Undersøgelse af heste kirtel mave læsioner for bakterier, herunder Helicobacter spp ved fluorescens in situ hybridisation

Undersøgelse af heste kirtel mave læsioner for bakterier, herunder Helicobacter spp
ved fluorescens in situ
hybridisering
Abstract
Baggrund
Den heste kirtelmave er almindeligt påvirket af erosion og ulceration. Formålet med denne undersøgelse var at vurdere, om bakterier, herunder Helicobacter, kunne være involveret i ætiologien af ​​gastriske kirtel læsioner set i heste.
Resultater
mave læsioner, samt normalt udseende slimhinde blev opnået fra heste slagtes til konsum. Alle prøver blev testet for urease-aktivitet ved hjælp af Pyloritek ® assay mens mucosal bakterieindhold blev vurderet ved anvendelse fluorescens in situ
Hybridisering. I udvalgte sub prøver blev bakterierne karakterisering forfølges yderligere ved kloning og sekventering. Slimhindelæsioner blev fundet i 36/63 maver og omfattede hyperplastiske rugae, polypagtige strukturer og fokale erosioner. Ingen af ​​prøverne blev testet positive for urease-aktivitet eller til FISH under anvendelse af Helicobacter slægten specifikke probe. I prøver af læsioner, samt normale prøver, kloner med 99% ligheder med Lactobacillus salivarius
og Sarcina blev fundet ventriculi
. Escherichia
ligesom bakterien kloner og Enterococcus kloner blev påvist i et kontaktpunkt erosion. Baseret på en fylogenetisk træ disse kloner havde 100% lighed med Escherichia fergusonii og Enterococcus faecium
. Den Enterococcus blev fundet koloniserer slimhindeoverfladen, mens E. fergusonii Salg organismer også blev påvist intraepithelial.
Konklusion
Gastrisk Helicobacter spp. kunne ikke bekræftes som indblandet i læsioner af kirtelmaven af ​​hesten. Da E. fergusonii
er blevet beskrevet som en spirende patogen i både mennesker og dyr, konstateringen af ​​denne bakterie i gastrisk erosion berettiger yderligere afklaring om gastrisk infektion med denne type bakterie er vigtigt for heste.
Baggrund
Hos heste læsioner af ikke-glandulære del af maven er meget udbredt og synes at være forårsaget af overdreven syre eksponering [1], men lidt er blevet beskrevet vedrørende læsioner i glandulære del. Læsioner beliggende i glandulær region blev påvist i 58% af 162 indlagte heste [2], 47% af 345 væddeløbsheste mens årsagen til disse ikke har fået megen opmærksomhed, er syre eksponering ikke synes at være den primære faktor [3] og som ingen korrelation mellem læsioner i de to regioner i maven er fundet [3].
gastriske bakterier som årsag til kirtelmaven læsioner er blevet foreslået til mange dyrearter og hos mennesker dette udgør en væsentlig verificeret risikofaktor. I mavens organismer fundet, har Helicobacter pylori
blevet beskrevet den mest grundet dens patogene potentiale til at inducere kronisk gastritis, mavesår, adenocarcinomer og mucosa associerede lymfoide væv (MALT) lymfom hos mennesker [4-6]. Bakterier af denne slægt er også fundet i gastriske vævsprøver fra dyr, herunder hunde, svin, får og kvæg [7-10]. Salg In hesten, modstridende beviser udgange, om bakterier, der specifikt kan forårsage gastriske læsioner forekomme. Enkelte studier har indikeret, at gastrisk Helicobacter spp
. er til stede i normalt udseende slimhinde ved anvendelse af PCR og immunkemi [11, 12], mens andre har fundet noget bevis for en sammenhæng mellem tilstedeværelsen af ​​læsioner og bakterier [13]. Som gastrisk bakteriearter er blevet bekræftet eller foreslået som en del af patogenesen af ​​visse typer gastrisk patologi hos mennesker og andre dyrearter, er formålet med denne undersøgelse var at vurdere, om bakterier kunne være involveret i patologi observeret i heste kirtelmave. En primære fokus var at give mere dokumentation for tilstedeværelsen og lokalisering af bakterier i almindelighed på slimhinden niveau heste kirtelmave. Særlig vægt blev lagt på at få oplysninger om tilstedeværelse og inddragelse af enhver Helicobacter arter
i slimhindelæsioner. Den fluorescens in situ
hybridisering (FISH) teknik blev anvendt til dette formål, som muliggør anvendelse af rRNA-målrettede prober for både den samlede bakteriepopulation og definerede slægt /arter. Denne tilgang muliggør bestemmelse af bakteriel morfologi, overflod, placering i vævet, og endda indikationer på vækstrater og fysiologiske aktiviteter [14].
Resultater
Gross glandulær læsioner blev set i 36 af de 63 maver undersøgte (57,1 %). Størstedelen af ​​læsioner blev set i antrum-regionen (91,7%). I seks maver blev læsioner derudover eller udelukkende ses i Cardia eller corpus region. Ingen læsioner blev fundet i tolvfingertarmen
Læsionerne blev klassificeret i tre grupper som:. Polypous (2 maver med polypagtige masser placeret i både Cardia og antrum med størrelser mellem 1 og 5 cm i diameter), ii: hyperplastisk rugae læsioner (13 maver) eller iii:. hyperæmisk, eroderende eller ulcerøs læsioner, som blev set i 21 maver
hyperplastiske rugae blev alle set i antrum og varierede fra at have intens hyperæmi med ekssudat at rugae med normalt optræder slimhinden. Gross fortykkelse af antrum rugae skyldtes primært hyperplasi af mavens foveolae forhold til de respektive normale prøver. De resterende læsioner blev alle fundet at være små solitære læsioner af ikke mere end ca. 1 × 2 cm i størrelse. Fokale områder af erosiv gastritis var de mest almindelige resultater af disse type læsioner og karakteriseret som afstødning af de overfladiske celler i luminale epitel med en samtidig fibrinopurulent ekssudat, luminal cellerester og en overvejende mononukleær celleinfiltration af lamina propria. Dybere erosioner fundet i 9 maver eroderet både regionen mavens gruber og dele af kirtler, der blev observeret med gastritis kun af de umiddelbare væv. En sand ulcus blev fundet strækker sig over hele tykkelsen af ​​lamina propria, udsætter hinden muscularis til hulrummet. Højst to læsioner blev fundet i hver af disse maver.
Helicobacter og Ureaseaktivitet test
Brug af slægten Helicobacter specifikke probe ingen positive signaler blev fundet i nogen af ​​de 79 vævsprøver (36 parrede prøver og 7 kontroller) . Efter aftale med disse resultater af fisken, ingen af ​​prøverne blev testet positive for urease-aktivitet enten. Interne kontroller alle urease tests blev fundet positive som indikation af en funktionel test kit. Salg Bakterier i almindelighed
Generelt er det kun få bakterier blev observeret i forbindelse med slimhindeoverfladen i både skadet og i den sunde mave prøver. Samlet set kunne fire morfologiske forskellige typer af bakterielle celler visualiseres med Eubacteria sonde: 1) små, korte (0,2-0,5 um) coccoid stænger, 2) forskellige stænger (1 × 3 um), 3) langkædede stænger (op til 60 um) eller 4) store (2-3 um diameter) coccoid bakterier klart dividere parvis. Typisk når til stede, blev bakterier observeret i klynger forbundet med foderpartikler eller ligger tæt på slimhindeoverfladen
Bevis for bakteriel gastritis blev fundet i en mave læsion groft karakteriseret som et ensomt erosion, 1 × 2 cm i størrelse, centrum er hyperæmisk og omgivet af en proliferativ epitelial rand (fig. 1). Mikroskopisk fokal erosion af slimhinden med sivning af erythrocytter og leukocytter, hovedsageligt af neutrofile oprindelse, blev set. Ekssudaterne blev yderligere set i mavens miner. En cellulær inflammatorisk reaktion med mononukleære celler blev set strækker så dybt som i lamina muscularis. Overfladen af ​​den betændte slimhinde og mavens gruber blev fundet stærkt koloniseret af coccoid til korte stave anvende probe til generelle bakterier (fig. 2). De korte stave blev især observeret infiltrerer erosion. De blev også observeret intracellulær i epitelceller, samt inden for neutrofile granulocytter. Den bakterielle kolonisering af maven var begrænset til læsionen som ingen bakterier blev set i den tilsvarende sund slimhinde prøve. Figur 1 Focal erosive læsion (hvid pil) demonstrerer bakteriel gastritis ved histologisk evaluering. Læsion var cirka 2 × 2 cm og placeret i antrum nær pyloric indgangen.
Figur 2 maveslimhinden med erosiv gastritis forbundet med bakterier. Slimhindeoverfladen og tilstødende cellerester er alvorligt koloniseret af bakterier (rød). Nogle få bakterier ses intracellulært i det intakte epitel (pilespids) samt inden degenererede og nekrotiske epitelceller (pil). Desuden er bakterier inden granulocytter. Fluorescerende in situ-hybridisering med proben målretning Bakterier, filtersæt 43, bar = 25 um.
Kloning og sekventering
Baseret på morfologien og intensiteten af ​​bakterier påvist under anvendelse FISH, delprøver af C /c prøver blev udvalgt til kloning og sekventering af repræsenterer prøver, herunder en med bakteriel gastritis.
af de valgte delprøver af maver demonstrerer forskellige bakterier morfologier blev to forskellige typer af kloner fundet i normalt udseende slimhinde prøver (c prøver), en klon havde 99% lighed Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AB370881) og den anden type af kloner havde 99% lighed med Sarcina ventriculi
DSM 316 (X76650).
fra læsionerne (C prøver) blev kloner også fundet med 99 % lighed med Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AF182725). Fra slimhinden med bakteriel gastritis, fire af ti kloner matchede 100% Enterococcus faecium
, mens de resterende seks kloner (opnået sekvens deponeret hos GenBank med deponeringsnummer. GQ423062) tilhørte en Escherichia ligesom
bakterie. En fylogenetisk træ blev bygget med seks Escherichia
ligesom kloner fra læsionen og alle havde 100% lighed med den type stammer af både E. fergusonii
og Shigella flexneri
(fig 3). Påføring af en gamma Proteobacteria specifik probe de korte stave infiltrerer epitelet samt fundet intracellulært inden neutrofile granulocytter, blev godkendt som Escherichia
ligesom bakterie mens Enterococcus faecium Salg organismer blev identificeret koloniserer epiteloverfladen af ​​Enterococcus specifikke probe (figur 4 og 5). Figur 3 En fylogenetisk træ af 16S rRNA-genet sekvenslighed med angivelse af placeringen af ​​de seks kloner, der tilhører Gammaproteobacteria fundet i Horse 50L og de nærmest beslægtede typen stammer tilhørende Escherichia-slægten. De seks kloner (acc.no. GQ423062) havde 100% lighed med Shigella flexneri
og E. fergusonii
. Enterobacter sakazakii (AB004746) blev anvendt som en udgruppe. numre Sekvens tiltrædelse præsenteres.
figur 4 maveslimhinden hest 50L med erosiv gastritis forbundet med bakterier. Påføring af en fluoresceinmærket probe til Gammaproteobacteria og et Cy3 mærket probe for Enterococcus, en E. coli
ligesom organisme (grøn) (pilespids) blev fundet intracellulært inden epitelceller og på epiteloverfladen hvorimod E. faecium (rød) ( ' hvid stjerne '(kun koloniseret epitel. Filter sæt 43/38, bar = 10 um.
figur 5 maveslimhinden hest 50L med erosiv gastritis forbundet med bakterier. Stor forstørrelse viser E. coli
ligesom stænger ( grøn) inden ekstruderede epitelceller. Fluorescerende in situ hybridisering med sonden rettet mod Gammaproteobacteria, filter sæt 38, bar = 10 um.
diskussion
Tidligere undersøgelser involverer heste mave har eg brugt PCR rettet mod 16S rRNA-genet for især Helicobacter
spp. [12]. ulemperne ved hjælp af PCR er, at mængden og placeringen af ​​de bakterier, der ikke kendes, og det er usikkert, om bakterierne er i live, eller selv hvis DNA er nøgen. Derfor blev det besluttet, at anvendelse af FISH teknik ville give bedre og mere information af de bakterier, der findes i kirtelmaven af ​​hesten, som disse spørgsmål er overvundet med denne teknik. Denne teknik har tidligere været anvendt til at beskrive den rumlige fordeling af Helicobacter
spp. i mavetarmkanalen hos hunde og i maven på raske heste at demonstrere mikrobiota af normalt udseende skællede og glandular mucosa [15, 16]. Så vidt vi ved er dette den første undersøgelse under anvendelse FISH at undersøge læsioner i glandulære mave.
I den foreliggende undersøgelse ét tilfælde af gastritis er forbundet med bakteriel kolonisering blev afsløret. Især fordelingen af ​​bakterier foreslog en forbindelse med patologi observeres. Mængden af ​​bakterier blev markant forøget omkring læsionen og blev stramt klæbet til epitelceller, med bakterierne strækker sig ind krypterne og placeret intracellulært. Kloning viste, at det var en dobbelt infektion med Enterococcus faecium
en Escherichia
ligesom bakterien, men det blev senere bekræftet ved hjælp af in situ
hybridisering med en gamma Proteobacteria sonde, at det kun var Escherichia
lignende bakterie, som infiltreret de overfladiske sårdannelser og blev fundet intracellulært i epitelceller og inden neutrofile granulocytter. Enterobakterielt infektion i tarmen er et almindeligt fænomen, men det er sjældent at finde disse infektioner i maven og det har aldrig før været rapporteret hos voksne heste. Dette resultat er meget spændende, men yderligere undersøgelser er nødt til at afklare, hvordan almindeligt fænomenet er i heste. Også, om denne type infektion er af primær eller sekundær oprindelse skulle yderligere afklaring. Den Escherichia
ligesom kloner alle havde 100% 16S rRNA-genet lighed med både E. fergusonii
og Shigella flexneri
. Således i denne undersøgelse, kan det ikke precised eksperimentelt hvilken af ​​disse to organismer, der var til stede i denne glandulær læsion. Imidlertid har mennesker blevet rapporteret at være den eneste naturlige vært for Shigella
[17], mens E. fergusonii
er blevet forbundet med en lang række intestinale og ekstra-intestinale infektioner hos både mennesker og dyr, herunder heste [18 , 19]. Det er derfor mest sandsynligt, at Escherichia
ligesom bakterie fundet i denne undersøgelse tilhører E. fergusonii
. Undersøgelser har rapporteret E. fergusonii
som en ny patogen og er forbundet med især bakteriæmi og sårinfektioner, men der skal belyses dets præcise rolle i infektioner hos både mennesker og dyr stadig [20].
Mikrobiologi i prøverne
miljøet i kirtelmaven er generelt meget fjendtlig over for mikrober [21]. Det er velkendt, at i modsætning mennesker og hunde, der er meal fødere, heste er kontinuerlige syre producenter, sandsynligvis på grund af en kontinuerlig fodring mønster [22, 23]. PH i den ventrale del af equin mave ligger stabilt på omkring pH 1-3 hele 24 timers perioden [24], således den relative lave mangfoldighed af bakterier observeret i mucosale prøver i denne undersøgelse var ikke uventet.
Karakteristiske morfologiske fænotype af store kokker vokser i regelmæssige tetrader blev etableret for at være en klon med en 99% lighed med Sarcina ventriculi
. Denne organisme er kendt for at være i stand til at vokse i maveindholdet og har den karakteristiske tetrade struktur, når vokset fra pH 1- pH 3 [25]. I den aktuelle undersøgelse, kunne konstateringen af ​​disse organismer ikke etableret for at være en del af en specifik patologi, da de blev fundet i lavt antal i de parrede prøver (dvs. læsion og normal), samt i kontrolprøverne. Sarcina-lignende bakterier er fundet i en række forskellige arter, hvor de er blevet formodes at forårsage abomasal bloat, blødning og mavesår i lam og gedekid [26, 27], og en mulig forbindelse til gastrisk dilatation i både hunde og heste har også blevet foreslået [28]. Der blev ikke observeret tegn på gas ophobninger makroskopisk i nogen af ​​disse heste, og dermed ser det ikke ud, at tilstedeværelsen af ​​Sarcina ventriculi
bidrog til patologi observeret i disse heste.
Det var ikke overraskende, at Lactobacillus (Lactobacillus salivarius
) er fundet i de undersøgte væv, og det er tidligere blevet rapporteret, at adskillige Lactobacillus
spp., herunder L. salivarius
, er til stede i raske heste [16, 29]. De proximale heste mave fungerer som lager for foder, samt et rum til intragastrisk fermentering. Økosystemet i denne region består af både anaerobe og laktat-udnytte bakterier i stort tal, som er ansvarlige for stigningen i flygtige fedtsyrer ved gæring af kulhydrater [30]. Især Lactobacilli blev fundet klæber til epitelet i den proksimale del af heste mave [31], og disse bakterier vil sandsynligvis overgå til kirtelmaven som en del af den normale turn-over. Vi har kun undersøgt delprøver og mere bakterielle taxa vil blive fundet i den sunde del af kirtelmaven hvis en mere omfattende mikrobiota samfund undersøgelse blev udført.
Gyldighed af resultaterne af Helicobacter
Ingen af ​​vævsprøver fra antrum region viste positive signaler fra Helicobacter spp
. probe i denne undersøgelse, og ingen spiral formede bakterier blev noteret under anvendelse FISH teknikken enten. I en nylig undersøgelse fra Venezuela, blev der rapporteret spiral formede bakterier i biopsier fra hjertets område af heste mave farves med Warthin-Starry plet [12]. Helicobacter spp
. kendt for at være i stand til at kolonisere maven producere store mængder af cytoplasmatisk urease [32] Den hurtige ureasetest anvendt i denne undersøgelse, Pyloritek ®, detekterer urease aktivitet af vævsprøven ved fremstilling af ammoniak, når urea er til stede. Det benyttes flittigt i human praksis at opdage gastritis forårsaget af Helicobacter spp
. De positive og negative prædiktive værdier var mellem 98,1 til 100% og 95,8 til 100%, henholdsvis i en undersøgelse teste humane patienter før og efter udryddelsen af ​​bakterien [33]. I denne undersøgelse blev der ikke fundet positive test, hvilket viser, at biopsier i den foreliggende undersøgelse ikke indeholdt bakterier med evnen til at producere urease.
Konklusioner
Gastric Helicobacter
spp. blev ikke fundet og kunne ikke være knyttet til maven læsioner af de 36 heste analyseret i denne undersøgelse. Den patologi fundet i denne undersøgelse omfattede polypagtige strukturer, hyperplastiske rugae og små erosioner, men bakteriel involvering blev fundet i kun ét tilfælde af erosion. I denne læsion, en Escherichia-lignende klon, sandsynligvis E. fergusonii
blev fundet intracellulært. Om dette var ikke kunne indgås en primær eller sekundær infektion. Meget begrænsede mængder af bakterier generelt blev fundet i heste glandulær region som forventet. Derfor bør påvisning af en moderat til høje mængder af eventuelle bakterier på kirtel mucosa niveau, såvel som i de krypter være grund til bekymring, da det ikke synes at være en normal fund i heste kirtelmave. Yderligere undersøgelser med bakterier og forholdet til gastriske læsioner af heste med bekræftede kliniske tegn er berettiget, da disse heste ikke indgik i den aktuelle undersøgelse.
Metoder
Heste og studiedesign
Undersøgelsen blev udført som en tværsnitsundersøgelse af maver fra en population af 63 slagteriarbejdere heste i Danmark. Heste blev godkendt af Veterinary Officer så sundt til slagtning. Heste blev bedøvet med en boltpistol og tømt for blod. Maven, herunder 5 - 10 cm af den distale spiserør og 10 cm af den proximale duodenum, blev fjernet umiddelbart efter udtagning af indvolde og åbnet langs den store krumning. Ingesta blev fjernet og om nødvendigt blev slimhinden skylles forsigtigt med et minimum af vandværksvand før inspektionen. Kun maver med læsioner i glandular mucosa blev inkluderet, samt syv kontrol maver uden brutto tegn på gastriske læsioner.
Glandulær læsioner blev defineret som slimhinden har en unormal makroskopisk udseende dvs hyperæmisk, øget tykkelse, erosioner eller sår . De anatomiske positioner af læsioner blev noteret som: Cardia, corpus eller antrum region (. Figur 6). Figur 6 anatomiske områder i maven åbnet langs den største krumning. Den ikke-glandulære region har en hvid optræder epitel, mens glandulær region er nuancer af rød. De er adskilt af Margo plicatus
. De tre regioner stikprøven omfatter: Cardia som lille strimmel området lige under og langs margo plicatus
, corpus region indeholder syre, pepsinogen og slim udskiller kirtler (mørk rød) og antrum region, der indeholder primarly slim og gastrin hemmelig kirtler.
Sampling procedure
fra hver maven med glandulær læsioner, tre vævsprøver, hvor opnået den største læsion (a, b, C) samt tre parrede normale optræder vævsprøver (a, b, c) fra den samme anatomisk område, men i det mindste mindst 5 cm væk. A /a: en lille, biopsi størrelse (0,5 × 0,5 cm) mucosa prøve blev opnået til umiddelbar urease test med Pyloritek ® assay ifølge producentens instruktioner. Tests blev aflæst efter en 60 minutters standard tid og resultaterne noteret som positive eller negative. Prøver B /b: a 3 × 3 cm vævsprøve fuld tykkelse herunder mucosa og submucosa blev opnået for FISH og fikseret i 10% pufret formalin. . Efter 24 timers fiksering blev prøverne overført til 70% ethanol, paraffin-indstøbt, snittet på 3 um og monteret på SuperFrost /plus dias (Menzel-Glaser, Braunschweig Tyskland)
Prøver C /c: et tredje par af væv prøver til kloning og sekventering blev opnået og hurtigt nedfrosset anvendes tøris (Hvis læsion størrelse tilladt det).
fra de syv kontrol maver uden makroskopiske gastriske læsioner, prøver a, b og c blev taget fra normalt udseende slimhinde antrum. Tre af disse heste blev desuden udtaget i Cardia, korpus og duodenum samt.
Procedurerne prøveudtagning fandt sted august-oktober kunne ikke opnås 2007. Historiske data om tidligere sundhed af hestene.
Fluorescent In Situ hybridisering for bakterier
for mikrobiel afsløring blev vævssnit hybridiseret samtidigt med to 16S rRNA prober mærket med forskellige fluoroforer. Oligonukleotidproben S-D-BACT-0338-a-A-18 målretning Bakterier (5'GCTGCCTCCCGTAGGAGT3 ") [34] var 5 'mærket med fluoresceinisothiocyanat og med isothiocyanat derivat Cy3. Oligonukleotidproben HEL717 rettet mod Helicobacter slægten (5'AGGTCGCCTTCGCAATGAGTA3 ") [35] var 5'-mærket med isothiocyanat derivat Cy3. For at kontrollere kloning resultater en tredje og fjerde probe, LC-gProt-1027-AA-17 (5'GCCTTCCCACATCGTTT3 «) rettet mod 23S rRNA af Gammaproteobacteria var 5 'mærket med fluoresceinisothiocyanat og sonde SG-Enteroco-184 (5'CAAATCAAAACCATGCGG3 ') var Cy3 mærket rettet mod 16S rRNA af Enterococcus
spp [36]. Alle prober blev syntetiseret ved DNA Technology, Århus, Danmark. Objektglassene blev afparaffiniseret i xylen og overført til 100% alkohol i 30 min før hybridisering. Hybridiseringen blev udført ved 45 ° C med 40 ml hybridiseringsbuffer (100 mM Tris [pH 7,2], 0,9 M NaCl, 0,1% natriumdodecylsulfat) og 200 ng af hver probe i 16 timer i en Sequenza Slide Rack (Thermo Shandon, Cheshire, UK). Prøverne blev derefter vasket tre gange i forvarmet (45 ° C) hybridiseringsbuffer i 15 minutter og efterfølgende tre gange i forvarmet (45 ° C) vaskeopløsning (100 mM Tris [pH 7,2], 0,9 M NaCl). Prøverne blev skyllet i vand, lufttørret og monteret i Vectashield (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) i epifluorescensmikroskopi. En Axioimager M1 epifluorescensmikroskop udstyret til epifluorescens med en 100-W HBO lampe og filter sætter 43 og 38 blev anvendt til at visualisere Cy3 og fluorescein, hhv. Billeder blev opnået ved anvendelse af en AxioCam MRM version 3 FireWiremonocrome kamera og softwaren AxioVision version 4.5 (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland).
Evaluering af epifluorescens mikroskopi blev udført ved beskrivelse af den subjektive beløb, morfologisk udseende og placering af fluorescerende celler tydeligt i hver vævsprøve. Desuden blev alle vævssnit farvet med H &E og evalueret histopatologisk
16S rDNA amplifikation og kloning
Efter påvisning af bakterier under anvendelse FISH blev sub prøver fra heste demonstrerer bakterier af forskellige morfologier valgt til 16S rRNA-genet. kloning. DNA'et blev isoleret fra 4 vævsprøver ved hjælp af Easy-DNA kit (Invitrogen, Tåstrup, Danmark) ifølge producentens instruktioner. 16S rRNA-genet blev amplificeret under anvendelse af primere SD-Bact-0008-AS-20 (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ') [37] og S - * - Univ-1492-aA-19 (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') [38]. PCR cycling bestod af en initial denaturering ved 94 ° C i 6 minutter; efterfulgt af 30 cykler af denaturering ved 94 ° C i 30 s, annealing ved 55 ° C i 45 s og ekstension ved 72 ° C i 2 min; og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 3 minutter. Amplificeret DNA blev verificeret ved elektroforese på agarosegeler. PCR-produkterne blev oprenset ved anvendelse af QIAquick PCR Purification Kit søjler (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). At skabe stumpendede DNA følgende blev blandet i en 0,5-ml mikrocentrifugerør, 4 pi 5 x T4 DNA-polymerase-buffer, 14,7 pi oprensede PCR-produkt 0,8 pi dNTP (2,5 mmol l -1 hver) og 0,5 pi (1,2 U) T4-DNA-polymerase (Invitrogen) og inkuberet ved 12 ° C i 15 min. T4-DNA-polymerase var varmeinaktiveret, og den stumpendede DNA blev oprenset under anvendelse af QIAquick PCR Purification Kit søjler (Qiagen GmbH) og elueret i et slutvolumen på 10 pi dobbeltdestilleret vand. Følge producentens beskrivelser kloning blev udført ved anvendelse af en Zero stump TOPO kloningskit (Invitrogen). Ti kolonier fra hver kloning blev udtaget og sekventeret på en automatisk sekvens analysator (ABI PRISM 373 DNA Sequencer, PE Biosystems, Foster City, CA, USA) ved anvendelse af de to standard vektor primere (T3 og T7) inkluderet i sættet. Sekvensen blev samlet i Bionumerics version 4.0 (Applied Math, Sint-Martens-Latem, Belgien) og kontrolleres for kimærer både ved sprængning af de enkelte sekvenser i GenBank http:.... //Www NCBI NLM NIH gov og af softwaren Pintail version 1.1 http:... //www cardiff ac uk /biosi /forskning /Biosoft /. Det fylogenetiske analyse af klonerne hørende til Escherichia
slægten blev gjort ved at downloade 16S rRNA-gensekvenser længere end 1.200 bp fra RDP v.9 databasen i Escherichia
type stammer http:. //RDP CME . MSU. edu. Sekvenserne blev trimmet til den samme længde af 1327 bp og tilpasset parvis (UPGMA) efterfulgt af en global sekvensopstilling. En endelig fylogenetisk træ blev bygget ved hjælp af WARD algoritmen hvor Enterobacter sakazakii
(AB004746) blev anvendt som udgruppe.
Erklæringer
Tak
Forfatterne ønsker at takke Hanne H. Møller, Katja Kristensen og Johanna Z Amenuvor til teknisk bistand i laboratorierne. Også tak til Stina Vesterholm for at hjælpe indsamle væv. Dette arbejde blev støttet af Kongeriget Danmark s Horseinsurance g /s og Intervet Danmark. Sponsorer havde nogen andel i den praktiske del eller konklusioner af denne undersøgelse.
Forfattere 'originale indsendte filer til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder. 12866_2009_1040_MOESM1_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 1 12866_2009_1040_MOESM2_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 2 12866_2009_1040_MOESM3_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 3 12866_2009_1040_MOESM4_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 4 12866_2009_1040_MOESM5_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 5 12866_2009_1040_MOESM6_ESM.jpeg Forfatternes oprindelige fil til figur 6

• Etablering og identifikation af en kanin model af peritoneal carcinomatose fra mavekræft
• NO-induceret motilitet virkninger i gastrisk fundus og pylorus af sGCβ1his105phe mutante mus