Preizkus kopitarjev žleznega želodca lezij za bakterije, vključno s Helicobacter spp s fluorescentno in situ hybridisation

Pregled kopitarjev žleznega želodca lezij za bakterije, vključno s Helicobacter spp
ga fluorescence in situ
hibridizacije
Abstract
Ozadje
se je konjski žleznega želodca pogosto prizadeta zaradi erozije in razjede. Cilj te raziskave je bil ugotoviti, ali se lahko bakterije, vključno s Helicobacter, vključeni v etiologiji želodčnih žleznega lezij videli pri konjih.
Rezultati
želodec lezij, kot tudi običajni, ki se pojavljajo sluznice so bili pridobljeni s konji, zaklanih za za prehrano ljudi. Vse vzorce smo testirali na aktivnost ureaze uporabo Pyloritek ® testu, medtem ko je bil sluznice bakterije vsebine ocenili z metodo fluorescenčne in situ
hibridizacije. V izbranih podvzorcev, da bakterije, karakterizacija nadaljevala s kloniranjem in zaporedja. Sluznice lezije so bile ugotovljene v 36/63 želodcev in vključeni hiperplastični rugae, polypoid strukture in kontaktne erozij. Noben od vzorcev ni bil pozitiven na aktivnost ureaze ali FISH uporabo Helicobacter rod posebno sondo. V vzorcih lezij, kot tudi običajne vzorce, klone z 99% podobnosti Lactobacillus salivarius
in Sarcina bilo ugotovljeno ventriculi
. Escherichia
kot bakterije klonov in Enterococcus klonov so dokazali v eni goriščni erozije. Na podlagi filogenetske drevo ti kloni imeli 100% podobnost z Escherichia fergusonii in Enterococcus faecium
. Enterococcus bilo ugotovljeno, se naselijo v sluznice površino, medtem ko so bili E. fergusonii
organizmi dokazuje tudi intraepitelijska.
Zaključek
želodca Helicobacter spp. ni bilo mogoče preveriti, da je bila vpletena v lezij žleznega želodca konja. Ker je bila E. fergusonii
opisal kot nastajajoče patogena ljudi in živali, ugotovitve te bakterije v želodcu erozijskih nalogov za dodatno pojasnilo o tem, ali je v želodcu okužbo s to vrsto bakterije pomembno za konje.
Ozadje
Pri konjih, lezije ne-žleznega dela želodca so zelo razširjena in zdi se, da izpostavljenost čezmerno kisline [1] povzročila, malo je bilo opisano v zvezi s poškodbami v žleznega dela. Žarišča se nahajajo v žleznega regiji, so pokazali v 58% 162 hospitaliziranih konjev [2] in 47% 345 dirkalnimi [3], in medtem ko so vzrok teh ni prejela veliko pozornosti, izpostavljenost kislina ne zdi, da je glavni dejavnik , kot je bilo ugotovljeno med poškodb obeh regij v želodcu nobene povezave [3].
želodčnih bakterij kot vzrok za žleznega želodca poškodb so predlagali za številne živalske vrste in ljudi, ti predstavljajo pomemben dejavnik preveri tveganja. Želodca organizmi ugotovljeno, Helicobacter pylori
je bila opisana najbolj zaradi svoje patogeno potencialu induciranje kroničnih gastritisa, ulkusov, adenokarcinomov in sluznica povezan limfoidni tkivni (slad) limfoma pri ljudeh [4-6]. Bakterije iz tega rodu so v vzorcih želodčne tkiva najdemo tudi od živali, vključno s psi, prašiči, ovce in govedo [7-10].
V konja, nasprotne dokaze izhode, ali se pojavljajo bakterije, ki lahko specifično povzročijo želodčne poškodbe. Nekaj ​​študije so pokazale, da je v želodcu Helicobacter spp
. so prisotne v normalnem pojavlja sluznice s pomočjo PCR in imunokemija [11, 12], medtem ko so našli nobenih dokazov o povezavi med prisotnost poškodb in bakterij [13]. Kot so razjede želodca bakterijske vrste potrdijo ali predlagano kot del patogenezo določenih vrst želodca patologije pri ljudeh in drugih živalskih vrstah, je cilj te študije za oceno, če bi se bakterije vpleten v patologiji opaziti v konjskega žleznega želodca. Glavni poudarek je bil zagotoviti več dokazov o prisotnosti in lokalizacije bakterij na splošno na ravni sluznice kopitarjev žleznega želodca. Poseben poudarek je bil namenjen pridobivanju informacij o prisotnosti in vključitvijo katere koli Helicobacter vrste
v lezij na sluznicah. Fluorescence in situ
hibridizacije (FISH) tehnika je bila uporabljena za ta namen, ki omogoča uporabo rRNA-ciljnih sonde za tako celotne populacije bakterij in opredeljenih rodu /vrst. Ta pristop omogoča določitev bakterij morfologije, številčnosti in lokacijo v tkivih, in tudi navedbe o stopnjah rasti in fiziološke dejavnosti [14].
Rezultati
Bruto žleznih lezije so opazili pri 36 od 63 želodcev pregledanih (57,1 %). Večina poškodb je bilo razvidno iz antruma regiji (91,7%). V šestih želodcev, so žarišča dodatno ali izključno videli v Cardia ali corpus regiji. Ni lezije so našli v dvanajstniku
Poškodbe so bile razvrščene v tri skupine, kot so:. Polypous (2 želodcev z polypoid mase, ki se nahajajo tako v Kardije in antruma z velikostmi med 1 in 5 cm v premeru), ii: hiperplastični rugae lezije (13 želodci) ali III:. Hyperaemic, erozivni ali ulceroznim lezije, ki so bili opaženi v 21 želodcev
hiperplastični rugae so vsi videli v antruma in je bil od imajo intenzivno hiperemija z izcedek, da rugae z običajno pojavljajo sluznice površino. Bruto debeljenje antruma rugae je posledica predvsem hiperplazija želodčni foveolae primerjavi z ustreznim normalnih vzorcev. Preostali lezije so bile vse ugotovljeno, da so majhne samotnih lezije ne več kot približno 1 x 2 cm velikosti. Kontaktne površine erozijski gastritis so najpogostejše ugotovitve teh poškodb tipa in je označen kot levitev od površinskih celic luminalno epitela s hkratno fibrinopurulent izcedek, luminalno celičnega drobirja in pretežno mononuklearnih celic infiltrat v lamine proprie. najdemo v 9 želodcih globlje erozije zmanjšala tako na območju želodca jame in delov žlez, ki je bil opažen s gastritis le na takojšnje tkiv. Eden Res razjeda bilo ugotovljeno razteza popolno debelino lamele proprie, izpostavljanje plast muscularis v lumen. Ugotovljeno je bilo največ dveh lezij v vsakem od teh želodcev.
Helicobacter in aktivnost ureaze preizkus
S posebno sondo rodu Helicobacter ni pozitivni signali so našli v katerem koli od vzorcev 79 tkiva (36 parnih vzorcih in 7 kontrol) . V soglasju s temi rezultati FISH, nobena od testiranih vzorcev pozitiven aktivnost ureaze niti. Notranje kontrole vseh testih ureaze bili najdeni pozitivni kot indikacijo funkcionalnega testnega kompleta.
Bakterij v splošnem
Na splošno so v obeh poškodovanih kot pri zdravem želodcu opažene le malo bakterije povezano s površino sluznice vzorci. Na splošno bi lahko štiri morfološke različne vrste bakterijskih celic se vizualizirajo s sondo eubacteria: 1) majhne, ​​kratke (0,2-0,5 um) kokoidne palice, 2), različne palice (1 × 3 pm), 3) dolgo priklenjen palice (do 60 mikrometrov) ali 4), veliki (3/2 premera mikrometrov) kokoidne bakterije jasno delitvijo v parih. Značilno je, če je prisoten, so opazili bakterije v grozdih, ki so povezani z posamičnih delcev, ali se nahajajo v bližini površino sluznice
Znaki bakterijske gastritis je bil najden v enem želodcu lezije skrajno značilen kot samotni erozijo, 1 x 2 cm v velikosti, pri čemer središče hyperaemic in obdan z proliferativne epitelnega platišča (sl. 1). Mikroskopsko, goriščna erozije sluznice s vlažnost eritrocitov in levkocitov, predvsem nevtrofilnih izvora opazili. Med izločki so dodatno razvidno iz želodca jame. Celični vnetna reakcija s mononuklearnih celic smo opazili razširitev tako globoko kot v lamine muscularis. Površina vneto sluznico in želodca jam niso bili najdeni močno kolonizirali kokoidne s kratkimi palice uporabi sonde za splošne bakterije (Fig. 2). Posebej so opazili kratke palice infiltracije erozijo. Opazili so jih tudi intracelularnega v epitelijskih celic, kot tudi v nevtrofilnih granulocitih. Bakterijska kolonizacija želodcu bila omejena na lezije kot niso bili bakterije opazili v ustreznem zdravem sluznice vzorcu. Slika 1 goriščne erozijski lezije (bela puščica), ki dokazuje, bakterijski gastritis na histološko vrednotenja. Lezija je približno 2 x 2 cm in se nahaja v antruma bližini pilorično vhoda.
Slika 2 želodčne sluznice z erozijski gastritis, povezane z bakterijami. Površina sluznice in ob celični naplavin močno kolonizirajo bakterije (rdeča). Nekaj ​​bakterije so vidne znotraj celic v nepoškodovanem epitela (puščico), kot tudi v degeneriranih in odmrlih epitelnih celic (puščica). Poleg tega so bakterije najdemo v granulocitih. Fluorescentne in situ hibridizacije s sondo ciljanje Bakterije, nastavljen filter 43, bar = 25 um.
Kloniranje in zaporedje
Na osnovi morfologije in intenzivnosti bakterij dokazanih uporabo FISH, so bili izbrani podvzorcev o /c vzorcev C za kloniranje in zaporedja predstavljajo vzorce, vključno s tistim z bakterijsko gastritis.
od izbranih laboratorijske vzorce po želodci, ki ponazarjajo različne bakterije morfologijo, sta bili dve različni vrsti klonov najdemo v običajnih pojavljajo vzorcev sluznice (vzorci c), je imel en klon 99% podobnost za Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AB370881) in druge vrste klonov je bilo 99% podobnost z Sarcina ventriculi
DSM 316 (X76650).
od poškodb (vzorec C), so kloni najti tudi z 99 % podobnost z Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AF182725). Od sluznice z bakterijsko gastritis, štirje od desetih klonov ujemajo 100% Enterococcus faecium
, medtem ko je preostalih šest kloni (dobimo zaporedje deponirajo pri GenBank s pristopom št. GQ423062) pripadal k Escherichia kot
bakterije. Filogenetsko drevo je bil zgrajen s šestimi Escherichia
kot klonov iz okuženega in vsi so imeli 100% podobnost s sevi tipa tako E. fergusonii
in Shigella flexneri
(slika 3). Uporaba gama proteobacteria posebno sondo kratke palice infiltracije epitel, pa tudi našel intracelularni v nevtrofilnih granulocitov, so bili preverjeni kot Escherichia
kot bakterija, medtem ko so bile ugotovljene Enterococcus faecium
organizmi, ki se naselijo v epitelne površine s posebno sondo Enterococcus (slika 4 in 5). Slika 3 filogenetsko drevo 16S rRNA gena podobnost zaporedja, ki prikazuje položaj šestih klonov, ki pripadajo Gammaproteobacteria najdemo v Horse 50L in najtesneje povezanih sevov vrste, ki pripadajo Escherichia rodu. Šest kloni (acc.no. GQ423062) je imela 100% podobnosti Shigella flexneri
in E. fergusonii
. Sakazakii (AB004746) je bila uporabljena kot outgroup. številke zaporedje pristopna so predstavljene.
Slika 4 želodčne sluznice konjskih 50L z erozijski gastritis, povezane z bakterijami. Uporaba fluoresceinsko označeno sondo za Gammaproteobacteria in Cy3 označeno sondo za Enterococcus, E. coli
kot organizem (zelena) (puščico) je bilo ugotovljeno, intracelularni v epitelnih celic in na epitelijske površini, medtem ko E. faecium (rdeča) ( " bela zvezda "(kolonizirali samo epitelne površine. Filter nastavite 43/38, bar = 10 um.
Slika 5 želodčne sluznice konjskih 50L z erozijski gastritis, povezanega z bakterijami. Visoka povečava dokazuje E. coli
kot palice ( zelena) v ekstrudiranih epitelnih celic. fluorescentna in situ hibridizacije s sondo ciljanje Gammaproteobacteria, nastavljen filter 38, bar = 10 um.
Razprava
Prejšnje študije, ki vključuje konja želodec npr uporabili PCR ciljanje 16S rRNK gen posebej Helicobacter
spp. [12]. slabosti z uporabo PCR so, da se količina in lokacija bakterij ni znan in ni jasno, ali so bakterije živa ali celo če DNK je nag. Zato se je odločila, da bo s pomočjo FISH tehnike zagotoviti boljše in več informacij o bakterije najdemo v žleznega želodca konja, saj so ta vprašanja rešili s to tehniko. Ta tehnika je bil prej uporabljen za opis prostorske porazdelitve Helicobacter
spp. v prebavnem traktu psov in v želodcu zdravih konj za dokazovanje mikroorganizme normalne pojavlja ploščatega in žleznega sluznice [15, 16]. Kolikor nam je znano, je to prva študija z uporabo FISH preučiti lezij žleznega želodca.
V tej študiji enem primeru gastritis, povezanega z bakterijsko kolonizacijo je bila razkrita. Predvsem razporeditev bakterij predlagal povezavo s patologijo opazimo. Količina bakterij se je izrazito povečalo po lezije in so tesno držale epitelijskih celic z bakterijami, ki se raztezajo v grobnicah in se nahaja znotrajceličnih. Kloniranje je pokazala, da je šlo za dvojno okužbo z Enterococcus faecium
in Escherichia
kot bakterije, vendar je bilo naknadno preveri z uporabo in situ
hibridizacije z gama proteobacteria sonda, ki je bila le Escherichia
kot bakterija, ki je prepojena površinske razjede in je bilo ugotovljeno, intracelularni v epitelijskih celic in v nevtrofilnih granulocitov. Enterobacterial okužba v črevesju je pogost pojav, vendar je redko najti teh okužb v želodcu in je nikoli so poročali pri odraslih konjih. Ta rezultat je zelo zanimiva, vendar nadaljnje študije, je treba pojasniti, kako pogosta je ta pojav pri konjih. Prav tako, ali je ta vrsta okužbe primarnega ali sekundarnega izvora, bi bilo treba dodatno pojasniti. Escherichia
kot klonov vse je imel 100% 16S rRNK genov podobnosti tako E. fergusonii
in Shigella flexneri
. Tako je v tej študiji ni mogoče precised eksperimentalno katera od teh dveh organizmov, ki so bili prisotni v tem žleznega lezije. Vendar pa so poročali, da je edini naravni gostitelj za ljudi Shigella
[17], ker je bil E. fergusonii
povezana s široko paleto črevesnih in ekstra-črevesnih okužb pri ljudeh in živalih, vključno s konji [18 19]. Zato je zelo verjetno, da je Escherichia
kot bakterija najti v tej študiji pripada E. fergusonii
. Študije so poročali E. fergusonii
kot nastajajoče patogena in je povezano s še posebej bakteriemijo in okužba ran vendar natančno vlogo pri okužbah pri ljudeh in živalih še vedno ni pojasnjen [20].
Microbiology v vzorcih
okolje v žleznega želodca je na splošno zelo sovražno proti mikrobom [21]. Ugotovljeno je, da konji so za razliko od ljudi in psov, ki so obrokov hranilnice proizvajalci stalno kisla, verjetno zaradi nenehnega vzorec hranjenja [22, 23]. PH v ventralni del konjskega trebuha je stabilen pri okoli pH 1-3 celotnem 24-urnem obdobju [24], zato relativno nizka raznolikost bakterij opazili v vzorcih sluznice v tej študiji ni bila nepričakovana.
Značilnost morfološka fenotip velikih koki raste v rednih tetrad je bila ustanovljena, da je klon z 99% podobnosti Sarcina ventriculi
. Ta organizem je znano, da lahko rastejo v želodcu in ima značilno TETRADE konstrukcijo, ko je zrasla iz pH 1- pH 3 [25]. V sedanjem študiji ni bilo mogoče določiti ugotovitev teh organizmov del koli posebne patologije, kot je bilo ugotovljeno v majhnem številu v parnih vzorcih (tj lezij in normalnih), kot tudi v kontrolnih vzorcev. Sarcina, kot so bakterije, so na voljo v različnih vrst, če so bili ti naj bi povzročil abomasal napihnjeno, krvavitev in razjede v jagnjeta in kozličke koz [26, 27] ter morebitna povezava do želodca dilatacijo pri psih in konjih je tudi je predlagal [28]. je z mikroskopom opazili nobenih dokazov o plinskih akumulacij v katerem koli od teh konjev in zato se ne zdi, da je prisotnost Sarcina ventriculi
prispeval k patologiji pri teh konjih.
ni bilo presenetljivo, da Lactobacillus (Lactobacillus salivarius
) je bilo ugotovljeno v proučevanih tkivih in je bilo že poročali, da je več Lactobacillus
spp., vključno z L. salivarius
, prisotna pri zdravih konjih [16, 29]. Proksimalna konj želodcu deluje kot skladiščenje za krmo, kot tudi predela za želodčne fermentacijo. Ekosistem v tej regiji, je sestavljen tako anaerobnih in-laktata uporabo bakterij v velikem številu, ki so odgovorni za povečanje hlapnih maščobnih kislin ob fermentaciji ogljikovih hidratov [30]. Še posebej je bilo ugotovljeno, Laktobacili držita epitela v proksimalnem delu konjskega trebuha [31] in temi bakterijami verjetno preide žleznega želodca kot del normalnega premene. Pregledali smo le laboratorijske vzorce in še več bakterij taksonov je mogoče najti v zdravi del žleznega želodca, če je bilo narejeno bolj celovito študijo mikrobiota skupnost.
Veljavnost ugotovitev Helicobacter
Nič vzorcev tkiva iz antruma regija je pokazala pozitivne signale iz Helicobacter spp
. sonda v tej študiji niso opazili spiralne oblike bakterij pomočjo FISH tehniko niti. V nedavni študiji iz Venezuele, so poročali spiralne oblike bakterije v biopsije iz srca regije konjskega trebuha obarvane z Warthin-Starry madež [12]. Helicobacter spp
. Znano je, da se lahko naselijo želodec proizvaja velike količine citoplazemske ureaze [32] hitri test sečnine, ki se uporablja v tej preiskavi, Pyloritek ®, zazna aktivnosti sečnine v vzorcu tkiva s proizvodnjo amoniaka, ko je sečnina prisotna. To je v veliki meri uporablja v človeški praksi za odkrivanje gastritis s Helicobacter spp
povzročil. Pozitivne in negativne napovedne vrednosti so bile med 98.1-100% in 95.8-100%, oziroma v študiji preizkušanje človeške bolnikov pred in po izkoreninjenje bakterije [33]. V tej študiji je bilo pozitivnih testov ugotovljeno, kar pomeni, da biopsije v tej študiji ni vsebovala bakterij s sposobnostjo za proizvodnjo ureaze.
Sklepe
želodca s Helicobacter
spp. ni bilo mogoče najti in jih ni mogoče povezati z želodcem lezij 36 konjev analiziranih v tej študiji. Patologija najti v tej študiji, so polypoid strukture, hiperplastični rugae in majhnih erozij, vendar bakterijski sodelovanje je bilo samo v enem primeru erozije. V tem lezijo, Escherichia podoben klon, najverjetneje E. fergusonii
je bilo ugotovljeno, intracelularni. Ali je to primarni ali sekundarni okužba ni bilo mogoče ugotoviti. Zelo omejene količine bakterij na splošno so našli v konjski žleznega regiji kot je bilo pričakovano. Tako naj bi odkrivanje zmerno velikih količin morebitnih bakterij na žleznega ravni sluznice, kot tudi v grobnicah lahko zaskrbljujoče to ne zdi, da je normalno ugotovitev v konjskega žleznega želodca. Nadaljnje študije, ki vključujejo bakterije in odnos do želodca poškodb konjev s potrjenimi kliničnimi znaki so upravičena, ker ti konji niso bili vključeni v trenutne študije.
Metode
Konji in oblikovanje študija
študija je bila izvedena kot presečna študija želodcev iz populacije 63 klavnic konj na Danskem. Konji so bili potrjeni na Veterinarske uprave kot zdravo za zakol. Konji so bile omamljene s klinom in exsanguinated. Želodec, vključno s 5 - 10 cm od distalnega požiralnika in 10 cm proksimalnem dvanajstnika, odstranimo takoj po evisceraciji in odpre vzdolž večje ukrivljenosti. Ingesta smo odstranili in če je potrebno, je sluznica rahlo splaknemo z minimalno količino vode iz pipe pred pregleda. so bili vključeni le želodci s hujšimi poškodbami v žleznega sluznice, kot tudi sedem nadzornih želodcev brez bruto dokazov želodca lezij.
žleznega lezije so bile opredeljene kot sluznico, ki ima nenormalno makroskopski videz tj hyperaemic, povečane debeline, erozije ali razjede . Opažene so bile anatomskih položajev poškodb, kot so: Cardia, corpus ali antruma regijo (. Slika 6). Slika 6 anatomske regije želodcu odpre vzdolž večje ukrivljenosti. Ne-žleznega regija ima belo pojavlja epitelij, medtem ko je žlezno regija odtenki rdeče. Ti se razlikujejo po Margo plicatus
. Tri vzorčene regije vključujejo: Cardia kot majhno površino traku tik pod in ob Margo plicatus
, corpus regiji, ki vsebujejo kisline, pepsinogen in sluz izločajo žleze (temno rdeča) in antruma regije, ki vsebuje Primarno sluz in gastrina izločajo žleze. postopek
vzorčenja
iz vsake želodec s žleznega lezij tri vzorce tkiva kjer dobljeni največjega lezijo (A, b, c), kot tudi tri paru normalnih vzorcev prikazujejo tkiva (a, b, c) iz istega anatomski regiji, najmanj pa vsaj 5 cm stran. A /A: majhen, velikost biopsija (0,5 x 0,5 cm) sluznica vzorec smo dobili takojšnje testiranje sečnine s Pyloritek ® testu v skladu z navodili proizvajalca. Testi so bili po 60 minutni standardni čas brati in rezultati omeniti kot pozitivno ali negativno. Vzorci B /b: 3 x 3 cm polna debelina tkiva vzorec vključno s sluznico in submucosa so bili pridobljeni za ribe in je določeno v 10% zastalega formalinu. . Po 24 urah pritrdilnimi smo vzorce prenesenih 70% etanola, parafinski vgrajeni, prerezana na 3 mikrometrov in so nameščeni na SuperFrost /stroški diapozitive (Menzel-Glaser, Braunschweig Nemčija)
Vzorci C /c: tretji par tkiva vzorci za kloniranje in zaporedja Dobimo in hitro zmrznili s pomočjo suhega ledu (Če velikost lezije to dovoljeno).
od sedmih kontrolnih želodcev so brez makroskopskih želodčnih lezij, vzorci a, b in c so bili odvzeti iz običajnega pojavljajo sluznici izmed antruma. Tri od teh konj so bile dodatno vzorči v Cardia, korpus in dvanajstnika, kot tudi.
Postopki vzorčenja je potekala od avgusta do oktobra ni bilo mogoče pridobiti 2007. Zgodovinski podatki o prejšnjem zdravje konj.
Fluorescentna in situ hibridizacija za bakterije
za mikrobne odkrivanje, so odseki tkiva hkrati hibridizirali z dvema 16S rRNK sonde označene z različnimi fluorofori. Oligonukleotid sonda S-D-in duha-0338-a, A-18 Bakterije, ki ciljajo (5'GCTGCCTCCCGTAGGAGT3 ") [34] je bilo 5 'označeni s fluorescein izotiocianatom in izotiocianata izpeljanega Cy3. HEL717 oligonukleotid sonda ciljanje Helicobacter rod (5'AGGTCGCCTTCGCAATGAGTA3 ") [35] je bilo 5 'označeni z izotiocianata Cy3 izvedenih finančnih instrumentov. Da preverijo rezultate kloniranja tretji in četrti sondo, LC-gProt-1027-AA-17 (5'GCCTTCCCACATCGTTT3) ciljnih 23S rRNA iz Gammaproteobacteria je 5 'označeni z fluorescein izotiocianat in sonda SG-Enteroco-184 (5'CAAATCAAAACCATGCGG3 ") je bil Cy3 označeni ciljnih 16S rRNA Enterococcus
spp [36]. Vse sonde smo pripravili na DNA tehnologijo, Aarhusu na Danskem. Drsniki smo deparaffinized v ksilenu in prenesemo v 100% alkoholu 30 minut pred hibridizacije. Hibridizacijo je bila izvedena pri 45 ° C s 40 ml hibridizacije pufra (100 mM Tris [pH 7,2], 0,9 M NaCl 0,1% natrijev dodecil sulfat) in 200 ng vsake sonde za 16 ur v Sequenza Slide Rack (Thermo Shandon, Cheshire, Velika Britanija). Vzorce smo nato sprali trikrat segreta (45 ° C) hibridizacije pufru za 15 minut in nato tri krat v raztopini segreta (45 ° C), pralni (100 mM Tris [pH 7,2], 0,9 M NaCl). Vzorci so bili sprati z vodo, posušimo na zraku in nameščeni v Vectashield (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, ZDA) za epifluorescenčnim mikroskopom. Axioimager M1 epifluorescenčnim mikroskop opremljen za epifluorescenčnim s 100 W HBO svetilko in filtrom določa 43 in 38 so bili uporabljeni za vizualizacijo Cy3 in fluorescein oz. Slike so bili pridobljeni z uporabo AxioCam MRM različice 3 FireWiremonocrome kamero in različico programske opreme AxioVision 4.5 (Carl Zeiss, Oberkochen, Nemčija).
Ocena epifluorescenčnim mikroskopom je bila izvedena po opisu subjektivnega zneska, morfološke videzu in lokaciji fluorescentnih celic razvidno v vsakem vzorcu tkiva. Poleg tega so bili vsi oddelki tkiva obarvanih s H &E in ovrednotena histopathologically
16S rDNA ojačitev in kloniranje
Po odkritju bakterij, ki uporabljajo FISH, so bili izbrani sub vzorce konj, ki dokazujejo, bakterije različnih morfologij za 16S rRNA gena. kloniranje. DNA smo izolirali iz 4 vzorcev tkiva s pomočjo Enostavna DNA kit (Invitrogen, Tastrup, Danska) v skladu z navodili proizvajalca. Gen 16S rRNA smo pomnožili z uporabo začetnih oligonukleotidov SD-in duha-0008-AS-20 (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ") [37] in S - * - Univ-1492-AA-19 (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ') [38]. PCR kolesarjenje sestavljen iz začetne denaturacije pri 94 ° C za 6 minut; čemur sledi 30 ciklov denaturacijo pri 94 ° C za 30 sekund, žarjenje pri 55 ° C 45 sekund in podaljšanje pri 72 ° C za 2 min; in končno podaljšanje pri 72 ° C 3 minute. Amplified DNA je bila preverjena z elektroforezo na agaroznem gelu. PCR produkt smo očistili s pomočjo QIAquick PCR čiščenje kit stolpce (Qiagen GmbH, Hilden, Nemčija), v. Če želite ustvariti tope tipa DNA naslednje zmešamo z 0,5 ml mikrocentrifugirkah cevi, 4 xl 5 × T4 DNK polimerazo buffer, 14,7 xl očiščenega produkta PCR 0.8 xl dNTP (2,5 mmol l -1 vsak) in 0,5 ul (1,2 u) T4 DNK polimerazo (Invitrogen) in inkubirali pri 12 ° C za 15 minut. Polimeraza T4 DNK je bil toplotno inaktiviramo in topi tipa DNA smo očistili s pomočjo kolon za čiščenje komplet QIAquick PCR (Qiagen GmbH) in eluiran v končnem volumnu 10 ul dvojno destilirano vodo. Po opisih proizvajalca je kloniranje izvaja s pomočjo Zero topo topo kloniranje komplet (Invitrogen). Deset kolonije iz vsake kloniranja so pobrali in zaporedje na avtomatsko zaporedje analizator (ABI PRISM 373 DNA Sequencer, PE Biosystems, Foster City, CA, ZDA) z uporabo dveh standardnih vektorske začetnih oligonukleotidov (T3 in T7) v kompletu. Zaporedje je bil sestavljen v Bionumerics različici 4.0 (Applied Math, Sint-Martens-Latem, Belgija) in preveriti himere tako z peskanje posamezne sekvence v GenBank http:.... //Www NCBI NLM nih Gov in programske opreme Pintail različici 1.1 http:... //www cardiff ac uk /biosi /raziskave /Biosoft /. Filogenetske analize klonov, ki pripadajo Escherichia
rodu je bila izvedena s prenosom 16S rRNA genska zaporedja več kot 1200 bp iz podatkovne baze RDP V.9 vrste Escherichia
vrste sevov http: //. PRP CME . MSU. edu. Sekvence smo odrezani na isti dolžini 1327 bp in usklajena paroma (UPGMA), kateremu sledi globalno poravnavo zaporedij. Končno filogenetsko drevo, izdelane s pomočjo Ward algoritma, kjer je sakazakii
(AB004746), ki se uporablja kot outgroup.
Izjave
Zahvala
Avtorji se želijo zahvaliti Hanne H. Møller, Katja Kristensen in Johanna z Amenuvor za tehnično pomoč v laboratorijih. Tudi po zaslugi Stina Vesterholm za pomoč zbiranje tkiva. To delo je bilo podprto s Kongeriget Danmark je Horseinsurance g /s in Intervet Danskem. Sponzorji ni bila vpletena v praktičnem delu in sklepih te študije.
Avtorjev originalnih predloženi datoteke za slike
Spodaj so povezave do avtorjev prvotna predloženih spisov za slike. "Izvirno datoteko za sliko 1 12866_2009_1040_MOESM2_ESM.tiff avtorjev 12866_2009_1040_MOESM1_ESM.tiff avtorjev izvirna datoteka za prvotno datoteke za sliko 3 12866_2009_1040_MOESM4_ESM.tiff avtorjev Slika 2 12866_2009_1040_MOESM3_ESM.pdf avtorjev prvotne datoteke za sliko 4 prvotne datoteke 12866_2009_1040_MOESM5_ESM.tiff avtorjev za sliki 5 izvirna datoteka 12866_2009_1040_MOESM6_ESM.jpeg avtorjev na sliki 6

• Vzpostavitev in identifikacija modela zajec peritonealno karcinomatozo z rakom želodca
• NO-inducirane motilitete učinke želodčne fundusa in pilorus za sGCβ1his105phe mutant miši