Sarcina ventriculi
. Este organismo es conocido por ser capaz de crecer en el contenido del estómago y tiene la estructura Tetrade característico cuando crecido de pH 1- pH 3 [25]. En el estudio actual, el hallazgo de estos organismos no se pudo establecer que ser parte de cualquier patología específica, ya que se encontraron en números bajos en las muestras pareadas (es decir, la lesión y normal), así como en las muestras de control. bacterias Sarcina-al igual que se han encontrado en una variedad de especies, donde se han supone que causa la hinchazón del cuajar, hemorragias y úlceras en corderos y cabras niños [26, 27] y una posible relación con la dilatación gástrica en perros y caballos tiene también ha sugerido [28]. No se observó ninguna evidencia de acumulaciones de gas macroscópicamente en cualquiera de estos caballos y por lo tanto, no parece que la presencia de Sarcina ventriculi
contribuyó a la patología observada en estos caballos.
No es de extrañar que el Lactobacillus (Lactobacillus salivarius
) se encontró en los tejidos estudiados y que ha sido previamente informado de que varios Lactobacillus
spp., incluyendo L. salivarius
, están presentes en caballos sanos [16, 29]. Las funciones proximales equino de estómago como el almacenamiento de piensos, así como un compartimento para la fermentación intragástrico. El ecosistema en esta región se compone tanto de bacterias anaerobias y lactato utilizando en gran número, que son responsables del aumento en los ácidos grasos volátiles en la fermentación de hidratos de carbono [30]. Especialmente lactobacilos se encontraron adherirse al epitelio en la parte proximal del estómago equina [31] y estas bacterias probablemente pasar al estómago glandular como parte del volumen de negocios normal. Sólo hemos examinado submuestras y taxones más bacterias se encuentran en la parte sana del estómago glandular si un estudio más exhaustivo de la comunidad microbiota estaba hecho.
validez de los resultados de Helicobacter
Ninguna de las muestras de tejido del antro región demostró señales positivas desde el Helicobacter spp
. sonda en este estudio y ninguna bacteria en forma de espiral se observaron utilizando la técnica FISH tampoco. En un estudio reciente de Venezuela, se informó de bacterias en forma de espiral en biopsias de la región cardiaca del estómago equino manchado con la tinción de Warthin-Starry [12]. Helicobacter spp
. conocidos por ser capaces de colonizar el estómago producen grandes cantidades de ureasa citoplasmática [32] La prueba rápida de ureasa utilizado en esta investigación, PyloriTek ®, detecta la actividad de la ureasa de la muestra de tejido por la producción de amoníaco cuando la urea está presente. Se utiliza ampliamente en la práctica humana para detectar la gastritis causada por Helicobacter spp
. Los valores predictivos positivos y negativos fueron de entre 98,1 a 100% y 95,8 a 100%, respectivamente, en un estudio de prueba de pacientes humanos antes y después de la erradicación de la bacteria [33]. En este estudio, no se encontraron pruebas positivas, lo que indica que las biopsias en el presente estudio no contenían bacterias con la capacidad de producir ureasa.
Conclusiones
gástrica por Helicobacter spp
. No se ha encontrado y no podría estar relacionado con las lesiones en el estómago de los 36 caballos analizados en este estudio. La patología encontrada en este estudio incluyó estructuras polipoides, rugosidades hiperplásico y pequeñas erosiones, pero la participación bacteriana se encontró sólo en un caso de una erosión. En esta lesión, un clon de Escherichia similar, lo más probable E. fergusonii
, se encontró intracelular. Si esto fue una infección primaria o secundaria no se pudo concluir. cantidades muy limitadas de bacterias, en general, se encuentran en la región glandular equina como se esperaba. Por lo tanto, la detección de un moderado a altas cantidades de las bacterias a nivel de la mucosa glandular, así como en las criptas debe ser motivo de preocupación ya que esto no parece ser un hallazgo normal en el estómago glandular equina. Otros estudios con bacterias y la relación con las lesiones gástricas de caballos con signos clínicos confirmados están garantizados, ya que estos caballos no se incluyeron en el estudio actual.
Métodos
Caballos y diseño del estudio comentario El estudio se realizó como una estudio transversal de los estómagos de una población de 63 caballos de matadero en Dinamarca. Los caballos fueron aprobados por el Servicio Veterinario lo más saludable para masacre. Los caballos fueron aturdidos con perno cautivo y se desangraron. El estómago, incluyendo 5 - 10 cm del esófago distal y 10 cm del duodeno proximal, se retiró inmediatamente después de la evisceración y abrió a lo largo de la curvatura mayor. Ingesta se retiraron y si es necesario, la mucosa se enjuagó suavemente con un mínimo de agua del grifo antes de la inspección. Sólo se incluyeron los estómagos con lesiones macroscópicas en la mucosa glandular, así como siete estómagos de control sin evidencia bruto de las lesiones gástricas.
lesiones glandulares se definieron como la mucosa que tiene un aspecto macroscópico anormal es decir hiperémicos, espesor aumentado, erosiones o úlceras . Las posiciones anatómicas de las lesiones se observaron como: La región del cardias, corpus o antro (Fig. 6). Figura 6 regiones anatómicas del estómago se abrieron a lo largo de la curvatura mayor. La región no glandular tiene un epitelio que aparece blanco, mientras que la región glandular es tonos de rojo. Están separados por el Margo plicatus
. Las tres regiones muestreadas incluyen: Cardia como la pequeña superficie de la banda justo por debajo ya lo largo del margo plicatus
, la región corpus que contiene ácido, pepsinógeno y glándulas secretoras de moco (rojo oscuro) y la región del antro que contiene moco primarly y las glándulas secretoras de gastrina. procedimiento de muestreo

de cada estómago con lesiones glandulares, tres muestras de tejido fueron obtenidas de los más grandes de la lesión (a, B, C), así como tres emparejado muestras de tejidos normales que aparecen (a, b, c) de la misma región anatómica, pero al menos al menos 5 cm de distancia. Un /a: una, tamaño pequeña biopsia se obtuvo (0,5 × 0,5 cm) de la muestra de la mucosa para la prueba de ureasa inmediata con el PyloriTek ® ensayo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las pruebas se leen después de un tiempo estándar de 60 minuto y resultados señalaron como positivo o negativo. Las muestras B /b: una muestra de tejido de espesor total de 3 x 3 cm incluyendo la mucosa y submucosa se obtuvieron para FISH y se fijaron en formalina al 10%. . Después de 24 horas de fijación las muestras se transfirieron a 70% de etanol, embebidos en parafina, se seccionaron a 3 micras y montados en SuperFrost /más
diapositivas (Menzel-Gläser, Braunschweig Alemania) Las muestras C /c: un tercer par de tejido muestras para la clonación y secuenciación se obtuvieron y se congelaron rápidamente utilizando hielo seco (Si tamaño de la lesión permitió).
de los siete estómagos de control sin lesiones gástricas macroscópicas, las muestras a, b y c se tomaron de la mucosa de apariencia normal de la cavidad. Tres de estos caballos fueron muestreados, además, en el cardias, corpus y el duodeno también. México La procedimientos de muestreo se llevó a cabo de agosto a octubre no pudieron obtenerse 2007. Los datos históricos relativos a la salud previo de los caballos.
In situ fluorescente la hibridación para las bacterias
para la detección microbiana, las secciones de tejido se hibridaron simultáneamente con dos 16S rRNA sondas marcadas con diferentes fluoróforos. La sonda de oligonucleótidos S-D-BACT-0338-a-A-18 Las bacterias de orientación (5'GCTGCCTCCCGTAGGAGT3 ') [34] era 5' marcado con isotiocianato de fluoresceína y con isotiocianato de Cy3 derivado. El HEL717 sonda de oligonucleótidos dirigida al género Helicobacter (5'AGGTCGCCTTCGCAATGAGTA3 ') [35] fue de 5' marcado con Cy3 derivado de isotiocianato. Para verificar los resultados de clonación una tercera y cuarta sonda, LC-gProt-1027-AA-17 (5'GCCTTCCCACATCGTTT3 ') de orientación 23S ARNr de Gammaproteobacteria fue 5' marcado con isotiocianato de fluoresceína y una sonda SG-Enteroco-184 (5'CAAATCAAAACCATGCGG3 ') era Cy3 marcado de orientación de 16S rRNA de Enterococcus spp
[36]. Todas las sondas se sintetizaron en DNA Technology, Aarhus, Dinamarca. Los portaobjetos se desparafinaron en xileno y se transfieren a alcohol 100% durante 30 min antes de la hibridación. La hibridación se realizó a 45 ° C con 40 ml de tampón de hibridación (Tris 100 mM [pH 7,2], 0,9 M NaCl, 0,1% de dodecil sulfato de sodio) y 200 ng de cada sonda durante 16 horas en un bastidor Slide Sequenza (Thermo Shandon, Cheshire, Reino Unido). A continuación, las muestras se lavaron tres veces en precalentada (45 ° C) tampón de hibridación durante 15 minutos y posteriormente tres veces en solución precalentada (45 ° C) de lavado (Tris 100 mM [pH 7,2], 0,9 M NaCl). Las muestras fueron lavadas en agua, se seca al aire y montado en Vectashield (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, EE.UU.) para microscopia de epifluorescencia. Un microscopio de epifluorescencia Axioimager M1 equipado para epifluorescencia con una lámpara de 100-W HBO y el filtro fija 43 y 38 se utiliza para visualizar Cy3 y fluoresceína, respectivamente. Las imágenes se obtuvieron usando una versión 3 de la cámara FireWiremonocrome AxioCam MRm y la versión de software AxioVision 4,5 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania).
Evaluación de la microscopía de epifluorescencia se realizó mediante la descripción de la cantidad subjetiva, el aspecto morfológico y la ubicación de las células fluorescentes evidente en cada muestra de tejido. Además, todas las secciones de tejido se tiñeron por H & E y se evaluaron histopatológicamente
amplificación de 16S rDNA y
clonación Después de la detección de bacterias mediante FISH, se eligieron las muestras de sub de caballos que demuestran bacterias de diversas morfologías para el gen 16S rRNA. clonación. El ADN se aisló a partir de 4 muestras de tejido utilizando el kit Easy-DNA (Invitrogen, Tåstrup, Dinamarca) según las instrucciones del fabricante. El gen 16S rRNA se amplificó utilizando cebadores SD-Bact-0008-AS-20 (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ') [37] y S - * - Univ-1492-AA-19 (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') [38]. PCR de ciclo consistió en una desnaturalización inicial a 94 ° C durante 6 min; seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 30 s, hibridación a 55 ° C durante 45 s y extensión a 72 ° C durante 2 min; y una extensión final a 72 ° C durante 3 min. El ADN amplificado se verificó mediante electroforesis en geles de agarosa. Los productos de PCR fueron purificados utilizando el QIAquick PCR columnas del kit de purificación (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). Para crear la siguiente ADN se mezcló en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml, 4 l de tampón 5 de la polimerasa de ADN de T4 ×, de extremos romos 14,7 l de producto de PCR purificado de 0,8 l de dNTP (2,5 mmol l -1 cada uno) y 0,5 l (1,2 U) de ADN polimerasa T4 (Invitrogen) y se incubaron a 12 ° C durante 15 min. La polimerasa de ADN T4 fue inactivado por calor, y el ADN de composición romo se purificó utilizando las columnas del kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen GmbH) y se eluyó en un volumen final de 10 l de agua bidestilada. Siguiendo las descripciones del fabricante de la clonación se llevó a cabo mediante el uso de un kit de clonación TOPO Zero romo (Invitrogen). Diez colonias de cada clonación se seleccionaron y se secuenciaron en un analizador de secuencia automática (ABI PRISM 373 secuenciador de ADN; PE Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) utilizando los dos cebadores de vectores estándar (T3 y T7) incluidos en el kit. La secuencia fue montado en la versión 4.0 Bionumerics (Matemáticas Aplicadas, Sint-Martens-Latem, Bélgica) y se analiza en quimeras tanto por la voladura de las secuencias individuales en GenBank http:.... //Www NCBI NLM NIH gov y por la versión de software 1.1 del pato rojizo http:... //www Cardiff ac uk /biosi /investigación /Biosoft /. El análisis filogenético de los clones pertenecientes al género Escherichia
se llevó a cabo mediante la descarga de 16S rRNA secuencias de genes de más de 1.200 pares de bases de la base de datos RDP v.9 de la Escherichia
cepas de tipo http:. //RDP CME . MSU. edu. Las secuencias fueron recortados a la misma longitud de 1327 pares de bases y pares alineados (UPGMA) seguido de una alineación de secuencias global. Un árbol filogenético final fue construido utilizando el algoritmo WARD, donde se usó Enterobacter sakazakii gratis (AB004746) como grupo externo.
Declaraciones
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Hanne H. Møller, Katja Kristensen y Johanna Z Amenuvor para la asistencia técnica en los laboratorios. También gracias a Stina Vesterholm para ayudar a los tejidos de recogida. Este trabajo fue apoyado por Kongeriget de Danmark Horseinsurance g /s e Intervet Dinamarca. Productos no tuvieron participación en la parte práctica o las conclusiones de este estudio.
Los autores originales presentados archivos de imágenes
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