Tutkiminen hevosen rauhas mahan vauriot bakteereille, mukaan lukien Helicobacter spp fluoresenssilla in situ -hybridisaatiolla

Tutkiminen hevosen rauhas mahan vauriot bakteereille, mukaan lukien Helicobacter spp
fluoresenssilla in situ
hybridisaatio
tiivistelmä
tausta
hevosen rauhas mahassa yleisesti vaikuttavat eroosion ja haavaumia. Tutkimuksen tavoitteena oli arvioida, onko bakteerit, kuten Helicobacter, voisivat osallistua etiologiassa mahalaukun rauhas vaurioita nähty hevosia.
Tulokset
Vatsa vaurioita, sekä normaali esiintyvät limakalvo saatiin hevosta teurastettu ihmisravinnoksi. Kaikki näytteet testattiin ureaasi käyttäen Pyloritek ® määrityksessä, kun taas limakalvon bakteerien pitoisuus arvioitiin käyttämällä fluoresenssi in situ
-hybridisaatio. Valituilla sub näytteet, bakteerit luonnehdinta jatkettiin edelleen kloonaamalla ja sekvensoimalla. Limakalvovaurioita havaittiin 36/63 mahat ja mukana hyperplastic rugae, polypoid rakenteet ja polttoväli eroosiot. Mikään näytteistä positiivisiksi ureaasiaktiivisuuspitoisuudet tai FISH käyttämällä Helicobacter suvun erityinen koetin. Näytteissä leesioiden, sekä normaali näytteitä, kloonit 99% yhtäläisyyksiä Lactobacillus salivarius
ja Sarcina ventriculi
löytynyt. Escherichia
kuten bakteeri klooneja ja Enterococcus kloonit osoitettiin yhdessä polttoväli eroosiota. Perustuen fylogeneettistä puu näistä klooneista oli 100% samankaltaisuus Escherichia fergusonii ja Enterococcus faecium
. Enterococcus löytyivät pesiytyvät limakalvon pinnalla, kun taas E. fergusonii
organismeja osoitettiin myös intraepiteliaalisten.
Päätelmä
Mahalaukun Helicobacter spp. ei voitu vahvistaa olevan osallisena vaurioiden rauhas mahan hevosen. Koska E. fergusonii
on kuvattu syntymässä taudinaiheuttajan sekä ihmisten että eläinten, havainto tämän bakteerin mahalaukun eroosio optio lisäselvitystä siitä mahainfektio tämäntyyppisellä bakteeri on tärkeä hevosille.
Background
hevosilla vaurioita ei-rauhas osassa mahalaukkua ovat erittäin yleisiä ja ne näyttävät johtua liiallisesta happoa altistus [1], mutta vähän on kuvattu koskien vaurioita rauhas osassa. Vauriot sijaitsee rauhas alueella osoitettiin 58% 162 sairaalahoitoon hevosten [2] ja 47% 345 kilpahevosten [3], ja vaikka syy näiden eivät ole saaneet paljon huomiota, hapan altistuminen ei näytä olevan ensisijainen tekijä , koska mitään korrelaatiota vaurioita näiden kahden alueen mahassa on todettu [3].
mahan bakteerit syynä rauhas mahan vauriot on ehdotettu usean eläinlajin ihmisillä nämä ovat merkittävä todentaa riskitekijä. Mahalaukun organismit löydetty, Helicobacter pylori
on kuvattu eniten johtuen sen patogeenisten potentiaalin asiakkuutta krooninen gastriitti, haavaumat, adenokarsinoomien ja limakalvon liittyvä imukudos (MALT) lymfooma ihmisillä [4-6]. Bakteerit Tämän suvun ovat myös löydetty mahalaukun kudosnäytteitä eläimistä kuten koirat, siat, lampaat ja naudat [7-10].
Kun hevonen, ristiriitaisia ​​todisteita poistuu siitä bakteereja, jotka nimenomaan voivat aiheuttaa mahalaukun vaurioita esiintyy. Muutamat tutkimukset ovat osoittaneet, että mahalaukun Helicobacter spp
. ovat läsnä normaalissa esiintyvät limakalvo käyttämällä PCR ja immunokemiassa [11, 12], kun taas toiset ovat löytäneet mitään todisteita välisen yhteyden läsnäolo vaurioiden ja bakteerien [13]. Koska mahan bakteerilajeja on vahvistettu tai ehdotettu osana patogeneesin tietyntyyppisten mahalaukun patologian ihmisissä ja muissa eläinlajeissa Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida, jos bakteerit voisivat olla mukana patologian havaittu hevosen rauhas vatsaan. Pääpaino oli antaa enemmän todisteita läsnäolo ja lokalisaation bakteerien yleensä limakalvolla tasolla hevosen rauhas vatsaan. Erityistä huomiota kiinnitettiin hankkimaan tietoja läsnäolo ja osallistuminen tahansa Helicobacter lajien
limakalvon haavaumia. Fluoresenssi in situ
hybridisaatio (FISH) tekniikkaa käytettiin tähän tarkoitukseen, joka mahdollistaa käytön rRNA kohdistetun koettimia sekä bakteerien kokonaismäärä väestöstä ja määritelty suku /laji. Tämä lähestymistapa on mahdollista määrittää bakteerien morfologian, runsaus, sijainti kudoksiin, ja jopa viitteitä kasvun ja fysiologisten toimintojen [14].
Tulokset
Gross rauhas vaurioita havaittiin 36 63 vatsat tutkittu (57,1 %). Suurin osa vaurioista nähtiin antrum alueella (91,7%). Kuudessa mahat, iholeesiot lisäksi tai yksinomaan nähty cardia tai corpus alueella. Ei vaurioita havaittiin pohjukaissuoleen.
Leesiot luokiteltiin kolmeen ryhmään: Polypous (2 vatsat polypoid massat sijaitsevat sekä cardia ja antrumiin koot välillä 1 ja 5 senttimetriä halkaisijaltaan), ii: Hyperplastista rugae leesioita (13 mahat) tai iii: Hyperaemic, erosive tai haavainen vaurioita, jotka havaittiin 21 vatsat.
hyperplastic rugae olivat kaikki nähtävissä antrumiin ja vaihteli ottaa intensiivistä hyperemia kanssa eritteen rugae kanssa terveistä limakalvon pintaan. Gross paksuuntuminen antrum rugae johtui pääasiassa hyperplasiaa mahan foveolae verrattuna vastaavaan normaaliin näytteitä. Jäljellä olevat leesiot olivat kaikki todettiin olevan pieni yksinäinen vaurioita ei ole enempää kuin noin 1 x 2 cm: n kokoisia. Painopisteitä syövyttävän gastriitti oli yleisin havainnot näistä leesioita ja luonnehtia sloughing pinnallinen solujen luminaaliselle epiteelin kanssa samanaikainen fibrinopurulent eritettä, luminaalisen solu roskat ja pääasiallisesti mononukleaaristen solujen infiltraatiota Lehtilavan propria. Syvempi eroosioita löytyy 9 mahat pienentänyt sekä alueen mahalaukun kuoppia ja osien rauhaset, joka havaittiin gastriitti vain välittömän kudoksiin. Yksi todellinen haavauma havaittiin ulottuu koko paksuuden lamina propria, paljastaen lamina muscularis onteloon. Enintään kaksi vaurioita havaittiin kussakin näistä mahat.
Helicobacter ja Ureaasiaktiivisuus test
käyttäminen suvun Helicobacter erityinen koetin mitään positiivista signaalia havaittu missään 79 kudosnäytteiden (36 pariksi näytteitä ja 7 ohjaa) . Kanssa nämä tulokset FISH yksikään näytettä oli ureaasiaktiviteettiin myöskään. Sisäinen valvonta kaikkien ureaasin testeissä havaittiin positiivinen osoitus funktionaalisen testipakkauksen.
Bakteerit yleensä
Yleensä vain harvat bakteerit havaittiin sukua limakalvon pinnalle niin loukkaantunut sekä tervettä vatsassa näytteet. Kaiken kaikkiaan neljä morfologiset erilaista bakteerisoluista voitiin visualisoida kanssa Eubacteria anturi: 1) pieni, lyhyt (0,2-0,5 pm) coccoid tangot, 2) erillistä sauvat (1 x 3 pm), 3) pitkäketjuiset sauvat (jopa 60 mikrometriä) tai 4) suuri (2-3 um halkaisijaltaan) coccoid bakteerien jakamista selkeällä pareittain. Tyypillisesti kun läsnä, bakteerien havaittiin klustereiden liittyvät rehuihin hiukkasia tai lähellä limakalvon pintaan
Todisteet bakteerien gastriitti löytyi yksi vatsassa leesion törkeän luonnehtia yksinäinen eroosio, 1 x 2 cm koossa, keskellä on hyperaemic ja ympäröi proliferatiivisen epiteelin vanteen (Fig. 1). Mikroskooppisen, polttoväli eroosio limakalvon tihkuu punasolujen ja valkosoluja, pääasiassa neutrofiilien alkuperää, nähtiin. Eritteiden oli lisäksi nähtävissä mahalaukun kuoppia. Matka- tulehdusreaktio yksitumasoluilla nähtiin ulottuvat niin syvälle kuin osaksi lamina muscularis. Pinta tulehtunut limakalvon ja mahalaukun kuoppia löytyivät raskaasti asuttaneet coccoid lyhyen sauvat soveltamalla koetin yleisten bakteerien (Fig. 2). Lyhyen sauvat erityisesti havaittu soluttautua eroosiota. Ne havaittiin myös solunsisäinen epiteelisoluissa, sekä sisällä neutrofiilisiä granulosyyttejä. Bakteerien asuttaminen mahan rajoitettiin vaurion ei bakteereja nähtiin vastaava terve limakalvo näyte. Kuva 1 Focal erosive vaurio (valkoinen nuoli) osoittamaan bakteerien gastriitti histologista arviointia. Leesio oli noin 2 x 2 cm ja sijaitsevat antrumiin lähellä mahanportin sisäänkäyntiä.
Kuvio 2 Mahalaukun limakalvon erosive gastriitti liittyvät bakteerit. Limakalvon pinnalle ja sen vieressä solujätteen on voimakasta pesäkkeiden bakteerien (punainen). Muutama bakteerit nähdään solunsisäisen ehjässä epiteelin (nuolenkärki) sekä sisällä rappeutunut ja nekroottinen epiteelisolujen (nuoli). Lisäksi bakteerit tavataan granulosyyttejä. Fluoresoiva in situ hybridisaatio koettimella kohdistamista bakteerit, suodatin asetettu 43, bar = 25 pm.
Kloonaus ja sekvensointi
pohjalta morfologiaan ja intensiteetti bakteerien osoitettu käyttämällä FISH, osanäytteitä C /C näytteet valittiin kloonaus ja sekvensointi edustaa näytettä, mukaan lukien yksi, jossa bakteerien gastriitti.
valitun osanäytteitä mahat, jotka osoittavat eri bakteerien morfologioita, kaksi erilaista kloonia löydettiin, normaaleissa esiintyvät limakalvon näytteet (c näytettä), yksi klooni oli 99%: n samankaltaisuus Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AB370881), ja toisen tyypin kloonien oli 99%: n samankaltaisuutta ja Sarcina ventriculi
DSM 316 (X76650).
alkaen leesioita (C näytteet), kloonit havaittiin myös 99 % samankaltaisuus Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AF182725). Vuodesta limakalvon bakteerin gastriitti, neljä kymmenestä kloonien Hyväksytty 100% Enterococcus faecium
, kun taas loput kuusi kloonia (saatu sekvenssi talletettu GenBank kanssa tulonumero. GQ423062) kuului Escherichia kuten
bakteeri. Fylogeneettinen puu on rakennettu kuuden Escherichia
kuten klooneja vaurio ja kaikki oli 100%: n samankaltaisuus tyypin kantoja sekä E. fergusonii
ja Shigella flexneri
(kuva 3). Hakeminen gamma proteobacteria erityinen koetin lyhyellä sauvat tunkeutuu epiteelin, sekä todettu solunsisäisen sisällä neutrofiilisia granulosyyttejä, todennettiin kuten Escherichia
kuten bakteeri taas Enterococcus faecium
organismeja tunnistettiin asettumaan epiteelin pintaan Enterococcus erityinen koetin (kuvio 4 ja 5). Kuvio 3 fylogeneettinen puu 16S rRNA-geenin sekvenssin samankaltaisuus, josta näkyy kuuden kloonien kuuluvat Gammaproteobacteria löytyy hevonen 50L ja kaikkein läheistä sukua tyypin kannat, jotka kuuluvat Escherichia-sukuun. Kuusi kloonia (acc.no. GQ423062) oli 100%: n samankaltaisuus ja Shigella flexneri
ja E. fergusonii
. Enterobacter sakazakii (AB004746) käytettiin outgroup. Sequence liittymistä numerot esittelyyn.
Kuva 4 Mahalaukun limakalvon hevosen 50L kanssa erosive gastriitti liittyvät bakteerit. Hakeminen fluoreseiinileimatut koetin Gammaproteobacteria ja Cy3 leimattua koetinta Enterococcus, E. coli
kuten organismi (vihreä) (nuolenkärki) havaittiin solunsisäisen sisällä epiteelisolujen ja epiteelin pintaan taas E. faecium (punainen) ( ' valkoinen tähti "(vain valloittivat epiteelin pintaan. Suodatinsarja 43/38, bar = 10 pm.
Kuva 5 Mahalaukun limakalvon hevosen 50L kanssa erosive gastriitti liittyvät bakteerit. Voimakas suurennos osoittaa, E. coli
kuten tangot ( vihreä) sisällä suulakepuristetun epiteelisolujen. fluoresoiva in situ hybridisaatio koettimella kohdistamista Gammaproteobacteria, suodatin asetettu 38, bar = 10 pm.
keskustelu
Aikaisemmat tutkimukset, joihin liittyy hevosen vatsan ovat esimerkiksi käytetty PCR kohdistamista 16S rRNA geenin erityisesti Helicobacter
spp. [12]. haittoja käyttämällä PCR ovat, että määrä ja sijainti bakteerien ei tiedetä tai se on epävarmaa bakteerit ovat elossa tai vaikka DNA on alasti. Siksi päätettiin, että käyttämällä FISH tekniikka tarjoaisi parempia ja tietoa bakteerien löytyy rauhas vatsassa hevosen, koska nämä asiat voitetaan tällä tekniikalla. Tätä tekniikkaa on käytetty aikaisemmin kuvaamaan tasaisempaa jakautumista Helicobacter
spp. ruoansulatuskanavassa koirien ja vatsassa terveiden hevosten osoittaa mikrobiston normaalin esiintyy levyepiteeliä ja rauhas limakalvo [15, 16]. Parhaan tietomme tämä on ensimmäinen tutkimus, jossa käytetään kalojen tutkia leesiot rauhas vatsaan.
Tässä tutkimuksessa yhdessä tapauksessa gastriitti liittyy bakteerikolonisaatiota paljastui. Erityisesti jakelu bakteerien ehdotti yhteydessä patologian havaittu. Bakteerien määrä oli merkittävästi lisääntynyt noin leesion ja olivat tiukasti kiinni epiteelisolujen, bakteerien kanssa ulottuu crypts ja sijaitsee solunsisäisiä. Kloonaus osoitti, että se oli kaksinkertainen infektio Enterococcus faecium
ja Escherichia
kuten bakteerin, mutta se myöhemmin tarkistettiin käyttäen in situ
risteytyvät gamma proteobacteria koetin että se oli vasta Escherichia
kuten bakteeri, joka tunkeutunut pinnallinen haavaumia ja todettiin solunsisäinen epiteelisoluissa ja sisällä neutrofiilisiä granulosyyttejä. Suoliston infektio suolistossa on yleinen ilmiö, mutta se on harvinaista löytää näiden infektioiden mahassa ja se ei ole aiemmin raportoitu aikuisilla hevosilla. Tämä tulos on erittäin mielenkiintoinen, mutta lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään, miten yleinen tämä ilmiö on hevosilla. Myös onko tämäntyyppinen infektio on ensisijaisen tai toissijaisen alkuperä on vielä selvennettävä. Escherichia
kuten klooneja kaikki oli 100% 16S rRNA samankaltaisuutta sekä E. fergusonii
ja Shigella flexneri
. Näin ollen tässä tutkimuksessa, sitä ei voida precised kokeellisesti, kumpi näistä kahdesta organismeja, jotka olivat läsnä tässä rauhas leesion. Kuitenkin ihmiset on raportoitu olevan ainoa luonnollinen isäntä Shigella
[17], kun taas E. fergusonii
on liittynyt monenlaisia ​​suoliston ja extra-suolikanavan infektioiden sekä ihmisten että eläinten kuten hevosten [18 19]. Näin ollen on erittäin todennäköistä, että Escherichia
kuten bakteeri löytyy tässä tutkimuksessa kuuluu E. fergusonii
. Tutkimukset ovat raportoineet E. fergusonii
nousevana taudinaiheuttaja ja liittyvät erityisesti bakteremia ja haavainfektion mutta sen tarkka merkitys infektioiden sekä ihmisten että eläinten on vielä selvittämättä [20].
Mikrobiologian näytteissä
ympäristö on rauhas vatsa on yleensä erittäin vihamielinen mikrobeja [21]. Se on vakiintunut, että toisin kuin ihmisillä ja koiria, jotka ovat ateria syöttölaitteet, hevoset ovat jatkuvia hapolla tuottajia, johtunee jatkuva ruokinta kuvio [22, 23]. PH vatsanpuoleisissa osa hevosen vatsa on vakaasti noin pH 1-3 koko 24 tunnin jakson aikana [24], joten suhteellinen alhainen moninaisuus bakteerien havaittiin limakalvonäytteistä tässä tutkimuksessa ei ollut odottamatonta.
Ominaisuus morfologiset fenotyyppiä suuria kokkeja kasvaa säännöllisesti tetrads perustettiin olla klooni 99% samankaltaisuus Sarcina ventriculi
. Tämä organismi on tunnettua pystyä kasvamaan mahan sisällön, ja on tunnusomaista, neli- kolle rakenne, kun kasvanut pH-1- pH 3 [25]. Nykyisessä tutkimuksessa havainto näiden eliöiden ei ole voitu osoittaa olevan osa minkään tietyn patologian, kun heidät löydettiin pieni numerot pariksi näytteistä (ts leesio ja normaali), sekä kontrollinäytteissä. Sarcina kaltaisia ​​bakteereita on löydetty useita lajeja, mikäli ne on tarkoitus aiheuttaa juoksutusmahan paisunut, verenvuoto ja haavaumia lampaita ja vuohen lapset [26, 27] ja mahdollinen yhteys mahalaukun laajentuma sekä koiria ja hevosia on myös on ehdotettu [28]. Ei ole todisteita kaasuakkumulaatioi- havaittu makroskooppisesti missään näistä hevosista ja siksi se ei tunnu, että läsnäolo Sarcina ventriculi
osaltaan patologian havaittu näitä hevosia.
Ei ollut yllättävää, että Lactobacillus (Lactobacillus salivarius
) löytyi tutkituissa kudoksissa ja sitä on aiemmin raportoitu, että useat Lactobacillus
spp., mukaan lukien L. saliva-
, ovat läsnä terveitä hevosia [16, 29]. Proksimaalinen hevosen vatsa toimii varastona rehuksi, sekä lokero mahansisäisillä käyminen. Ekosysteemi tällä alueella koostuu sekä anaerobiset ja laktaatti-hyödyntäen bakteerit suuria määriä, jotka ovat vastuussa kasvun haihtuvien rasvahappojen kun hiilihydraattien käymisen [30]. Varsinkin Maitohappobakteerien havaittiin kiinni epiteelin proksimaalisessa osassa hevosen mahan [31] ja nämä bakteerit todennäköisesti siirtyy rauhas vatsan osana normaalia vaihtuvuus. Olemme vain tutkinut osanäytteitä ja lisää bakteerien eliösystematiikan löytyvät terveen osan glandular mahan jos kattavampi mikrobiston yhteisö tutkimus tehtiin.
Voimassaolo havaintojen Helicobacter
Yksikään kudosnäytteitä antrumiin alue osoitti positiivisia signaaleja Helicobacter spp
. koetin tässä tutkimuksessa eikä spiraalin muotoinen bakteeri havaittiin käyttämällä FISH tekniikkaa myöskään. Tuoreessa tutkimuksessa Venezuelasta, spiraalin muotoinen bakteeri raportoitu koepalat sydämen alueen hevosen vatsan värjätään Warthin-Starry tahra [12]. Helicobacter spp
. tiedetään pystyä asuttaa mahassa tuottaa suuria määriä sytoplasman ureaasin [32] nopea ureaasi testiä käytetty tässä tutkimuksessa, Pyloritek ®, havaitsee ureaasiaktiivisuuden kudoksen näytteen ammoniakin tuotannossa kun ureaa on läsnä. Sitä käytetään laajalti ihmisen käytännössä havaita gastriitti aiheuttamaa Helicobacter spp
. Positiivinen ja negatiivinen ennustearvo arvot olivat välillä 98,1-100% ja 95,8-100%, vastaavasti tutkimuksessa testataan ihmisen potilaita ennen ja jälkeen hävittämisen -bakteerin [33]. Tässä tutkimuksessa ei positiiviset havaittu, mikä osoittaa, että koepaloja esillä olevassa tutkimuksessa ei sisältänyt bakteereita, joilla on kyky tuottaa ureaasin.
Päätelmät
Mahalaukun Helicobacter
spp. ei löytynyt eikä voinut liittyä vatsaan vauriot 36 hevosten analysoitu tässä tutkimuksessa. Patologian havaittu tässä tutkimuksessa olivat polypoid rakenteita, hyperplastic rugae ja pieni eroosiot, mutta bakteeri osallistuminen todettiin vain yhdessä kyseessä on eroosio. Tässä vaurio, Escherichia kaltainen klooni, todennäköisin E. fergusonii
, todettiin solunsisäinen. Onko tämä oli ensisijaisen tai toissijaisen tartunnan ei voitu päätellä. Hyvin rajallinen määrä bakteereja yleisesti löytyivät hevosen rauhas alueella odotetusti. Siten havaitseminen kohtalaisen suuria määriä tahansa bakteereita rauhasjärjestelmää limakalvon tasolla, sekä kryptissa pitäisi olla huolestuttavaa, koska tämä ei näytä olevan normaali löydös hevosen rauhas vatsaan. Jatkotutkimukset, joissa bakteerien ja suhteessa mahavaurioita hevosten vahvistettu kliinisiä oireita ovat aiheellisia, koska nämä hevoset eivät sisälly nykyiseen tutkimuksessa. Tool Menetelmät
Hevoset ja tutkimuksen suunnittelu
Tutkimus toteutettiin kuin poikkileikkaus tutkimus vatsat populaatiosta 63 teurastamon hevosten Tanskassa. Hevoset oli hyväksynyt eläinlääkintävirkamies niin terveellisiä teuraaksi. Hevoset olivat tainnutus Pulttipistoolimenetelmän ja veri poistetaan. Vatsassa, mukaan lukien 5-10 cm distaalisen ruokatorven ja 10 cm proksimaalisen pohjukaissuolen, poistettiin välittömästi sisäelinten poiston jälkeen ja avattiin suurempaa kaarta pitkin. Ingesta poistettiin, ja jos tarpeen, limakalvon huuhdellaan varovasti vähintään vesijohtovettä ennen tarkastusta. Vain vatsat törkeästä vaurioista rauhas limakalvon sisällytettiin sekä seitsemän ohjaus vatsat ilman brutto näyttöä mahavaurioita.
Rauhas vaurioita määriteltiin limakalvon joilla on epänormaali makroskooppinen ulkonäkö eli hyperaemic, lisääntynyt paksuus, eroosiot tai haavaumia . Anatominen asennot vauriot todettiin seuraavasti: cardia, korpus tai antrum-alueella (Fig. 6). Kuvio 6 Anatominen alueille vatsan avattiin suurempaa kaarta pitkin. Ei-glandular alue on valkoinen esiintyy epiteelin, kun taas glandular alue on punaisen. Ne erotetaan Margo plicatuksen
. Kolme otokseen alueita ovat: Cardia kuin pieni kaistale alueen alapuolella ja pitkin Margo plicatuksen
, corpus alue, joka sisältää happoa, pepsinogeeni ja limaa erittävä rauhaset (tummanpunainen) ja antrum sisältävä alue ensisijaisesti limaa ja gastriini erittävä rauhaset.
Näytteenotto menettelyä
Kustakin vatsaan rauhas vaurioita, kolme kudosnäytteet saatiin, suurin leesion (A, b, C) sekä kolme pariksi normaalilta näyttäviä kudosnäytteet (a, b, c) on saman anatominen alue, mutta ainakin vähintään 5 cm: n päässä. A /a: pieni, koepala koko (0,5 x 0,5 cm) limakalvo näyte saatiin välittömästi ureaasin testaus kanssa Pyloritek ® määritys mukaan valmistajan ohjeiden. Testit luettiin 60 minuutin normaali aika ja tulokset totesi kuin positiivinen tai negatiivinen. Näytteet B /b: 3 x 3 cm koko paksuudeltaan kudosnäyte kuten limakalvo ja submukoosan saatiin FISH ja kiinnitettiin 10% puskuroituun formaliiniin. 24 tunnin kuluttua kiinnittäminen näytteet siirrettiin 70% etanolia, parafiiniin upotettu, leikattiin 3 um ja joka on asennettu SuperFrost /plus dioja (Menzel-Gläser, Braunschweig Saksa).
Näytteet C /c: kolmasosa pari kudoksen näytteitä kloonaus ja sekvensointi saatiin ja jäädytettiin kuivalla jäällä (Jos leesion koko sallitaan se).
alkaen seitsemästä ohjaus mahat, joilla ei ole makroskooppisia mahalaukun vaurioita, näytteet a, b ja c otettiin normaaleilta vaikuttavien limakalvon antrum. Kolme näistä hevosta lisäksi näytteet cardia, corpus ja pohjukaissuoli samoin.
Näytteenottomenettelyistä tapahtui elo-lokakuussa 2007. Aiemmat tiedot aikaisempia terveyden hevoset ei saatu.
Loisteputki in situ hybridisaatio bakteereille
Mikrobigeenivarojen havaitseminen, kudoksen hybridisoitiin samanaikaisesti kahdella 16S rRNA leimattujen koettimien eri fluoroforeilla. Oligonukleotidikoetin S-D-Bact-0338-a-A-18 kohdistaminen Bakteerit (5'GCTGCCTCCCGTAGGAGT3 ") [34] oli 5 'merkitty fluoreseiini ja isotiosyanaattijohdannaisella Cy3. Oligonukleotidikoetin HEL717 kohdistaminen Helicobacter suvun (5'AGGTCGCCTTCGCAATGAGTA3 ") [35] oli 5 'leimattu isotiosyanaattijohdannaisella Cy3. Todentaa kloonauksen tulosten kolmas ja neljäs koetin, LC gProt-1027-aa-17 (5'GCCTTCCCACATCGTTT3 ') kohdistaminen 23S rRNA Gammaproteobacteria oli 5' merkitty fluoreseiini ja koetin SG-Enteroco-184 (5'CAAATCAAAACCATGCGG3 ') oli Cy3 leimattu kohdistaminen 16S rRNA Enterococcus
spp [36]. Kaikki koettimet syntetisoitiin DNA Technology, Aarhus, Tanska. Objektilasit poistettiin parafiini ksyleenillä ja siirrettiin 100% alkoholia 30 minuuttia ennen hybridisaatiota. Hybridisaatio suoritettiin 45 ° C: ssa 40 ml: lla hybridisaatiopuskuria (100 mM Tris [pH 7,2], 0,9 M NaCl, 0,1% natriumdodekyylisulfaattia) ja 200 ng kutakin koetinta 16 tunnin ajan Sequenza Slide Rack (Thermo Shandon, Cheshire, UK). Sitten näytteet pestiin kolme kertaa esilämmitettyä (45 ° C) hybridisaation puskurissa 15 minuutin ajan ja sen jälkeen kolme kertaa esilämmitettyä (45 ° C) pesuliuosta (100 mM Tris [pH 7,2], 0,9 M NaCl). Näytteet huuhdottiin vedellä, kuivattiin ilmassa ja asennettu Vectashield (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) epifluoresenssiin mikroskopia. Axioimager M1 epifluoresenssimikroskooppia varustettu epifluoresenssilla kanssa 100-W HBO lampun ja suodattimen asettaa 43 ja 38 käytettiin visualisoida Cy3 ja fluoreseiinin, vastaavasti. Kuvat saatiin käyttäen AxioCam MRM version 3 FireWiremonocrome kameran ja ohjelmiston AxioVision version 4.5 (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa).
Arviointi epifluoresenssitoimintatilassa mikroskopia suoritettiin kuvaus subjektiivinen määrä, morfologisia ulkonäkö ja sijainti fluoresoivien solujen ilmeinen kussakin kudosnäytteessä. Lisäksi kaikki kudoksen leikkeet värjättiin H &E ja arvioidaan histopatologisesti.
16S rDNA-monistus ja kloonaus
havaitsemisen jälkeen bakteerit käyttäen FISH, osa näytteet hevoset osoittaa bakteerien eri morfologioita valittiin 16S rRNA kloonaus. DNA eristettiin 4 kudosnäytteistä käyttämällä Easy-DNA -pakkausta (Invitrogen, Tåstrup, Tanska) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 16S rRNA-geeni monistettiin käyttäen alukkeita SD-Bact-0008-As-20 (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ') [37] ja S - * - Univ-1492-aA-19 (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') [38]. PCR-syklien koostui alkudenaturaatio 94 ° C: ssa 6 min; jota seurasi 30 sykliä denaturointi 94 ° C: ssa 30 s, pariutuminen 55 ° C: ssa 45 s ja pidennys 72 ° C: ssa 2 min; ja lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 3 min. Amplified DNA varmistettiin elektroforeesilla agaroosigeeleillä. PCR-tuotteet puhdistettiin käyttämällä QIAquick PCR-puhdistuskittiä sarakkeet (Qiagen GmbH, Hilden, Saksa). Luoda tasapäiseksi DNA seuraavan sekoitettiin 0,5 ml: n mikrosentrifugiputkeen, 4 ui 5 x T4-DNA-polymeraasia puskurissa, 14,7 ui puhdistettua PCR-tuotetta 0,8 ui dNTP: tä (2,5 mmol l -1 kukin) ja 0,5 ui (1,2 U) T4-DNA-polymeraasia (Invitrogen), ja niitä inkuboitiin 12 ° C: ssa 15 minuutin ajan. T4 DNA-polymeraasi oli lämpöinaktivoitua, ja tasapäiseksi DNA puhdistettiin käyttäen QIAquick PCR-puhdistuskittiä sarakkeet (Qiagen GmbH) ja eluoitiin lopputilavuuteen 10 ui kahteen kertaan tislattua vettä. Noudattamalla valmistajan kuvaukset kloonauksesta suoritettiin käyttäen Zero tylppä TOPO kloonausta (Invitrogen). Kymmenen pesäkettä kustakin kloonauksesta poimittiin ja sekvensoitiin automaattitoimintoa analysaattori (ABI PRISM 373 DNA Sequencer, PE Biosystems, Foster City, CA, USA) käyttämällä kahta standardia vektorin alukkeita (T3 ja T7) sisältyy sarjaan. Sekvenssi koottiin BioNumerics 4.0 (Applied Math, Sint-Martens-Latem, Belgia) ja tarkastetaan kimeeroista sekä räjäyttämällä yksittäiset sekvenssit GenBank http: //www. NCBI. NLM. NIH. Gov ja ohjelmiston Pintail version 1.1 http: //www. Cardiff. ac. uk /biosi /tutkimus /Biosoft /. Fylogeneettiseen analyysi kloonien, jotka kuuluvat Escherichia
suvun tehtiin lataamalla 16S rRNA-sekvenssien pidempi kuin 1200 bp RDP v.9 tietokantaan Escherichia
tyyppi -kannat http: //RDP. Cme . MSU. edu. Sekvenssit leikattu samaan pituuteen ja 1327 bp: n ja linjassa pareittain (UPGMA), jota seurasi maailmanlaajuinen sekvenssin rinnastus. Lopullinen fylogeneettisen puun rakennettiin käyttämällä WARD algoritmia, jossa Enterobacter sakazakii
(AB004746) käytettiin outgroup.
Julistukset
Kiitokset
Kirjoittajat haluavat kiittää Hanne H. Møller, Katja Kristensen ja Johanna Z Amenuvor teknisen avun laboratorioissa. Kiitos myös Stina Vesterholm auttamiseksi kerätä kudoksia. Tätä työtä tukivat Kongeriget Danmarkin Horseinsurance g /s ja Intervet Tanska. Sponsorit osallistunut millään käytännön osittain tai tutkimuksen lopputuloksia.
Kirjoittajien alkuperäinen toimitti asiakirjat kuville
Alla linkkejä kirjoittajien alkuperäiset toimitti asiakirjat kuville. 12866_2009_1040_MOESM1_ESM.tiff Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 1 12866_2009_1040_MOESM2_ESM.tiff Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 2 12866_2009_1040_MOESM3_ESM.pdf Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 3 12866_2009_1040_MOESM4_ESM.tiff Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 4 12866_2009_1040_MOESM5_ESM.tiff Kirjoittajien alkuperäisen tiedoston luku 5 12866_2009_1040_MOESM6_ESM.jpeg Kirjoittajien alkuperäisen tiedoston luku 6

• Perustaminen ja tunnistaminen kanimallissa vatsakalvon carcinomatosis mahalaukun cancer
• NO aiheuttama motiliteettia vaikutuksia mahalaukun silmänpohjan ja pylorus of sGCβ1his105phe mutanttihiirien