Vizsgálata lovak mirigyes gyomor léziók baktériumok, beleértve a Helicobacter spp fluoreszcens in situ hybridisation

vizsgálata lovak mirigyes gyomor léziók baktériumok, beleértve a Helicobacter spp katalógusa fluoreszcens in situ hibridizáció katalógusa katalógusa Abstract Background katalógusa
A lovak mirigyes gyomor gyakran befolyásolja az erózió és a fekély. A vizsgálat célja az volt, hogy felmérje, hogy a baktériumok, beleértve a Helicobacter lehetne vonni a etiológiájában gyomor mirigyes elváltozás látható lovak. Katalógusa Eredmények katalógusa Gyomor elváltozások, valamint a szokásos megjelenő nyálkahártya nyerték lovak levágott emberi fogyasztás. Minden mintát teszteltünk ureáz aktivitás felhasználásával Pyloritek ® assay, míg nyálkahártya bakteriális tartalom alkalmazásával értékeltük fluoreszcens in situ
hibridizációval. A kiválasztott almintákban, baktériumok jellemzése folytatódott tovább klónozása és szekvenálása. Nyálkahártya elváltozások találtak 36/63 gyomor és benne hyperplasia rugae, polypoid struktúrák és fokális eróziót. Egyik minta sem volt pozitív a ureáz aktivitás vagy FISH segítségével a Helicobacter nemzetség specifikus próba. A mintákat elváltozások, valamint a normál mintákat, klónok 99% hasonlóságot Lactobacillus salivarius
és Sarcina ventriculi
talált. Escherichia katalógusa mint baktérium klónok és Enterococcus klónokat igazolták egy fokális eróziója. Alapuló filogenetikai fát ilyen klón 100% -os hasonlóságot mutat az Escherichia fergusonii és Enterococcus faecium katalógusa. Az Enterococcus találtak kolonizáló nyálkahártya felszínén, míg az E. fergusonii katalógusa szervezetek ellen is bizonyította intraepitheliális. Katalógusa Következtetés katalógusa gyomor Helicobacter spp. nem lehetett ellenőrizni szerint részt vett elváltozások a mirigyes gyomor a ló. Mivel E. fergusonii katalógusa már le, mint egy feltörekvő kórokozó emberekben és állatokban egyaránt, az a megállapítás ennek a baktériumnak a gyomor erózió szavatolja a további tisztázás, hogy a gyomor-fertőzés ilyen típusú baktérium fontos a lovak számára. Katalógusa háttér
a lovak, elváltozások a nem mirigyes része a gyomor erősen elterjedt és úgy tűnik, hogy okozott túlzott sav expozíció [1], de kevés leírták kapcsolatos elváltozások a mirigyes részén. Az elváltozások található a mirigyes régióban kimutattak 58% 162 kórházban lovak [2], és 47% -a 345 versenylovak [3], és bár az oka ezeknek nem sok figyelmet kapott, a savas kitettség nem úgy tűnik, hogy az elsődleges tényező , mivel nincs összefüggés elváltozások a két régió a gyomor találtuk [3].
gyomor baktériumok, mint az oka a mirigyes gyomorban léziók már javasolták többféle állatfaj és emberekben ezek igen jelentős igazolt kockázati tényező. A gyomor organizmusok talált, a Helicobacter pylori
leírták a leginkább miatt patogén potenciálját indukáló krónikus gyomorhurut, fekélyek, adenokarcinómák és Nyálkahártyához kapcsolódó limfoid szövet (MALT) lymphoma emberben [4-6]. Baktériumok e nemzetség is találtak a gyomornedvben szövetminta állatok, beleértve a kutyák, sertések, juhok és szarvasmarhák [7-10].
A ló, ellentmondásos bizonyíték kilép a tekintetben, hogy baktériumok, amelyek specifikusan okozhat gyomor elváltozások előfordulnak. Néhány tanulmány azt mutatta, hogy a gyomor Helicobacter spp katalógusa. jelen vannak a normál megjelenő nyálkahártya PCR immunkémiai és [11, 12], míg mások nem találtak bizonyítékot a kapcsolatot a jelenléte elváltozások és a baktériumok [13]. A gyomor baktériumfaj is megerősítette vagy a javasolt részeként patogenezisének egyes gyomor- patológia emberek és más állatfajok, a jelen vizsgálat célja az volt, hogy értékelje, ha a baktériumok is be lehetne vonni a patológia figyelhető meg a lovak mirigyes gyomorban. A fő hangsúly, hogy több bizonyítékot jelenléte és lokalizációja a baktériumok általában a nyálkahártya szintjén lovak mirigyes gyomorban. Külön hangsúlyt fektettünk kapcsolatos információk megszerzésében jelenléte és részvétele minden Helicobacter fajok
a nyálkahártya-elváltozások. A fluoreszcens in situ
hibridizáció (FISH) technikát használják erre a célra, amely lehetővé teszi a használatát rRNS célzott próbák, mind a teljes bakteriális populációban és a meghatározott nemzetség /fajok. Ez a megközelítés lehetővé teszi a meghatározását a bakteriális morfológia, a bőség, a hely a szövetekben, és még jelzések a növekedés ütemére és fiziológiai tevékenységek [14]. Katalógusa Eredmények
Bruttó mirigyes sérülést láttunk 36 63 gyomor vizsgált (57,1 %). A legtöbb sérülést láttunk antrumban régióban (91,7%). Hat gyomor, elváltozásokat emellett vagy kizárólag látható a cardia vagy corpus régióban. Nem sérülések találtak a nyombélben.
A léziókat három csoportba sorolhatók, mint: Polypous (2 gyomrot a polypoid tömegek található mind a cardia és a antrum méretekkel 1 és 5 közötti centiméter átmérőjű), II: Hiperplasztikus rugae elváltozások (13 gyomor kivételével) vagy iii: hyperaemiás, erozív vagy fekélyes elváltozások, amelyek látható 21 gyomrot.
a hyperplasticus rugae mind láthatók a antrumban és mozgott, amelynek intenzív vérbőséget a váladék a rugae normálisan megjelenő nyálkahártya felületén. Bruttó megvastagodása a antrumból rugae okozta elsősorban hyperplasia gyomor foveolae képest az adott rendes mintákat. A fennmaradó léziót megállapították, hogy azokat a kis magányos elváltozások nem több, mint körülbelül 1 × 2 cm méretű. Központi területeit erozív gyomorhurut volt a leggyakoribb megállapításait ilyen típusú elváltozások és jellemzett sloughing a felületi sejtek a luminális hám egy egyidejű fibrinopurulent váladék, luminális sejttörmelék és a túlnyomórészt mononukleáris sejt infiltrátum a lamina propria. Mélyebb eróziót találtak 9 gyomor erodálódott mind a régióban a gyomor gödrök és részei a mirigyeket, megfigyelhető volt gyomorhurut csak a közvetlen szövetekben. Egy Igaz fekély találták kiterjesztve a teljes vastagsága a lamina propria, felfedve a lamina muscularis, hogy a lumenben. Maximum két elváltozások találtak mindegyik gyomrot.
Helicobacter és Ureáz aktivitás teszt
A Helicobacter genus specifikus próba nem pozitív jeleket találtak bármely 79 szövetminták (36 párosított minták és 7 kontroll) . Egyetértésben ezeket az eredményeket a FISH, sem a vizsgált minta esetében ureáz aktivitása sem. A belső kontrollok az összes ureáz vizsgálatok során pozitív mint megjelölése egy funkcionális teszt kit.
Baktériumok általában
Általában csak néhány baktérium figyeltek kapcsolódó biztosítson a mukozális felszínre, mind a sérült, valamint a egészséges gyomor mintákban. Összességében négy morfológiai különböző típusú bakteriális sejtek láthatóvá a Eubacteria szonda: 1) kisebb, rövid (0,2-0,5 nm) coccoid rúd, 2) különböző rúd (1 × 3 um), 3) a hosszú láncú rúd (akár 60 nm), vagy 4) nagy (2-3 um átmérőjű) coccoid baktériumok egyértelműen megosztó párban. Jellemzően, amikor jelen van, a baktériumok észleltek klaszterek társított takarmány részecskék vagy közel a nyálkahártya felszínén
Bizonyíték a bakteriális gastritis találtak egy gyomorra lézió durván jellemezhető, mint egy magányos erózió, 1 × 2 cm méretű, a központ pedig hyperaemiás körülvéve proliferatív epiteliális felni (1.). Mikroszkópos fokális eróziója a nyálkahártyát szivárgása vörösvértestek és leukociták, főként a neutrofil eredetű volt látható. A váladékok voltak Továbbá látható a gyomor gödrök. A sejtes gyulladásos reakció mononukleáris sejtekkel látták kiterjesztése olyan mély, mint a lamina muscularis. A felület a gyulladt nyálkahártya és a gyomor gödröket találtak erősen gyarmatosították coccoid rövid rudak alkalmazása a szonda általános baktériumok (ábra. 2). A rövid rudakat különösen figyeltek beszivárgó eróziója. Azt is megfigyelték intracelluláris hámsejtekben, csakúgy, mint a neutrofil granulociták. A bakteriális kolonizáció a gyomor korlátozódik a lézió baktériumok nem voltak láthatók a megfelelő egészséges nyálkahártya minta. 1. ábra Focal erozív lézió (fehér nyíl) annak bizonyítása bakteriális gastritis a szövettani értékelés. Lézió körülbelül 2 × 2 cm-es, és található a antrumban közel a pylorus bejárat.
2. ábra gyomornyálkahártya felmaródásos gyomorhurut kapcsolódó baktériumok. A nyálkahártya-felület és a szomszédos sejttörmeléket súlyosan baktériumok telepednek meg (piros). Néhány baktérium láthatók intracelluláris az ép epithelium (nyílhegy), valamint belül degenerált és nekrotikus hámsejtek (nyíl). Ezen túlmenően, a baktériumok találhatók belül granulociták. Fluoreszcens in situ hibridizáció a szonda célzó baktériumok, szűrőkészlet 43 bar = 25 nm. Katalógusa klónozása és szekvenálása katalógusa alapján a morfológiai és intenzitása baktériumok igazolni FISH, Részminták a C /c mintát választottak ki klónozása és szekvenálása reprezentáló minta, beleértve az egy bakteriális gyomorhurut.
a választott részminták gyomor bizonyítva különböző baktériumok morfológiájuk, két különböző típusú klónt találtunk normál megjelenő nyálkahártya minták (C minta), egyik klón volt 99% hasonlóság a Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AB370881), és a másik típusú klón volt 99% -os hasonlóságot Sarcina ventriculi
DSM 316 (X76650).
a léziók (C minta), a klónokat is találtak 99 % -os hasonlóságot Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AF182725). A nyálkahártya bakteriális gastritis, négy tíz klón kiegyenlített 100% Enterococcus faecium
, míg a fennmaradó hat klónt (nyert szekvencia letétbe helyezve GenBank a csatlakozási no. GQ423062) tartozott egy Escherichia mint
baktérium. A filogenetikai fát szerkesztettünk a hat Escherichia
mint klónt a lézió és minden volt 100% -os hasonlóság, hogy milyen típusú törzsek mind az E. fergusonii
és a Shigella flexneri katalógusa (ábra 3). Alkalmazása egy gamma Proteobacteria specifikus próba a rövid rudak infiltráló a hám, valamint talált intracelluláris belül neutrofil granulociták, ellenőrizték, mint az Escherichia
mint baktérium míg Enterococcus faecium
organizmusok azonosítottunk kolonizáló epiteliális felületén az Enterococcus specifikus próba (4. ábra és 5. ábra). 3. ábra A filogenetikai fát a 16S rRNS gén szekvencia hasonlóságot, amely megmutatja a helyzetét a hat klón tartozó Gammaproteobacteria talált ló 50L és a legszorosabban kapcsolódó típusú tartozó törzsek Escherichia nemzetség. A hat klón (acc.no. GQ423062) volt 100% -os hasonlóságot Shigella flexneri katalógusa és E. fergusonii katalógusa. Enterobacter sakazakii (AB004746) használtunk egy külső csoport. Sequence hozzáférési számok kerülnek bemutatásra.
4. ábra gyomornyálkahártya ló 50L felmaródásos gyomorhurut kapcsolódó baktériumok. Alkalmazása a fluoreszcein jelölt próba számára Gammaproteobacteria és Cy3 jelölt próba számára Enterococcus, egy E. coli
szerű organizmusok (zöld) (nyílhegy) találtak intracelluláris belül epiteliális sejtek és a epithelialis felszínén, míg az E. faecium (piros) ( ' fehér csillag "(csak gyarmatosították a hámsejtek felületén. szűrőkészlet 43/38, bar = 10 nm.
5. ábra gyomornyálkahártya ló 50L felmaródásos gyomorhurut kapcsolódó baktériumok. Nagy nagyítással bizonyító E. coli katalógusa pálcikaként ( zöld) belül extrudált hámsejtek. Fluoreszcens in situ hibridizáció a szonda célzó Gammaproteobacteria, szűrőkészlet 38 bar = 10 nm. katalógusa Vita katalógusa Korábbi tanulmányok járó lovak gyomrot pl használt PCR célzó 16S rRNS gén különösen Helicobacter
spp. [12]. a hátrányok PCR vannak, hogy az összeg és helyét a baktériumok nem ismert, és nem biztos, hogy a baktériumok életben vannak, vagy akkor is, ha a DNS-t meztelen. Ezért úgy döntöttek, hogy a FISH technika lenne jobb és több információt a baktériumok találhatók a mirigyes gyomor a ló, mivel ezekkel a kérdésekkel leküzdeni ezzel a technikával. Ezt a technikát korábban használt, hogy leírja a térbeli eloszlása ​​a Helicobacter katalógusa spp. a gyomor-bél traktusban a kutyák és a gyomorban az egészséges lovak, hogy bizonyítsa a mikrobióta a normál megjelenő pikkelysejtes és mirigyes nyálkahártya [15, 16]. A legjobb tudásunk szerint ez az első tanulmány, a FISH vizsgálni elváltozások a mirigyes gyomor.
A jelen tanulmány egyik esetben a gyomorhurut kapcsolódó bakteriális kolonizáció derült ki. Különösen az elosztási baktériumok javasolta a kapcsolatot a patológia megfigyelhető. A baktériumok mennyiségének jelentősen emelkedett a lézió körül, és azokat szorosan csatlakozott a hámsejtek, a baktériumok belenyúlik a kripták, és található intracelluláris. A klónozás azt mutatták, hogy a kettős fertőzés Enterococcus faecium katalógusa és egy Escherichia
mint a baktérium, de később ellenőrizhető a in situ hibridizáció katalógusa gamma Proteobacteria szonda, hogy ez csak az Escherichia
mint a baktérium, amely beszivárgott a felszínes fekélyek és találtak intracelluláris a hámsejtek és a neutrofil granulociták. Enterobakteriális fertőzés a bélben egy gyakori jelenség, de ez ritka, hogy ezek a fertőzések a gyomorban, és még soha nem számoltak be a felnőtt lovak. Ez az eredmény nagyon érdekes, de további vizsgálatokat kell tisztázni, hogy milyen gyakori ez a jelenség a lovak. Továbbá, hogy az ilyen típusú fertőzés elsődleges vagy másodlagos eredetű lenne tisztázásra szorul. Az Escherichia
mint klónok minden volt 100% 16S rRNS gén hasonlóság mind az E. fergusonii katalógusa és Shigella flexneri katalógusa. Így, ebben a vizsgálatban, azt nem lehet pontosítani kísérletileg amely a két organizmusok, hogy jelen volt ebben a mirigyes elváltozás. Azonban, az emberek számoltak be, hogy az csak természetes gazda számára Shigella katalógusa [17], míg az E. fergusonii
összefüggésbe hozták a legkülönbözőbb intestinalis és extraintestinalis fertőzések mind az emberek és állatok, beleértve a lovak [18 , 19]. Ezért a legvalószínűbb, hogy az Escherichia
mint baktérium talált ebben a tanulmányban tartozik az E. fergusonii katalógusa. Tanulmányok kimutatták, E. fergusonii katalógusa feltörekvő kórokozó és kapcsolódó különösen bacteriaemiát és sebfertőzés, de pontos szerepét fertőzések emberekben és állatokban egyaránt még nem tisztázott [20]., Mikrobiológiai mintákban
a környezet a mirigyes gyomor általában nagyon ellenséges felé mikrobák [21]. Jól megalapozott, hogy ellentétben az emberek és a kutyák, amelyek étkezés adagolók, lovak folyamatos savas termelők, valószínűleg a folyamatos etetés minta [22, 23]. A pH a ventrális része a ló gyomor stabil pH-érték körüli 1-3 egész 24 óra alatt [24], így a viszonylag alacsony sokféleségét baktériumok megfigyelt nyálkahártya minták ebben a vizsgálatban nem volt váratlan.
A jellegzetes morfológiai fenotípus nagy coccusokat növekvő rendszeres tetrád jött létre, hogy egy klón a 99% -os hasonlóságot Sarcina ventriculi katalógusa. Ez az organizmus ismert, hogy képes növekedni gyomortartalom és a jellegzetes TETRADE szerkezet amikor termesztett pH 1- pH 3 [25]. A jelenlegi vizsgálatban a megállapítása ezek az organizmusok nem lehetett megállapítani, hogy része legyen semmilyen konkrét patológia, mivel megállapították, hogy azok alacsony számok a párosított minta (azaz lézió és normál), valamint a kontroll mintákban. Sarcina-szerű baktériumot találtak a különböző fajok, ahol már állítólag okoz abomasal felfújni, vérzés és fekély bárányok és kecskegidák [26, 27], valamint a lehetséges kapcsolatot a gyomor tágulata kutyákat és a lovakat is rendelkezik javasolták [28]. Nincs bizonyíték a gáz felhalmozódást figyeltek makroszkóposan bármelyik ezek a lovak, és ezért nem tűnik, hogy a jelenléte Sarcina ventriculi katalógusa hozzájárult a patológia megfigyelt ezek a lovak.
Nem volt meglepő, hogy a Lactobacillus (Lactobacillus salivarius
) találtak a vizsgált szövetek és általa korábban leírták, hogy számos Lactobacillus
spp., beleértve a L. saiivarius katalógusa, jelen vannak egészséges lovak [16, 29]. A proximális ló gyomor funkcionál tárolás takarmány, valamint egy rekesz intragasztrikus erjedés. Az ökoszisztéma ebben a régióban áll, mind anaerob és laktát-hasznosító baktériumok nagy számban, amelyek felelősek a növekedés illékony zsírsavak upon fermentációs szénhidrátok [30]. Különösen Lactobacillusok találtak tapadt a hám a proximális része a ló gyomor [31], és ezek a baktériumok valószínűleg át a mirigyes gyomorban részeként normál turn-over. Mi már csak azt vizsgálta, részmintáinak és több bakteriális taxon megtalálhatók lesznek egészséges része a mirigyes gyomor, ha egy átfogóbb bélflóra közösség vizsgálat történt. Katalógusa érvényessége megállapításai Helicobacter katalógusa Egyik szövetminta antrum régió bizonyították pozitív jeleket a Helicobacter spp katalógusa. szonda ebben a vizsgálatban, és nem spirál alakú baktériumok észleltek a FISH technika sem. Egy nemrégiben készült tanulmány Venezuela, spirál alakú baktérium jelentettek biopsziás a kardiális régióban a lovak gyomor festettük Warthin-Starry folt [12]. Helicobacter spp katalógusa. ismert, hogy képesek megtelepedni a gyomorban nagy mennyiségű citoplazmatikus ureáz [32] A gyors ureáz teszt használható ebben a vizsgálatban, Pyloritek ®, érzékeli a ureáz aktivitása a szövet minta által az ammónia előállítása, amikor a karbamid van jelen. Ez széles körben használják az emberi gyakorlatban kimutatására gastritis okozta Helicobacter spp katalógusa. A pozitív és negatív prediktív értékek között 98,1-100% és 95,8-100% -kal nőtt a alkalmazó vizsgálatban humán betegek előtt és után felszámolása a baktérium [33]. Ebben a vizsgálatban nem Pozitív találtak, jelezve, hogy a biopsziák a jelen tanulmányban nem tartalmazott baktériumokat a képessége, hogy ureáz.
Következtetések
gyomor Helicobacter
spp. nem található, és nem lehetett kapcsolódik a gyomor elváltozások a 36 ló elemzett ebben a vizsgálatban. A patológia találhatók ebben a vizsgálatban polypoid struktúrák hyperplasticus rugae és kis eróziót, de bakteriális érintettség csak egy esetben erózió. Ebben a lézió, egy Escherichia-szerű klón, a legvalószínűbb E. fergusonii katalógusa, találtak intracelluláris. Hogy ez volt az elsődleges vagy másodlagos fertőzés nem lehetett elvégezni. Nagyon korlátozott mennyiségű baktérium általában találtak a ló mirigyes régió várható. Így észlelése közepesen nagy mennyiségű minden baktériumot a mirigyes nyálkahártya szintjén, valamint a kripták kell aggodalomra ad okot, mivel ez nem úgy tűnik, hogy egy normális lelet a lovak mirigyes gyomorban. További vizsgálatok bevonásával baktériumok és a kapcsolatos gyomor elváltozások lovak megerősítette a klinikai tünetek nem indokoltak, mivel ezek a lovak nem szerepel a jelenlegi vizsgálatban. Katalógusa Módszerek katalógusa Lovak és tanulmánytervek katalógusa A tanulmány került sor a keresztmetszeti vizsgálat gyomor populációból származó 63 vágóhíd lovak Dániában. Lovak hagyta jóvá a Veterinary Officer egészséges vágásra. Lovakat megdöbbentette závárzat és a vért. A gyomor, beleértve az 5 - 10 cm, a disztális nyelőcső és 10 cm-es proximális duodenum, azonnal eltávolítottuk kizsigerelés után, és kinyitotta a nagyobb görbület mentén. Bevitt anyagban eltávolítjuk, és ha szükséges, a nyálkahártya óvatosan öblítjük legalább csapvíz előtt ellenőrzés. Csak gyomor makroszkopikus léziókat a mirigyes nyálkahártyát benne, valamint hét kontroll gyomor nem bruttó bizonyíték gyomor elváltozások.
Glandular léziók definiáljuk a nyálkahártya, amelynek rendellenes Makroszkopikus megjelenés azaz hyperaemiás, megnövelt vastagságú, eróziók vagy fekélyek . Az anatómiai pozíciói voltak észlelhetők, mint: a cardia, corpus vagy antrumban régióban (6.). 6. ábra anatómiai régió a gyomor kinyitotta a nagyobb görbület mentén. A nem mirigyes régió fehér megjelenő hámszövet, míg a mirigyes régió árnyalatú piros. Vannak elválasztva a Margo plicatus katalógusa. A mintában szereplő három régiók a következők: Cardia, mint a kis sáv területe alatt, végig a margo plicatus katalógusa, a corpus régiót tartalmazó sav, pepszinogén nyálka mirigyek (sötétvörös), valamint az antrumban régiót tartalmazó primarly nyálka és gasztrinszint mirigyek.
Mintavételi eljárás
minden egyes gyomrot mirigyes elváltozások, három szöveti mintákat, ahol kapott a legnagyobb elváltozás (a, b, C), valamint a három párosított normál megjelenő szövetminták (a, b, c) az azonos anatómiai régióban, de legalább legalább 5 cm-re. A /a: egy kis, biopszia méretű (0,5 x 0,5 cm) nyálkahártya mintát nyertünk azonnali ureáz vizsgálathoz a Pyloritek ® assay alkalmazásával a gyártó utasításait. Vizsgálatok után olvastuk egy 60 perces standard idő és az eredmények megjegyezte, pozitív vagy negatív. Minták b /B: a 3 × 3 cm-es, teljes vastagságú szövet minta, beleértve a nyálkahártya és a nyálkahártya alatti szövetre kaptuk a halak és rögzített 10% -os pufferolt formalinnal. 24 óra eltelte után fixálás a mintákat át 70% -os etanollal, paraffinba ágyazott, metszeteket 3 um és szerelt Superfrost /plusz csúszdák (Menzel-Glaser Braunschweig Németország).
Mintákat a C /c: a harmadik pár szövet minták klónozása és szekvenálása kaptunk, és hirtelen lefagyasztottuk használva száraz jég (Ha lézió mérete megengedett IT).
a hét kontroll gyomor nem makroszkopikus gyomor sérülések, a mintákat a, b és C vettünk a normál megjelenő nyálkahártya a antrumból. Ezek közül három lovat emellett mintát vettek cardia, korpusz és nyombél is.
A mintavételi eljárások zajlott augusztustól 2007. október Történelmi adatok szerint a korábbi egészségügyi ló nem lehetett szerezni. Katalógusa fluoreszcens in situ a hibridizáció baktériumok
mikrobiális érzékelés, a metszeteket hibridizáljuk egyszerre két 16S rRNS jelölt próbák különböző fluorofor. Az oligonukleotid-próba az S-D-BACT-0338-a-A-18 célzási baktérium (5'GCTGCCTCCCGTAGGAGT3 ") [34] volt 5 'címkézni fluoreszcein-izotiocianát és izotiocianát-származék Cy3. Az oligonukleotid próba HEL717 célzó Helicobacter genus (5'AGGTCGCCTTCGCAATGAGTA3) [35] volt, 5 'jelzett izotiocianát-származékkal Cy3. Annak ellenőrzésére, a klónozás eredménye egy harmadik és egy negyedik próba, LC-gProt-1027-AA-17 (5'GCCTTCCCACATCGTTT3) célzó 23S rRNS a Gammaproteobacteria volt 5 'címkével ellátott izotiocianát és szonda SG-Enteroco-184 (5'CAAATCAAAACCATGCGG3 ') volt Cy3 jelzett célba 16S rRNS Enterococcus katalógusa spp [36]. Mindegyik próbát szintetizált DNS technológiával, Aarhus, Dánia. A tárgylemezeket paraffint xilolban és át 100% -os alkohol 30 percig, mielőtt hibridizációval. A hibridizációs végeztük 45 ° C hőmérsékleten 40 ml hibridizációs pufferben (100 mM Tris [pH = 7,2], 0,9 M nátrium-kloridot, 0,1% nátrium-dodecil-szulfát), és 200 ng mindegyik próba 16 órán át egy Sequenza Slide Rack (Thermo Shandon, Cheshire, Egyesült Királyság). A mintákat ezután háromszor mostuk előmelegített (45 ° C) hibridizációs pufferben 15 percig, és ezt követően háromszor előmelegített (45 ° C) mosóoldattal (100 mM trisz [pH = 7,2], 0,9 M NaCl). A mintákat vízzel leöblítettük, levegőn szárítjuk és szerelt Vectashield (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) az epifluoreszcens mikroszkópia. Egy Axioimager M1 epifluoreszcens mikroszkóppal felszerelt epifluoreszcens egy 100-W HBO lámpa és a szűrő meghatározza a 43. és 38. használtunk láthatóvá Cy3 és fluoreszcein, ill. Kép alkalmazásával kaptuk Axiocam MRm 3-as verzió FireWiremonocrome kamera és a szoftver Axiovision 4.5 verzió (Carl Zeiss, Oberkochen, Németország).
Értékelése epifluoreszcens mikroszkópia végeztük leírása szubjektív összeg, morfológiai megjelenését és helyét a fluoreszkáló sejtek látszólagos az egyes szövetek mintában. Ezen kívül minden szöveti metszeteket H &E és értékelték kórszövettanilag.
16S rDNS-amplifikáció és klónozás
észlelése után a baktériumok segítségével FISH, al származó mintákat lovak bizonyító baktériumok különböző morfológiájú választottuk 16S rRNS gén klónozás. A DNS-t izolálunk a 4. szövetminta segítségével Easy-DNA kit (Invitrogen, Tåstrup, Dánia) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. A 16S rRNS gén amplifikáltuk primerek SD-Bact-0008-as-20 (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ') [37] és az S - * - Univ-1492-AA-19 (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') [38]. PCR ciklus állt egy kezdeti denaturáció 94 ° C-on 6 perc; majd 30 ciklus követett denaturálással 94 ° C-on 30 s, lánckapcsolódás 55 ° C hőmérsékleten 45 s és 72 ° C 2 perc; és egy végső extenzió 72 ° C-on 3 percig. Az amplifikált DNS-t ellenőrzött elektroforézissel agaróz gélen. A PCR-termékeket tisztítottuk, a Qiaquick PCR tisztítási kit oszlopok (Qiagen GmbH, Hilden, Németország). Ahhoz, hogy tompa végű DNS-, a következő keverünk össze egy 0,5 ml-es mikrocentrifuga csőbe, 4 mikroliter 5 × T4 DNS polimeráz puffer, 14,7 ul tisztított PCR-termék 0,8 ul dNTP (2,5 mmól l -1 mindegyik), és 0,5 ul (1,2 U) T4 DNS-polimerázt (Invitrogen), és inkubáljuk 12 ° C-on 15 percig. A T4 DNS-polimerázt hővel inaktiváljuk, és a tompa végű DNS-t megtisztítottuk a QIAquick PCR tisztítási kit oszlopok (Qiagen GmbH) és eluáltuk a végtérfogat 10 | il kétszer desztillált vízben. Követve a gyártó leírását a klónozást végeztünk alkalmazásával Zero tompa TOPO klónozó reagenskészlet (Invitrogen). Tíz telepeket minden egyes klónozási szedtünk fel és szekvenáltuk egy automatikus szekvencia analizátorral (ABI PRISM 373 DNS Sequencer; PE Biosystems, Foster City, CA, USA) segítségével a két szabványos vektor primereket (T3 és T7) tartalmazza a készlet. A szekvenciát összeszerelt Bionumerics 4.0 (Applied Math, Sint-Martens-Latem, Belgium) és ellenőrizni kimérák mind a robbantási az egyes szekvenciák GenBank http: //www. NCBI. NLM. NIH. Gov és a szoftver által Pintail 1.1 verzió: http: //www. Cardiffban. ac. uk /biosi /kutatás /BIOSOFT /. A filogenetikai elemzés a klónok tartozó Escherichia nemzetség katalógusa végezte letöltésével 16S rRNS gén szekvenciák hosszabb 1200 bp-RDP V.9 adatbázis az Escherichia katalógusa típusú törzsek http: //RDP. CME . MSU. edu. A szekvenciák nyírt azonos hosszúságú 1327 bp, és egy vonalban páronkénti (UPGMA), majd egy globális szekvencia illesztés. A végső filogenetikai fa került kialakításra, a WARD algoritmus ahol Enterobacter sakazakii katalógusa (AB004746) használtunk külső csoport. Katalógusa nyilatkozatok katalógusa Köszönetnyilvánítás katalógusa A szerzők köszönetet mondanak Hanne H. Møller, Katja Kristensen és Johanna Z Amenuvor a technikai segítségnyújtás a laboratóriumokban. Szintén köszönet Stina Vesterholm hogy segítse gyűjtő szövetekben. Ezt a munkát támogatja Kongeriget Danmark a Horseinsurance g /s és az Intervet Dániában. Támogatók nem vett részt a gyakorlati része vagy E tanulmány következtetéseit. Katalógusa Szerzők eredeti beküldötteknek képeket
alábbiakban a linkeket a szerzők eredeti beküldötteknek képeket. 12866_2009_1040_MOESM1_ESM.tiff A szerzők eredeti fájlt az 1. ábra szerinti 12866_2009_1040_MOESM2_ESM.tiff A szerzők eredeti fájl 2. ábrán 12866_2009_1040_MOESM3_ESM.pdf A szerzők eredeti fájl 3. ábra 12866_2009_1040_MOESM4_ESM.tiff A szerzők eredeti fájl 4. ábra 12866_2009_1040_MOESM5_ESM.tiff A szerzők eredeti fájl 5. ábra 12866_2009_1040_MOESM6_ESM.jpeg a szerzők eredeti fájl 6. ábra

• Létrehozása és azonosítását nyúlmodellben peritoneális carcinomatosis származó gyomorrák
• NO-indukált motilitás hatások gyomor fundus és pylorus a sGCβ1his105phe mutáns egerek