Исследование конских железистых поражений желудка для бактерий, в том числе Helicobacter SPP по флуоресценции на месте гибридизации в

Исследование конских железистых поражений желудка для бактерий, в том числе Helicobacter SPP Ру по флюоресценции Ситу
гибридизация
Аннотация
Справочная
лошадиный железистого желудка в обычно страдают от эрозии и изъязвления. Цель данного исследования состояла в том, чтобы оценить, является ли бактерии, включая Helicobacter, могут быть вовлечены в этиологию желудочных железистых поражений видели у лошадей.
Результаты
Желудок поражений, а также нормальное появление слизистой оболочки были получены от лошадей, забитых на потребление человеком. Все образцы были испытаны на активность уреазы, используя Pyloritek ® анализа, в то время как через слизистую оболочку содержание бактерий оценивали с помощью флуоресцентной In Situ
гибридизация. В отобранных образцах подразделам, бактерии характеристика преследовалась далее клонирования и секвенирования. Слизистые поражения были обнаружены в желудках 36/63 и включал гиперпластический морщинками, полипоидные структур и координационных эрозий. Ни один из образцов не испытывали положительный результат на активность уреазы или FISH с использованием хеликобактера род специфический зонд. В образцах поражений, а также нормальных образцов, клонов с 99% сходства с Lactobacillus salivarius
и Sarcina были найдены желудочек
. Кишечная бактерия игры, как клоны и Enterococcus клонов были продемонстрированы в одной фокальной эрозии. На основе филогенетического дерева эти клоны имели 100% сходство с Escherichia fergusonii и Enterococcus faecium
. Enterococcus были найдены колонизирует поверхность слизистых оболочек, в то время как Е. fergusonii
организмы были продемонстрированы внутриэпителиальное.
Заключение
Желудочный Helicobacter SPP. не может быть проверено, как быть вовлеченным в поражении железистого желудка лошади. Так как Е. fergusonii
была описана как формирующейся возбудителя в обоих людей и животных, обнаружение этой бактерии в желудочном эрозии требует дальнейшего разъяснения ли важно для лошадей желудка инфекции с этим типом бактерии.
Фона <бр> У лошадей, поражения не-железистой части желудка широко распространены и, как представляется, вызваны чрезмерным воздействием кислоты [1], но мало было описано относительно повреждений в железистой части. Поражения, расположенные в железистой области были продемонстрированы в 58% из 162 госпитализированных лошадей [2] и в 47% из 345 скакунов в то время как причина они не получили большого внимания, кислоты облучение не кажется, основным фактором, [3] и , так как никакой корреляции между поражением двух областей желудка не было найдено [3].
желудочной бактерии в качестве причины для железистых поражений желудка были предложены для многих видов животных и в организме человека они представляют собой основной фактор риска проверяется. Желудочных организмов, обнаруженных, Helicobacter Pylori
описан наиболее из-за его патогенного потенциала индукции хронического гастрита, язвы, аденокарциномы и слизистая оболочка ассоциированной лимфоидной ткани (MALT) лимфома у человека [4-6]. Бактерии этого рода были также обнаружены в образцах тканей желудка у животных, включая собак, свиней, овец и крупного рогатого скота [7-10].
В лошади, противоречивые свидетельства относительно того, выходит ли бактерии, которые происходят конкретно может вызвать желудочное поражения. Несколько исследований показали, что желудочный Helicobacter SPP
. присутствуют в нормальной слизистой оболочке появляются с использованием ПЦР и иммунохимии [11, 12], в то время как другие не нашли никаких доказательств связи между наличием повреждений и бактерий [13]. В качестве желудочных видов бактерий были подтверждены или предложены в качестве части патогенез некоторых типов желудочной патологии у человека и других видов животных, целью данного исследования было оценить, если бактерии могут быть вовлечены в патологии, наблюдаемой в лошадиный железистого желудка. Основное внимание было предоставить больше доказательств относительно наличия и локализации бактерий в целом на уровне слизистой лошадиного железистого желудка. Особый акцент был сделан на получение информации о присутствии и при участии любого вида Helicobacter
в слизистой оболочке поражений. Флуоресценция на месте
гибридизация (FISH) метод был использован для этой цели, которая позволяет использовать рРНК целевых зондов как для общей популяции бактерий и определенных род /вид. Такой подход позволяет определить бактериальной морфологии, изобилия, место нахождения в тканях, и даже указания на темпы роста и физиологической активности [14].
Результаты
Валовые железистые поражения были замечены в 36 из 63 исследованных желудков (57.1 %). Большинство поражений наблюдалось в области антрального (91,7%). В шести желудков, повреждения были дополнительно или исключительно видели в кардии или мозолистого области. Нет поражений не были найдены в двенадцатиперстной кишке
Повреждения были классифицированы по трем группам:. Полипозным (2 желудки с полиповидными, расположенных в обоих кардиального и антрального с размерами от 1 до 5 сантиметров в диаметре), II: Гиперпластический морщинки поражения (13 желудки) или III:. гиперемию, эрозивные или язвенные поражения, которые были замечены в 21 желудках
гиперплазированные морщинками были все видели в антральном и колебалась от необходимости интенсивной гиперемии с экссудатом к морщинками с нормально появляясь поверхности слизистой оболочки. Брутто утолщение антрального морщинками была вызвана в первую очередь гиперплазии foveolae желудка по сравнению с соответствующими нормальными образцами. Остальные повреждения были признаны небольшие одиночные поражения не более чем приблизительно 1 × 2 см в диаметре. Координационные участки эрозивного гастрита был наиболее распространенными результаты этих поражений типа и характеризуется как закручивание поверхностных клеток эпителия в просвете с одновременным фибринозно-гнойного экссудата, полостной клеточных остатков и преимущественно мононуклеарных клеток инфильтрата собственной пластинки. Более глубокие эрозий найдены в 9 желудках эродированных как область желудка ямы и части желез, которое наблюдалось при гастрите только непосредственных тканей. Одна истинная язва была обнаружена простирающийся полную толщину собственной пластинки, подвергая пластинки мышечной просвету. Максимум два поражения были найдены в каждом из этих желудков.
Хеликобактера и активность уреазы тест
с использованием специфического зонда рода Helicobacter никаких положительных сигналов не были обнаружены ни в одном из 79 образцов ткани (36 спаренных образцов и 7 контрольных) , В соответствии с этими результатами рыбы, ни один из образцов не дали положительный результат на активность уреазы либо. были признаны положительными, как указанием функционального тест-набора Внутренний контроль всех тестов уреазы.
бактерий в общем
В целом, только наблюдались родственный несколько бактерий к поверхности слизистой оболочки в обоих раненых, а также в здоровом желудке образцы. В целом, четыре морфологические различные типы бактериальных клеток могут быть визуализированы с эубактерий зондом: 1) малые, короткие (0,2-0,5 мкм) кокковидные стержни, 2) различных стержней (1 × 3 мкм), 3) длинноцепочечных стержней (до 60 мкм) или 4) большие (диаметр 2-3 мкм) кокковидные бактерии четко разделив в парах. Как правило, когда они присутствуют, были обнаружены бактерии в кластерах, связанных с частицами корма или расположены близко к поверхности слизистых оболочек
Доказательства бактериального гастрита был обнаружен в одном из желудка поражения грубо охарактеризовать как одиночную эрозии, 1 × 2 см в диаметре, в центре бытия гиперемированный и окружен пролиферативного эпителиального ободка (рис. 1). Микроскопически, очаговый эрозии слизистой оболочки с просачивание эритроцитов и лейкоцитов, в основном нейтрофильной происхождения, был замечен. Экссудата были дополнительно замечены в желудочных впадинах. Клеточная воспалительная реакция с одноядерных клеток наблюдалось расширение так глубоко, как в пластинкой мышечной. Поверхность воспаленной слизистой оболочки и в желудочных впадинах, были обнаружены сильно колонизирована коккоидный для коротких стержней применением зонда для общих бактерий (рис. 2). Короткие стержни были особенно наблюдается инфильтрация эрозии. Они также наблюдали внутриклеточно в эпителиальных клетках, а также в пределах нейтрофильных гранулоцитов. Бактериальная колонизация желудка ограничивается поражением, как никакие бактерии не были замечены в соответствующем образце здоровой слизистой оболочке. Рисунок 1 Focal эрозионное поражение (белая стрелка), демонстрирующую бактериальный гастрит при гистологической оценке. Поврежденное примерно 2 × 2 см, расположенный в антральном возле привратника входа.
Рисунок 2 слизистую оболочку желудка с эрозивный гастрит, связанный с бактериями. Поверхность слизистой оболочки и прилегающих клеточные обломки сильно колонизирована бактериями (красный). Несколько бактерий наблюдаются внутриклеточные в интактном эпителии (стрелки), а также в пределах вырожденными и некротизированных эпителиальных клеток (стрелка). Кроме того, бактерии найдены в гранулоциты. Флуоресцентные на месте гибридизации с зондом ориентации бактерий, набор фильтров 43, бар = мкм.
Клонирование и секвенирование
На основе морфологии и интенсивности бактерий продемонстрированы с использованием FISH, были выбраны 25 подвыборки образцов C /C для клонирование и секвенирование представляющих образцы в том числе и с бактериальным гастритом.
из выбранных подвыборок желудков, демонстрирующих различные бактерии морфологию, два различных типа клонов были обнаружены в образцах нормальных, появляющихся слизистая оболочка (с образцами), один клон имел 99% сходство к Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AB370881), а также другого типа клонов имели 99% сходство с Sarcina желудочек
DSM 316 (X76650). продажу из поражений (образцы с), клоны были также найдены с 99 % сходство с Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AF182725). Из слизистой оболочки с бактериальной гастрита, четыре из десяти клонов соответствует 100% Enterococcus faecium
, а остальные шесть клонов (полученные последовательности депонированы в GenBank с присоединением нет. GQ423062) принадлежал к роду Escherichia, как
бактерии. Филогенетического дерева был построен с шестью кишечная
как клоны от поражения и все имели 100% сходство с штаммов типа обоих E. fergusonii
и Shigella Флекснера
(рис 3). Применение гамма-протеобактериям специфический зонд короткие стержни пропитывая эпителий, а также найденный внутриклеточный внутри нейтрофильных гранулоцитов, были верифицированы как кишечная
как бактерии в то время как Enterococcus faecium
организмы были идентифицированы колонизировать эпителиальной поверхности с помощью специфического зонда Enterococcus (фиг.4 и 5). Рисунок 3 филогенетического дерева 16S-рРНК последовательности гена подобия, показывающий положение шести клонов, принадлежащих к Gammaproteobacteria найти в лошадей 50L и наиболее тесно связанных штаммов типа, принадлежащих к роду Escherichia. Шесть клонов (acc.no. GQ423062) имели 100% сходство с Shigella Флекснера
и E. fergusonii
. Enterobacter sakazakii (AB004746) использовали в качестве аутгруппе. представлены номера последовательности присоединения к ней.
Рисунок 4 слизистую оболочку желудка лошади 50L с эрозивный гастрит, связанный с бактериями. Применение флуоресцеина меченый зонд для Gammaproteobacteria и Су3 меченый зонд для Enterococcus, кишечной палочки игры, как организм (зеленый) (стрелки) был найден внутриклеточные в эпителиальных клетках и на эпителиальной поверхности, тогда как Е. faecium (красный) ( ' белая звезда '(только колонизировали эпителиальной поверхности. Фильтр устанавливается 43/38, бар = 10 мкм. Рисунок 5
слизистую оболочку желудка лошади 50L с эрозивный гастрит, связанный с бактериями. Высокое увеличение демонстрации кишечной палочки
как стержни ( зеленый) в экструдированных эпителиальных клеток. Флуоресцентные на месте гибридизации с зондом ориентации Gammaproteobacteria в, набор фильтров 38, бар = 10 мкм.
Обсуждение
Предыдущие исследования с участием лошадиного желудка есть, например, использовали ПЦР ориентации гена 16S рРНК особенно хеликобактер
SPP. [12]. к недостаткам с помощью ПЦР, что количество и расположение бактерий не известно, и нет уверенности в том, что бактерии живы, или даже если ДНК обнажена. Таким образом, было решено, что с помощью метода FISH позволит повысить качество и больше информации бактерий, найденных в железистого желудка лошади, так как эти вопросы будут преодолены с этой техникой. Этот метод был использован ранее для описания пространственного распределения Helicobacter
SPP. в желудочно-кишечном тракте собак и в желудке здоровых лошадей, чтобы продемонстрировать микробиоты нормального появления плоскоклеточной и железистой слизистой оболочки [15, 16]. Насколько нам известно, это первое исследование с использованием FISH для изучения поражений железистого желудка.
В настоящем исследовании одного случая гастрита, связанного с бактериальной колонизацией было выявлено. Особенно распределение бактерий предложили связи с патологией, наблюдаемой. Количество бактерий значительно увеличивалась вокруг очага поражения и были плотно прилипают к эпителиальным клеткам, с бактериями, проходящими в криптах и ​​расположенных внутриклеточно. Клонирование показал, что это была двойная инфекция с Enterococcus faecium
и кишечная
как бактерии, но впоследствии она была проверена с использованием Ситу
гибридизация с помощью гамма-протеобактерий в зонд, что это было только кишечная <бр> как бактерии, которая проникла в поверхностные изъязвления и были обнаружены внутриклеточные в эпителиальных клетках и в пределах нейтрофильных гранулоцитов. Энтеробактерий инфекция в кишечнике является обычным явлением, но это редко, чтобы найти эти инфекции в желудке, и он никогда раньше не было зарегистрировано у взрослых лошадей. Этот результат очень интригующим, но дальнейшие исследования необходимо выяснить, насколько часто это явление у лошадей. Кроме того, является ли этот тип инфекции является первичной или вторичной происхождения требует дальнейшего уточнения. Кишечная
как клоны все имели 100% 16S рРНК генов сходство как E. fergusonii
и шигеллы Флекснера
. Таким образом, в данном исследовании, он не может быть экспериментально уточнено, какой из этих двух организмов, которые присутствовали в этом железистой поражения. Тем не менее, люди были зарегистрированы, чтобы быть единственным естественным хозяином для Shigella
[17], тогда как Е. fergusonii
была связана с широким спектром кишечных и экстра-кишечных инфекций у человека и животных, включая лошадей [18 , 19]. Поэтому наиболее вероятно, что кишечная бактерия
как нашли в этом исследовании принадлежит Е. fergusonii
. Исследования сообщили E. fergusonii
в качестве нового патогена и связанный с особенно бактериемии и раневая инфекция, но его точная роль в инфекциях у людей и животных до сих пор не выяснены [20].
Микробиология в образцах <бр> Окружающая среда в железистого желудка, как правило, очень враждебна микробов [21]. Хорошо известно, что, в отличие от людей и собак, которые являются шрот питатели, лошади являются производители непрерывные кислоты, вероятно, связано с непрерывной картины кормления [22, 23]. Значение рН в вентральной части лошадиного желудка стабилен при рН около 1-3 в течение всего 24-часового периода [24], следовательно, относительное низкое разнообразие бактерий, наблюдаемых в образцах слизистых оболочек в данном исследовании не было неожиданным.
Характеристика морфологическое фенотип большого кокки растущего в регулярных тетрад был создан, чтобы быть клоном с 99% сходства с Sarcina желудочек
. Этот организм, как известно, способны расти в содержимого желудка и имеет характерную структуру тетрады при выращивании от рН 1- рН 3 [25]. В настоящем исследовании, нахождение этих организмов не может быть установлено, чтобы быть частью какой-либо специфической патологии, так как они были обнаружены в небольших количествах в спаренных образцах (т.е. поражения и нормальных), а также в контрольных образцах. Sarcina-подобные бактерии были обнаружены в различных видах, где они, как предполагается, вызывают abomasal раздуваться, кровоизлияние и язвы в ягнят и козлят [26, 27] и возможная связь с желудочной дилатации как у собак и лошадей имеет также было высказано предположение [28]. Никаких доказательств скоплениями газа не наблюдалось макроскопически ни в одном из этих лошадей и, следовательно, она не кажется, что присутствие Sarcina желудочек
способствовали патологии, наблюдаемой в этих лошадей.
Не удивительно, что Lactobacillus (Lactobacillus salivarius
) был найден в исследованных тканях и ранее сообщалось, что несколько Lactobacillus
SPP., в том числе Л. salivarius
, присутствуют у здоровых лошадей [16, 29]. Проксимальные конские функции желудка в качестве хранилища для кормов, а также отсек для внутрижелудочной ферментации. Экосистемы в этом регионе включает в себя как анаэробные и лактата утилизирующих бактерий в больших количествах, которые ответственны за увеличение летучих жирных кислот при ферментации углеводов [30]. Особенно Лактобактерии были обнаружены придерживаясь эпителия в проксимальной части конской желудка [31], и эти бактерии, вероятно, перейти к железистого желудка, как часть нормального оборота. Мы исследовали только подвыборки и более бактериальных таксонов будут найдены в здоровой части железистого желудка, если более всестороннее исследование микробиоты сообщество было сделано.
Обоснованность выводов хеликобактером
Ни один из образцов ткани из антрального регион демонстрировал позитивные сигналы от Helicobacter SPP
. зонд в этом исследовании, и не спиральные бактерии не были отмечены с помощью техники рыб либо. В недавнем исследовании из Венесуэлы, спиральные бактерии были зарегистрированы в биопсий из сердца области лошадиного желудка окрашивали с Warthin-звездное пятно [12]. Хеликобактер SPP
. как известно, способны колонизировать желудок производить большое количество цитоплазмы уреазы [32] быстрого уреазного теста, используемого в данном исследовании, Pyloritek ®, обнаруживает активность уреазы образца ткани по производству аммиака, когда мочевина присутствует. Он широко используется в человеческой практике для выявления гастрита, вызванного Helicobacter SPP
. Положительные и отрицательные прогностического значения между 98.1-100% и 95.8-100%, соответственно, в исследовании тестирования больных людей до и после того, как эрадикации бактерии [33]. В этом исследовании, никаких положительных тестов не было обнаружено, что свидетельствует о том, что биопсию в настоящем исследовании не содержали бактерии со способностью производить уреазы.
Выводы
желудочной хеликобактером
SPP. не был найден и не может быть связана с поражениями желудка 36 лошадей, анализируемых в данном исследовании. Патологии нашли в этом исследовании, включали полипоидные структуры, гиперпластический морщинками и мелких эрозий, но участие бактериальной был найден только в одном случае эрозии. В этом поражении,-кишечная, как клон, скорее всего, E. fergusonii
, был найден внутриклеточный. Было ли это первичным или вторичным инфекция не может быть заключен. Очень ограниченные количества бактерий в целом были найдены в лошадиный железистой области, как и ожидалось. Таким образом, обнаружение умеренного до высокого количества любых бактерий на железистой уровне слизистых оболочек, а также в склепах должно быть причиной для беспокойства, так как это, кажется, не быть нормальным нахождение в лошадиный железистого желудка. Дальнейшие исследования с участием бактерий и отношение к желудочной поражениях лошадей с подтвержденными клиническими признаками являются оправданными, так как эти лошади не были включены в настоящем исследовании.
Методы
Лошади и дизайн исследования
Исследование проводилось как перекрестное исследование желудков от населения 63 скотобоен лошадей в Дании. Лошади были утверждены ветеринарной службы, как здоровый на убой. Лошади были ошеломлены с пленным болтом и обескровлены. Желудка, в том числе 5 - 10 см от дистального отдела пищевода и 10 см от проксимального двенадцатиперстной кишки, была удалена сразу же после потрошения и открыл вдоль большой кривизны. Рубца были удалены, и, при необходимости, слизистую оболочку тщательно промывают с минимальным количеством водопроводной воды перед осмотром. Только желудки с грубыми повреждениями в железистой слизистой оболочки были включены, а также семь желудки контроля, без грубой доказательств желудка поражений.
Железистые поражения были определены как слизистой оболочки, имеющей аномальное макроскопическое внешний вид т.е. гиперемию, увеличенной толщины, эрозий или язвы , Были отмечены анатомические позиции поражений, как: кардии, мозолистого или антрального области (. рис.6). Фигура 6 анатомических областей желудка открыты вдоль большой кривизны. Не-железистый область имеет белый появляющийся эпителий, в то время как железистая область оттенки красного. Они отделены друг от друга Margo plicatus
. Три выборочные регионы включают в себя: Cardia как небольшой площади полосы чуть ниже и вдоль Margo plicatus
, области мозолистого содержащей кислоты, пепсиногена и слизи, секретирующих желез (темно-красный) и области антрума, содержащей primarly слизь и гастрин секретирующих желез.
Отбор проб процедура
из каждого желудка с железистых поражений, три образца ткани, где полученные из крупнейших поражения (A, B, C), а также три парных нормальных образцов ткани появляются (а, б, в) из того же анатомической области, но, по крайней мере, по крайней мере, на 5 см расстояние. А /а: небольшая, размер биопсии (0,5 × 0,5 см) образец слизистая оболочка была получена для немедленного тестирования уреазы с Pyloritek ® анализа в соответствии с инструкциями производителей. Тесты считывали после 60-минутного стандартного времени и результаты отмечены как положительные или отрицательные. Образцы B /B: 3 × 3 см полная толщина образца ткань, включая слизистую оболочку и подслизистую были получены для рыб и фиксировали в 10% забуференном формалине. . Через 24 часа фиксации образцы переносили в 70% этанол, парафин, разрезали на 3 мкм и помещали на SuperFrost /плюс слайды (Мензель-Glaser, Брауншвейг, Германия)
Образцы C /C: третья пара ткани образцы для клонирования и секвенирования были получены и замораживали с помощью сухого льда (если размер повреждения разрешено его).
из семи желудках Блок управления без макроскопических желудочных поражений, образцы A, B и C были взяты из нормального появления слизистой Антрум. Три из этих лошадей были дополнительно отобранных в кардии, корпус и двенадцатиперстной кишки, а также.
Процедуры отбора проб проходила с августа по октябрь 2007 года Исторические данные относительно предыдущего здоровья лошадей не может быть получено.
Флуоресцентные In Situ Гибридизация для бактерий
для обнаружения микробного срезы ткани гибридизовали одновременно с двумя 16S рРНК зондов, меченных с различными флуорофоров. Олигонуклеотидный зонд S-D-BACT-0338-А-А-18, ориентированные бактерии (5'GCTGCCTCCCGTAGGAGT3 ') [34] был 5' метили флуоресцеина изотиоцианатом и с изотиоцианатом производной Су3. Олигонуклеотидный зонд HEL717 ориентации род хеликобактера (5'AGGTCGCCTTCGCAATGAGTA3 ') [35] был 5' помечены изотиоцианата производной Cy3. Для проверки результатов клонирования третий и четвертый зонд, LC-gProt-1027-Aa-17 (5'GCCTTCCCACATCGTTT3 ') ориентации 23S рРНК Gammaproteobacteria был 5' помечены флуоресцеинизотиоцианат и зонд SG-Enteroco-184 (5'CAAATCAAAACCATGCGG3 ') был Су3 маркированы ориентации 16S рРНК Enterococcus
SPP [36]. Все зонды были синтезированы на ДНК-технологии, Орхус, Дания. Срезы депарафинизировали в ксилоле и переносили в 100% спирте в течение 30 мин перед гибридизацией. Гибридизацию проводили при 45 ° С с 40 мл гибридизационного буфера (100 мМ Трис [рН 7,2], 0,9 М NaCl, 0,1% додецилсульфата натрия) и 200 нг каждого зонда в течение 16 часов в слайд-Rack Sequenza (Термо Шандон, Cheshire, UK). Затем образцы промывали три раза в подогретую (45 ° C) гибридизационного буфера в течение 15 мин и впоследствии трижды в предварительно нагретую (45 ° С) промывочного раствора (100 мМ Трис [рН 7,2], 0,9 М NaCl). Образцы промывают в воде, сушат на воздухе и смонтированный в Vectashield (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) для эпифлуоресцентной микроскопии. Эпифлуоресцентной микроскоп Axioimager M1 оборудован для эпифлуоресцентной с 100-Вт лампы HBO и наборов фильтров 43 и 38 были использованы для визуализации Су3 и флуоресцеина, соответственно. Изображения были получены с использованием AxioCam MRM версии 3 FireWiremonocrome камеры и программное обеспечение AxioVision версии 4.5 (Carl Zeiss, Оберкохен, Германия).
Оценка эпифлуоресцентной микроскопии была выполнена описания субъективной суммы, морфологического внешний вид и расположение флуоресцирующих клеток очевидно, в каждом образце ткани. Кроме того, все срезы ткани окрашивали H &Amp; E и оценивали гистологически
16S рДНК амплификации и клонированию
После обнаружения бактерий с использованием FISH, были выбраны суб образцы от лошадей, демонстрирующих бактерии различных морфологией для гена 16S рРНК. клонирование. ДНК выделяли из 4 образцов ткани с использованием набора Easy-ДНК (Invitrogen, Tåstrup, Дания) в соответствии с инструкциями изготовителя. Ген 16S рРНК амплифицировали с использованием праймеров SD-Bact-0008-AS-20 (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ') [37] и S - * - Univ-1492-Aa-19 (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') [38]. ПЦР велосипедного состояла из первоначальной денатурации при 94 ° С в течение 6 мин; затем 30 циклов денатурации при 94 ° С в течение 30 с, отжиг при 55 ° С в течение 45 с и удлинение при 72 ° С в течение 2 мин; и окончательное удлинение при 72 ° С в течение 3 мин. Амплифицированной ДНК была подтверждена с помощью электрофореза на агарозном геле. ПЦР-продукты очищали с использованием ПЦР QIAquick набора для очистки колонн (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). Для того, чтобы создать тупые концы ДНК следующий смешивали в 0,5 мл микроцентрифужных трубки, 4 мкл 5 × Т4 ДНК-полимеразы буфера, 14,7 мкл очищенного продукта ПЦР 0,8 мкл дНТФ (2,5 ммоль л -1 каждый) и 0,5 мкл (1,2 U) Т4 ДНК-полимеразы (Invitrogen) и инкубировали при 12 ° С в течение 15 мин. Т4 ДНК-полимеразы был инактивированной нагреванием, и тупые концы ДНК очищали с использованием набора для очистки колонн ПЦР QIAquick (Qiagen GmbH) и элюировали в конечном объеме 10 мкл бидистиллированной воды. После описания изготовителя клонирование осуществляли с помощью тупой TOPO Cloning Kit ноль (Invitrogen). Десять колоний из каждого клонирования были выбраны и секвенировали на автоматическом анализаторе последовательности (ABI PRISM 373 DNA Sequencer, PE Biosystems, Foster City, CA, USA) с помощью двух стандартных векторных праймеров (Т3 и Т7) входят в комплект поставки. Последовательность была собрана в Bionumerics версии 4.0 (прикладная математика, Синт-Мартенс-Латем, Бельгия) и проверены на химер и путем подрыва отдельных последовательностей в GenBank HTTP:.... //WWW NCBI NLM NIH гов и с помощью программного обеспечения шилохвость версии 1.1 HTTP:... //WWW кардифф AC UK /biosi /исследования /Биософт /. Филогенетический анализ клонов, принадлежащих к роду Escherichia
осуществлен путем загрузки 16S последовательности генов рРНК больше, чем 1200 пар оснований из RDP ст.9 базы данных Штамм Escherichia
типа штаммов HTTP: //. CME RDP . MSU. Edu. Последовательности были обрезаны на одинаковую длину 1327 пар оснований и выровнены попарно (UPGMA), а затем глобальной выравнивания последовательностей. Окончательное филогенетическое дерево было построено с использованием алгоритма Уорда, где Enterobacter sakazakii
(AB004746) использовали в качестве аутгруппе.
Заявления
Благодарности
Авторы выражают благодарность Ханне H. Мёллер, Katja Кристенсен и Йоханна Z Amenuvor для оказания технической помощи в лабораториях. Также благодаря Стина Vesterholm за помощь сбора тканей. Эта работа была поддержана Kongeriget Danmark в Horseinsurance г /с и Интервет Дании. Спонсоры не имели никакого участия в практической части или выводов данного исследования.
Авторов оригинальные представленные файлы для изображений изображения Ниже приведены ссылки на авторов оригинала, представленных файлов для изображений. "Исходный файл для фигурного 1 12866_2009_1040_MOESM2_ESM.tiff авторов 12866_2009_1040_MOESM1_ESM.tiff авторов исходного файла для" исходного файла для фигурного 3 12866_2009_1040_MOESM4_ESM.tiff Авторского Рисунок 2 12866_2009_1040_MOESM3_ESM.pdf Авторского исходного файла для фигурного 4 исходного файла 12866_2009_1040_MOESM5_ESM.tiff Авторского на рисунке 5 Исходный файл 12866_2009_1040_MOESM6_ESM.jpeg авторов на рисунке 6

• Создание и идентификация модели кролика перитонеального карциноматозом из желудка cancer
• NO-индуцированные двигательные эффекты в желудочном и привратника глазного дна из sGCβ1his105phe мутант mice