Ispitivanje konjski žljezdane želučanih lezija za bakterije, uključujući i Helicobacter spp strane fluorescentne in situ hibridizacije

Ispitivanje konjski žljezdane želučanih lezija za bakterije, uključujući i Helicobacter spp Netlogu strane fluorescentne in situ hibridizacije pregled
apstraktne pregled pozadine
konja žljezdanog želuca obično je pod utjecajem erozije i ulceracije. Cilj ovog istraživanja bio je utvrditi da li bakterije, uključujući Helicobacter, mogu biti uključeni u etiologiju želučanih žljezdane lezija vidi na konjima. Pregled Rezultati
Želudac lezija, kao i normalne pojavljuju sluznice dobiveni su od konja zaklanih za ljudsku potrošnju. Svi uzorci su testirani na aktivnost ureaze pomoću Pyloritek ® testu, dok je mukozni bakterijska sadržaj je određen primjenom Fluorescentna in situ hibridizacija pregled. U odabranim uzorcima sub, bakterije karakterizacija je nastaviti s kloniranjem i sekvenciranje. Mukozne lezije nađene su u 36/63 želucima i uključeni hiperplastične rugae, Polipoidne strukture i fokalne erozije. Niti jedan od uzoraka pozitivno na aktivnost ureaze ili FISH pomoću specifičnog sondu Helicobacter rod. U uzorcima lezija, kao i normalnih uzoraka, klonova s ​​99% sličnosti s Lactobacillus salivarius Netlogu i Sarcina pronađeni su ventriculi pregled. Escherichia pregled kao i bakterije klonova i Enterococcus klonova su pokazali u jednom žarišnom erozijom. Na temelju filogenetskom stablu ovi klonovi imali 100% sličnosti s Escherichia fergusonii i Enterococcus faecium
. Enterococcus pronađena su kolonizaciju s površine sluznice, dok je E. fergusonii
organizmi su također pokazali intraepitelna. Pregled Zaključak pregled želuca Helicobacter spp. ne može se potvrditi da su uključeni u lezijama žljezdanog želuca konja. Od E. fergusonii pregled je opisan kao nastajanju patogena u ljudi i životinja, nalaz ove bakterije u želučanom erozije tjeralica dodatno pojašnjenje da li želučane infekcije s ovim tipom bakterije je važno za konje. Pregled Pozadina
u konja, lezije nisu žljezdanog dijela želuca su vrlo česti i čini se da su uzrokovane izloženosti prekomjernoj kiseline [1], ali malo je opisan u vezi lezija u žljezdanog dijela. Lezije koje se nalaze u žljezdanog regiji su pokazali u 58% 162 hospitaliziranih konja [2], a 47% od 345 trkaćih konja [3] i dok je uzrok ovi nisu primili mnogo pažnje, kiselina izloženost ne čini se da je glavni čimbenik kao korelacija između lezija dva područja želuca je nađeno. [3]
želučanom bakterije kao uzrok žljezdane želučanih lezija predloženi su mnogih životinjskih vrsta i kod ljudi, to predstavlja glavni faktor rizika potvrđena. Od želučanih organizama, Helicobacter pylori pregled opisan najviše zbog patogeni potencijal induciranja kronični gastritis, čir, adenokarcinomi, te sluznice limfnog tkiva (MALT) u limfom kod ljudi [4-6]. Bakterije ovog roda su također pronađeni u uzorcima želučane tkiva od životinja, uključujući pse, svinje, ovce i goveda [7-10].
U konja, kontradiktorne dokaze izlazi da li oštećenja probavnog sustava javljaju bakterije koje posebno mogu uzrokovati. Nekoliko istraživanja su pokazala da želučana Helicobacter spp Netlogu. su prisutni u normalnim pojavljuje sluznice pomoću PCR i imunokemijskog [11, 12], dok su drugi pronašli dokaze o povezanosti između prisutnosti lezije i bakterija [13]. Kao što je želučani bakterijskih vrsta je potvrđena ili predložen kao dio patogeneze određene vrste želuca patologije kod ljudi i drugih životinjskih vrsta, cilj ovog istraživanja bio je procijeniti, ako bakterije mogu biti uključeni u patologiju promatrane u konjski žljezdanog želuca. Glavni fokus je bio pružiti više dokaza o prisutnosti i lokalizaciju bakterija u cjelini na razini sluznice od konja žljezdanog želuca. Poseban naglasak je stavljen na dobivanje informacija o nazočnosti i sudjelovanju bilo Helicobacter vrste pregled u mukozne lezije. Fluorescencije u tehnici situ pregled hibridizacije (FISH) je korišten za ovu svrhu, koja omogućuje korištenje rRNA ciljanih uzoraka za oba ukupnog bakterijske populacije i definirane rod /vrsta. Ovaj pristup omogućuje određivanje bakterijske morfologije, obilja, mjestu u tkivima, pa čak i naznake o stopama rasta i fiziološke aktivnosti [14]. Pregled Rezultati
Bruto žlijezda lezije su vidjeli u 36. 63 želucima ispitanih (57,1 %). Većina lezija viđeni u antralnom regiji (91,7%). U šest želudaca, lezije su dodatno ili isključivo vidi u cardia ili corpus regiji. Nema lezije pronađene su u dvanaesniku
Lezije su razvrstani u tri skupine kao što su:. Nalik polipu (2 želuce s Polipoidne masa se nalazi u oba kardija i antruma s veličinama između 1 i 5 cm u promjeru), ii: Hiperplastične rugae lezije (13 želuci) ili III. Hyperaemic, erozivni ili ulcerozni promjena koje su vidjeli u 21 želucima
hiperplastične rugae su svi vidjeli u antruma i kretala se u rasponu od potrebe intenzivne hiperemiju s eksudata na rugae s normalno pojavljuju sluznice površine. Bruto zadebljanje u antralnom rugae uzrokovano primarno hiperplazija želučanog foveolae usporedbi s odgovarajućim uobičajenim uzoraka. Preostale lezije su svi pronađeni biti male samostalne promjene ne više od oko 1 × 2 cm u veličini. Focal područja erozivnog gastritisa je najčešći nalaz ove vrste lezija i karakterizira kao sloughing od površinskih stanica lumena epitela uz istovremeni fibrinopurulent eksudata, lumena staničnog otpada i stanične infiltrat lamina propria pretežno mononuklearnih. Dublji erozije pronađena u 9 želucima smanjilo kako na području želuca jamama i dijelovima žlijezde, koje je opaženo kod gastritisa samo od neposredne tkiva. Jedan pravi čir pronađen proteže preko debljine lamina propria, izlaganje lamina muscularisa u lumen. Najviše dva lezije pronađene su u svakoj od tih želuca.
Helicobacter i aktivnost ureaze testa pregled Koristeći specifičnu sondu roda Helicobacter nema pozitivni signali su našli u bilo kojem od uzoraka 79 tkiva (36 uparenih uzoraka i 7 kontrola) , U dogovoru s tim rezultatima riba, niti jedan od uzoraka pozitivno na aktivnost ureaze bilo. Unutarnje kontrole svih ureaza testovi su pronađeni pozitivni pokazatelj funkcionalnog test kit.
Bakterija u općoj Netlogu Općenito, malo bakterije su uočene odnosi se samo na površinu sluznice u oba ozlijeđena, kao i u zdravom želucu uzorci. Sve u svemu, četiri morfološke različite vrste bakterijskih stanica može se vizualizirati sa eubakterije sonde: 1) mali, kratki (0,2-0,5 um) prekomjernog rasta kokoidnih šipke, 2) različita štapovima (1 × 3 um), 3) dugo lancima šipke (do 60 um) ili 4) velike (2-3 promjera lm) prekomjernog rasta kokoidnih bakterije jasno dijeli u parovima. Obično kad je prisutan, bakterije uočene su u skupinama povezanim s česticama hrane ili se nalaze blizu površine sluznice
dokazima bakterijske gastritisa je pronađena u jednoj želuca lezije grubo karakterizirano kao osamljeni erozije, 1 × 2 cm veličine, središte se hyperaemic i okružen proliferacije epitela oboda (sl. 1). Mikroskopski žarišna erozija sluznice s oozing eritrocita i leukocita, uglavnom neutrofilnih podrijetla, bio viđen. U eksudati dodatno su vidjeli u želučanom jamama. Stanični upalna reakcija sa mononuklearnih stanica je vidio širi kao duboko kao u lamina muscularis. pronađeni su Površina upaljene sluznice i želučanih jama jako kolonizirali prekomjernog rasta kokoidnih na kratke štapiće primjenom sondu za opće bakterija (sl. 2). Kratke štapovi su bili posebno promatrana infiltracije eroziju. Su također opažena unutarstaničnih u epitelnim stanicama, kao i unutar neutrofilnih granulocita. Bakterijska kolonizacija želuca bila ograničena na lezije kao što ne postoje bakterije viđeni su u odgovarajućem zdravom uzorka sluznice. Slika 1 Focal razoran lezija (bijela strelica) demonstrirajući bakterijske gastritis na histološki pregled. Lezija je oko 2 × 2 cm, a nalazi se u antruma blizini pyloric ulaza.
Slika 2 želučane sluznice s erozivni gastritis povezan s bakterijama. Površini sluznice i uz stanični ostaci teško koloniziraju bakterije (crveno). Nekoliko bakterije su vidjeli unutarstanični u netaknutoj epitela (strelica), kao i unutar degeneriranih i nekrotične epitelnim stanicama (strelice). Osim toga, bakterije se nalaze unutar granulocita. Fish sa sondom ciljanje bakterije, filter set 43, bar = 25 um. Pregled Kloniranje i sekvenciranje pregled temelju morfologije i intenzitet bakterija pokazati pomoću FISH, poduzorka C /c uzoraka odabrani su za kloniranje i sekvenciranje predstavlja uzoraka, uključujući one s bakterijskom gastritis. pregled odabranog poduzorka od želudaca pokazuju različite bakterije morfologije, dvije različite vrste klonova pronađeni su u normalnim pojavljuju uzorcima sluznice (c uzoraka), jedan klon imao 99% sličnosti da Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AB370881) i druge vrste klonova imao 99% sličnosti u Sarcina ventriculi pregled DSM 316 (X76650).
od lezija (c uzoraka), klonovi su također pronađena s 99 % sličnosti s Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AF182725). Od sluznice s bakterijskom gastritis, četiri od deset klonova podudaraju 100% Enterococcus faecium pregled, dok je preostalih šest klonova (dobivenih slijed deponiran u GenBank s pristupanjem br. GQ423062) pripadala Escherichia kao
bakterija. Filogenetskog stabla izgrađena sa šest Escherichia pregled kao klonovi iz lezija i svi su imali 100% sličnosti u sojeva tipa oba E. fergusonii Netlogu i Shigella flexneri pregled (slika 3). Primjenom specifičnog sonde gama proteobacteria kratke šipke infiltriranih epitel, kao i pronađene unutarstaničnih unutar neutrofilnih granulocita, potvrđeni su kao što je Escherichia
slično bakterije dok je Enterococcus faecium
organizmi prepoznaje kolonizaciju površinu epitela sa specifičnom sondom Enterococcus (Slika 4 i 5). Slika 3 filogenetski stablo 16S rRNA gena slijed sličnosti, prikazuju položaj šest klonova koji pripadaju Gammaproteobacteria naći u Horse 50L i najbližih sojeva tipa pripadaju Escherichia roda. Šest klonovi (acc.no. GQ423062) je imao 100% -tnu sličnost sa Shigella flexneri Netlogu i E. fergusonii Netlogu. Enterobacter sakazakii (AB004746) se koristi kao outgroup. Brojevi pristupni Slijed su prikazani.
Slika 4 želučane sluznice od konja 50L sa erozivni gastritis povezan s bakterijama. Primjena fluoresceinom obilježenih sondi za Gammaproteobacteria i Cy3 obilježenih sondi za Enterococcus, E. coli pregled kao organizam (zeleni) (strelica) pronađeno je unutarstaničnih u epitelnim stanicama, a na epitelne površine, dok E. faecium (crvena) ( ' bijela zvijezda '(samo koloniziraju površinu epitela. Filter postavljen 43/38, bar = 10 pm.
Slika 5 želučane sluznice od konja 50L sa erozivni gastritis povezan s bakterijom. visoke uvećanje pokazujući E. coli pregled kao i šipke ( zelena) u roku od ekstrudiranih epitelnim stanicama. fish sa sondom ciljanje Gammaproteobacteria, filter set 38, bar = 10 pm. pregled Rasprava pregled prethodnih studija koje uključuju konja želudac se npr koristi PCR ciljanje 16S rRNA gena posebno Helicobacter pregled spp. [12]. nedostaci pomoću PCR su da je količina i mjesto bakterija nije poznat, a to je neizvjesno hoće li se bakterije su živi ili čak i ako je DNA je gol. Dakle, odlučeno je da se tehnikom FISH bi pružiti bolju i više informacija od bakterija koje se nalaze u žljezdani želudac konja, jer su ta pitanja prevladati s ovom tehnikom. Ova tehnika je prethodno korišten za opisivanje prostorni raspored Helicobacter pregled spp. u gastrointestinalnom traktu pasa i u želucu zdravih konja pokazati mikrobne normalne pojavljuju pločastih i žljezdanog sluznicu [15, 16]. Koliko je nama poznato ovo je prva studija pomoću FISH ispitati lezije žljezdanog želuca.
U ovom istraživanju jednom slučaju gastritisa povezane s bakterijska kolonizacija je otkriveno. Posebno je raspodjela bakterija predložio vezu s patologije promatrana. Količina bakterija izrazito povećana oko lezije te su čvrsto prijanja uz epitelne stanice, bakterijom proteže u grobnice i nalazi unutarstaničnim. Kloniranje je pokazalo da je to bio dvostruki infekcija Enterococcus faecium Netlogu i Escherichia
poput bakterija, ali je naknadno potvrđena pomoću in situ hibridizacije pregled s gama proteobacteria probe da je to bio samo Escherichia
kao i bakterije koje se infiltrirali u površinske ulceracije i pronađeni su unutarstaničnih u epitelnim stanicama i unutar neutrofilnih granulocita. Enterobacterial infekcije u crijevima je uobičajena pojava, ali to je rijetko da ove infekcije u želucu i to nikada prije nije zabilježen u odraslih konja. Ovaj rezultat je vrlo intrigantna, ali daljnja istraživanja trebaju razjasniti kako česta je ova pojava u konja. Isto tako, da li je ova vrsta infekcije je od primarnog ili sekundarnog porijekla će potrebna dodatna pojašnjenja. Escherichia
kao klonovi svi su imali 100% 16S gena sličnost rRNA na oba E. fergusonii pregled i Shigella flexneri pregled. Dakle, u ovoj studiji, to ne može biti precizirano eksperimentalno koji od ova dva organizama koji su bili prisutni u ovom žljezdanog lezije. Međutim, ljudi su izvijestili da su jedini prirodni domaćin Shigella pregled [17] dok je E. fergusonii pregled je povezana s raznim crijevnih i ekstra-crijevnih infekcija kod ljudi i životinja, uključujući konja [18 , 19]. Stoga je vrlo vjerojatno da je Escherichia
poput bakterija pronađena u ovoj studiji pripada E. fergusonii Netlogu. Studije su izvijestili E. fergusonii pregled kao uzročnika u nastajanju i povezane s posebno bacteraemia i zacjeljivanje infekcije, ali njegova točna uloga u infekcija u ljudi i životinja i dalje mora biti razjašnjen [20]. Pregled, mikrobiologija u uzorcima
okruženje u žljezdanog želuca je općenito vrlo neprijateljski prema mikrobima [21]. Dobro je poznato da je, za razliku od ljudi i pasa koji su obrok za stočnu hranu, konji su proizvođači kontinuirano kiselina, vjerojatno zbog kontinuiranog hranjenja uzorak [22, 23]. PH u trbušni dio konjskog trbuha stabilna na oko pH 1-3 tijekom razdoblja od 24 sata [24], a time je relativno nizak raznolikost bakterija promatrane u mukoznim uzorcima koji su u ovom istraživanju nije bilo neočekivano.
Obilježje morfološka fenotip velikog koka raste u redovitim tetrads je ustanovljeno da je klon sa sličnosti Sarcina ventriculi
99%. Ovaj organizam je poznato da bi mogli rasti u sadržaju želuca i ima karakterističan tetrade strukturu kada je narasla od pH 1- pH 3 [25]. U trenutnoj studiji, nalaz tih organizama ne može se utvrditi da je dio bilo koje specifične patologije, kao što su bili pronađeni u niskim brojevima u uparenih uzoraka (tj lezija i normalno), kao i u kontrolnim uzorcima. Sarcina slične bakterije pronađeni su u različitim vrstama, na kojem su trebale izazvati abomasal nadimati, krvarenje i čireva u janjadi i koza djecu [26, 27] i mogući link na želučanu dilatacije u obje pasa i konja ima i predloženo je [28]. Nema dokaza plinskih akumulacija zabilježeno je makroskopski u bilo kojem od tih konja, a time ne čini se da je prisutnost Sarcina ventriculi
pridonijeli patologije promatrana u ovim konjima.
Nije bilo iznenađujuće da Lactobacillus (Lactobacillus salivarius
) pronađen je u ispitivanim tkivima, a ranije je izvijestio da su prisutni u zdravih konja [16, 29] nekoliko Lactobacillus
spp., uključujući i L. salivarius Netlogu,. Proksimalni konja funkcije želuca i za smještaj hrane, kao i pretinac za unutaržclučanom fermentacije. Ekosustav u ovoj regiji sastoji se od anaerobnih i laktata-koriste bakterija u velikom broju, koji su odgovorni za povećanje hlapljivih masnih kiselina nakon fermentacije ugljikohidrata [30]. Posebno Lactobacilli pronađen pridržavanje epitel u proksimalnom dijelu konja želuca [31] i bakterija vjerojatno će proći žljezdanog želudac dio normalnog smjena. Mi smo ispitati samo poduzorka i bakterijske svojte će se naći u zdravom dijelu žljezdanog želuca ako je više sveobuhvatna studija mikrobiota zajednica je učinjeno.
Valjanosti nalaza Helicobacter pregled Niti jedan uzorak tkiva iz antruma regija pokazala pozitivne signale iz Helicobacter spp Netlogu. sonda u ovom istraživanju i bez spirala u obliku bakterija zabilježena tehnikom FISH bilo. U nedavnom istraživanju iz Venezuele, spiralne obliku bakterije su prijavili u biopsijama od srčanog regije konjski trbuh bojen s Warthin-zvjezdano mrlja [12]. Helicobacter spp pregled. Poznato je da bi mogli kolonizirati želudac proizvoditi velike količine citoplazmatski ureaze [32] brzi ureaza testom koji se koristi u ovom istraživanju, Pyloritek ®, otkriva aktivnost ureaze uzorka tkiva za proizvodnju amonijaka, kada urea prisutna. To je opsežno koristi u ljudskoj praksi za otkrivanje gastritis uzrokovan bakterijom Helicobacter spp Netlogu. Pozitivne i negativne prediktivne vrijednosti su između 98.1-100% i 95.8-100%, odnosno u istraživanju testiranje ljudskih pacijenata prije i nakon iskorjenjivanja bakterija [33]. U ovom istraživanju, nisu pronađeni pozitivni testovi, što ukazuje da su biopsije u ovom istraživanju sadržavala nikakve bakterije s mogućnošću za proizvodnju ureaze.
Zaključci
želučane Helicobacter pregled spp. nije pronađen, a ne može se povezati s želuca lezije 36 konja analiziranih u ovom istraživanju. Patologija naći u ovoj studiji uključeni Polipoidne strukture, hiperplastične rugae i male erozije, ali bakterijska uključenost pronađen je u samo jednom slučaju erozije. U ovom lezije, An Escherichia nalik klon, najvjerojatnije E. fergusonii pregled, utvrđeno je unutarstanični. Da li je to bila primarna ili sekundarna infekcija ne može se zaključiti. Vrlo ograničene količine bakterija u cjelini pronađeni su u konjski žljezdanog područja kao što se očekivalo. Dakle, otkrivanje umjerena do velike količine bakterije na žljezdanog razini sluznice, te u kripti bi trebao biti razlog za zabrinutost, jer to ne činiti se biti normalan nalaz u konja žljezdanog želuca. Dodatne studije koje uključuju bakterije i odnos prema želučanih lezija konja s potvrđenih kliničkih znakova imaju jamstvo, kao što su ovi konji nisu bili uključeni u studiji. Pregled Metode
Konji i dizajn studije pregled Istraživanje je provedeno kao poprečni presjek studija želudaca iz populacije od 63 klaonica konja u Danskoj. Konji su odobreni od strane veterinarskog ovjeravanje kao zdravo za klanje. Konji su bili zapanjeni s zatočeništvu vijkom i uzeta je krv. Želudac, uključujući i 5 - 10 cm od distalnog jednjaka i 10 cm od proksimalnog duodenuma, uklonjen odmah nakon evisceraciju i otvoreni uzduž veće zakrivljenosti. Ingesta su uklonjeni, a ako je potrebno, sluznica nježno ispere sa minimalno vode iz slavine prije pregleda. Samo želuci s velikim lezijama u žljezdanog sluznice su uključeni, kao i sedam kontrolnih želudac bez bruto dokaza želučanih lezija.
Fibrožljezdani lezije su definirani kao sluznici koja ima abnormalni makroskopski izgled tj hyperaemic, povećana debljina, erozija i ulkusa , Anatomske pozicije lezija zamijećeni su: The cardia, corpus ili antralnom regiji (Sl. 6). Slika 6 anatomska područja želuca otvoreni uzduž veće zakrivljenosti. Ne-žljezdane regija ima bijeli pojavljuju epitela, dok je žljezdano regija nijanse crvene boje. Oni su odvojeni od Margo plicatus Netlogu. Tri uzorkovani regije uključuju: kardija kao malom prostoru strip odmah ispod i duž Margo plicatus Netlogu, corpus područje koje sadrži kiselinu, pepsinogen i sluzi koje luče žlijezde (tamno crvena) i antralnom regiji koja sadrži prvenstveno sluzi i gastrina koje luče žlijezde. pregled Uzorkovanje postupak pregled iz svake trbuh žljezdane lezije, tri uzorka tkiva, gdje su dobiveni od najvećih lezija (A, b, C), kao i tri u paru normalne uzoraka koji se pojavljuju tkiva (a, b, c) iz istog anatomska regija, ali na minimalnoj udaljenosti od najmanje 5 cm. A /a: mala, veličina biopsija (0,5 × 0,5 cm) uzorak sluznice dobiven za hitnu testiranje ureaze s Pyloritek ® testa prema proizvođača upute. Ispitivanja su pročitali nakon 60 minuta standardnog vremena i rezultati navedeno kao pozitivno ili negativno. Uzorci B /b: 3 × 3 cm uzorak tkiva puna debljina uključujući sluznice i submukozi dobiveni su za ribe i fiksirani u 10% puferiranom formalinu. . Nakon 24 sata fiksacije uzorci su prebačeni u 70% -tnom etanolu, paraffin-embedded, razdijeljen na 3 um i montirani na SuperFrost /Plus predmetnim stakalcima (Menzel-Glaser, Braunschweig Germany)
Uzorci C /c: a trećim parom tkiva uzorci za kloniranje i sekvencioniranje dobiven je i naglo smrznut se koristi suhi led (ako veličina lezija je dozvoljeno).
iz kontrolne želuca sedam bez makroskopskih oštećenja probavnog sustava, uzorci su a, b i c su uzeti iz normalnog pojavljuje sluznici antruma. Tri od tih konja dodatno uzorkovanje u cardia, korpusa i dvanaesnika te.
Postupci uzorkovanja održana je od kolovoza do listopada 2007. Povijesni podaci o prethodnoj zdravlje konja nije mogao dobiti. Pregled, Fluorescentna in situ hibridizacije bakterija
mikroba detekciju, sekcije tkiva su hibridizirani istovremeno sa dva 16S rRNA proba označenih s različitim fluorofora. Oligonukleotid sonda S-D-Bact-0338-a-A-18 Bakterije koje ciljaju (5'GCTGCCTCCCGTAGGAGT3 ') [34] je 5' označen s fluorescein izotiocijanatom i izotiocijanata derivata Cy3. Oligonukleotid sonda HEL717 ciljaju na Helicobacter rod (5'AGGTCGCCTTCGCAATGAGTA3 ') [35] je 5' označena izotiocijanata derivata Cy3. Za potvrđivanje rezultata kloniranja treću i četvrtu sondu, LC-gProt-1027-AA-17 (5'GCCTTCCCACATCGTTT3 ') ciljanje 23S rRNA od Gammaproteobacteria je 5' označena fluorescein izotiocijanat i probe SG-Enteroco-184 (5'CAAATCAAAACCATGCGG3 ') je Cy3 označeni ciljanje 16S rRNA Enterococcus spp pregled, [36]. Sve probe su sintetizirane na DNA tehnologije, Aarhus, Danska. Stakalca su deparafmizirani u ksilenu i prebačen u 100% alkohola 30 min prije hibridizacije. Hibridizacijskoj je provedeno na 45 ° C s 40 ml hibridizacijskog pufera (100 mM Tris [pH 7,2], 0,9 M NaCl, 0,1% natrijev dodecil sulfat) i 200 ng svakog sonde za 16 sati u Sequenza Slide Rack (Thermo Shandon, Cheshire, Velika Britanija). Uzorci su zatim isprane tri puta u ugrijane (45 ° C) za hibridizaciju puferu tijekom 15 minuta, te se na kraju tri puta u otopini ugrijana (45 ° C) za ispiranje (100 mM Tris [pH 7.2], 0.9 M NaCl). Uzorci su isprane vodom, osušen na zraku i stavljeni u Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) za epifluorescentnim mikroskopijom. Axioimager M1 epifluorescentnim mikroskop opremljen za epifluorescentnim sa 100-W HBO lampe i filter postavlja 43 i 38 su korišteni za vizualizaciju Cy3 i fluorescein, respektivno. Slike su dobivene primjenom AxioCam MRM Verzija 3 FireWiremonocrome fotoaparata i softvera AxioVision verziju 4.5 (Carl Zeiss, Oberkochen, Njemačka). Pregled Evaluacija epifluorescentnim mikroskopom izvršena je opis subjektivnog iznosa, morfološke pojave i položaja fluorescirajuće stanice očito u svakom uzorku tkiva. Osim toga, sve sekcije tkiva su obojene s H &E i vrednovati histopatološki pregled 16S rDNA pojačavanje i kloniranje
Nakon otkrivanja bakterija pomoću FISH, odabrani su pod uzorci iz konja pokazuju bakterije raznih morfologija za 16S rRNA gen. kloniranje. DNA je izolirana iz 4 uzoraka tkiva pomoću Easy-DNA kit (Invitrogen, Tastrup, Danska) u skladu s uputama proizvođača. 16S rRNA gen je primjenom primera SD-Bact-0008-AS-20 (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 '), [37] i S - * - Univ-1492-AA-19 (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') [38]. PCR biciklizam sastojala se od inicijalnog denaturacije na 94 ° C tijekom 6 min; zatim 30 ciklusa denaturacije na 94 ° C za 30 s, žarenja na 55 ° C tijekom 45 sekundi i ekstenzije na 72 ° C tijekom 2 minute; i finalna ekstenzija na 72 ° C tijekom 3 minute. Umnožena DNA je potvrđena je elektroforezom na agaroza gelovima. PCR produkti su pročišćeni korištenjem QIAquick PCR set za pročišćavanje kolona (Qiagen GmbH, Hilden, Njemačka). Stvaranje tupim DNA sljedeće se miješa u 0,5-ml epruvetu za mikrocentrifugu, 4 ul 5 × T4 DNA polimerazom pufera, 14,7 ul pročišćenog PCR proizvoda 0.8 ul dNTP (2.5 mmol l -1 svaki) i 0,5 ul (1.2 u) T4 DNA polimerazom (Invitrogen) i inkubira na 12 ° C tijekom 15 minuta. T4 DNA polimeraze toplinski inaktiviranog i tupim DNA je pročišćena korištenjem pribora za pročišćavanje stupce QIAquick PCR (Qiagen GmbH) i ispere se u konačnom volumenu od 10 ul redestilirane vode. Nakon opisa proizvođača Kloniranje je izvedeno pomoću Zero tup TOPO kloniranje (Invitrogen). Deset kolonije iz svake kloniranja su odabrani, sekvencirani na automatskom analizatoru sekvence (ABI PRISM 373 DNA Sequencer PE Biosystems, Foster City, CA, USA) upotrebom dvije standardne vektor klica (T3 i T7) uključene u komplet. Slijed je sastavljen u Bionumerics verziji 4.0 (Applied Math, Sint-Martens-Latem, Belgija) i provjerava himera i miniranja pojedine sekvence u GenBank http:.... //Www NCBI NLM NIH GOV i softverska šiljorepa patka verziji 1.1 http:... //www Cardiff ac Velika Britanija /biosi /istraživanja /Biosoft /. Filogenetskom analiza klonova koji pripadaju Escherichia pregled roda je učinjeno preuzimanjem 16S rRNA gena sekvence više od 1.200 bp iz RDP v.9 baze Escherichia pregled tipa opterećuje. Http: //RDP CME . msu. edu. Sekvence su podrezane na iste dužine 1327 bp i usklađen parovima (UPGMA), a zatim globalno poravnanje sekvenci. Konačna filogenetski Stablo je izgrađen korištenjem odjelu algoritam gdje Enterobacter sakazakii pregled (AB004746) se koristi kao outgroup. Pregled Izjave pregled Zahvale
Autori žele zahvaliti Hanne H. Møller, Katja Kristensen i Johanna Z Amenuvor za tehničku pomoć u laboratorijima. Također hvala Stina Vesterholm za pomaganje prikupljanje tkiva. Ovaj rad je podržan od strane Kongeriget Danmark je Horseinsurance g /s i Intervet Danskoj. Sponzori imao sudjelovanje u praktičnom dijelu ili zaključaka ove studije.
Autora originalne dostavljeni datoteke za slike
Ispod su linkovi na autora izvornika dostavljenih datoteka za slike. Izvorna datoteka za sliku 1 12866_2009_1040_MOESM2_ESM.tiff autora 12866_2009_1040_MOESM1_ESM.tiff autora izvorna datoteka za sliku 2 12866_2009_1040_MOESM3_ESM.pdf autorskim izvorne datoteke na Slici 3 12866_2009_1040_MOESM4_ESM.tiff autorskim izvorne datoteke za Slika 4 izvorne datoteke 12866_2009_1040_MOESM5_ESM.tiff pisaca za lik 5 izvorna datoteka 12866_2009_1040_MOESM6_ESM.jpeg autora za slici 6

• Uspostavljanje i identifikacija modelu zeca na peritonealnoj karcinomatoza iz želuca cancer
• NO-inducirane učinke pokretljivosti u želučanom fundusa i pylorus učinaka pokretljivosti NO induciranih sGCβ1his105phe mutant mice