Išnagrinėjus arklių liaukų skrandžio pakitimų bakterijoms, įskaitant Helicobacter spp pagal fluorescencijos in situ hybridisation

nagrinėjimo arklių liaukų skrandžio pakitimų bakterijoms, įskaitant Helicobacter spp
pagal fluorescencijos in situ hibridizacijos
pervežimas tezės
Background
Apie arklių liaukų skrandis dažniausiai paveikta erozijos ir opų. Šio tyrimo tikslas buvo įvertinti, ar bakterijos, įskaitant Helicobacter, gali būti įtraukti į skrandžio liaukų pakitimai matyti arklius etiologijos.
Rezultatai
Skrandžio pažeidimų, taip pat įprastų pasirodo gleivinės buvo gauti iš paskerstų arklių vartoti žmonėms. Visi bandiniai buvo bandomi ureazės aktyvumo naudojant Pyloritek ® tyrimu, o gleivinės bakterijų kiekis buvo įvertintas naudojant fluorescencijos in situ hibridizacijos
. Pasirinktose daliniuose mėginiuose, bakterijos charakteristika buvo toliau siekiama klonuoti ir sekos. Gleivinės pažeidimo buvo rasta 36/63 skrandžius ir įtraukti hiperplazinį rugae, Polipveidīgs struktūras ir židinio erozija. Nė vienas iš pavyzdžių buvo testas buvo teigiamas ureazės aktyvumo ar žuvims naudojant Helicobacter genties konkretų zondą. Mėginiuose pažeidimų, taip pat įprastų bandinių, klonų su 99% panašumų su Lactobacillus salivarius
ir SARCINA ventriculi
nerasta. Escherichia
kaip bakterijos klonų ir Enterococcus klonų buvo įrodytas vienu židinio erozijos. Remiantis filogenetycznej medžio šie klonai buvo 100% panašumo į Escherichia ferguaonii ir Enterococcus faecium pervežimas. Enterococcus buvo rasti kolonizacijos gleivinės paviršių, o E. ferguaonii
organizmai taip pat buvo įrodytas intraepitelinės.
Išvada
Skrandžio Helicobacter spp. nebuvo galima patikrinti, kaip yra įtraukti į pakitimų liaukų skrandžio arklio. Nuo E. ferguaonii
buvo apibūdinta kaip naujos patogeno abiem žmonėms ir gyvūnams, kad šios bakterijos skrandžio erozijos orderių išsamiau paaiškinti, kaip rasti ar skrandžio infekcija šio tipo bakterija yra svarbi arklių.
Faktai
iš arklių, pažeidimai ne-liaukų pilvo dalyje yra plačiai paplitusi ir atrodo, kad būti dėl per didelio rūgšties [1] poveikio, bet mažai buvo aprašyta apie pakitimus liaukų dalis. Pažeidimai, esančių liaukų regione buvo įrodytas 58% 162 hospitalizuotų arklius [2] ir 47% 345 žirgų [3] ir nors jų priežastis negavote daug dėmesio, rūgšties poveikio neatrodo būti pagrindinis veiksnys, , kaip buvo nustatyta koreliacija tarp pakitimų šių dviejų regionų, skrandžio [3].
skrandžio bakterijos kaip už liaukų skrandžio pakitimų priežastis buvo siūloma daug gyvūnų ir žmogaus organizme jie sudaro didžiąją patikrino rizikos faktorius. Skrandžio organizmų rasti, Helicobacter pylori
buvo aprašyta labiausiai dėl jo patogeninį potencialą, siekiant paskatinti lėtinių gastritas, opos adenokarcinomos ir gleivinės limfoidinis audinius (salyklas) limfoma žmonėms [4-6]. Bakterijos šios genties taip pat buvo nustatyta skrandžio audinių pavyzdžių iš gyvūnų, įskaitant šunų, kiaulių, avių ir galvijų [7-10].
Arklio, prieštaringi įrodymai išeina, ar bakterijos, kurios specialiai gali sukelti skrandžio pažeidimai pasitaiko. Keletas tyrimų parodė, kad skrandžio Helicobacter spp
. dalyvauja normalioje išvaizdos gleivinės naudojant PGR ir imunochemijos [11, 12], o kiti nerado ryšio tarp pažeidimų ir bakterijų [13] buvimo įrodymų. Kaip skrandžio bakterijų rūšys buvo patvirtinta ar siūloma kaip dalis tam tikrų tipų skrandžio patologijos žmonėms ir kitų gyvūnų rūšių patogenezės, šio tyrimo tikslas buvo įvertinti, jei bakterijos gali būti įtraukti į patologijos, stebėtas tuo arklių liaukų skrandį. Pagrindinis dėmesys buvo pateikti daugiau įrodymų apie buvimą ir lokalizacijos bakterijų apskritai prie gleivinės lygio arklių liaukų skrandį. Ypatingas dėmesys buvo skiriamas gauti informaciją apie buvimo ir dalyvavimo bet Helicobacter rūšių
gleivinės pakitimų. Fluorescencijos in situ
hibridizacijos (FISH) technika buvo naudojama šiam tikslui, kuris leidžia iš rRNR orientuojasi zondai tiek bendro bakterijų populiacijos ir apibrėžtų genties /rūšis. Šis metodas leidžia bakterijų morfologija, gausa, vietos nustatymas audiniuose, ir net nuorodas augimo tempai ir fiziologinius veiklą [14] Rezultatai.

Gross liaukų pakitimai buvo pastebėtas 36 63 skrandžius tirtų (57.1 %). Nuo pažeidimo dauguma buvo matyti iš Ertmė regione (91,7%). Per šešis skrandžiai, pažeidimai buvo papildomai ar tik matyti iš CARDIA arba corpus regione. Nėra pažeidimai buvo rasta dvylikapirštės žarnos Viesbutis The pažeidimai buvo suskirstyti į tris grupes:. Polypous (2 skrandžius su Polipveidīgs mases, esančių tiek Cardia ir antralinėje dalyje su dydžių nuo 1 iki 5 centimetrų skersmens), II: hiperplazinių rugae pažeidimai (13 skrandžiai) arba III:. Hyperaemic, erozinių ar opiniu pažeidimai, buvo pastebėtas 21 skrandžius Viesbutis The hiperplazinį rugae visi buvo vertinamas atsižvelgiant į antralinėje dalyje ir svyravo nuo turintis intensyvų hiperemija su eksudato į rugae su normaliai pasirodo gleivinės paviršių. Pilna sustorėjimas Ertmė rugae lėmė pirmiausia hiperplazija skrandžio foveolae palyginti su atitinkamu normalių pavyzdžių. Likusios pažeidimai visi buvo nustatyta, kad maži pavieniai pažeidimai ne daugiau kaip maždaug 1 × 2 cm dydžio. Židinio sritys erozinio gastrito buvo dažniausios išvados tokių tipo pakitimų ir apibūdinamas kaip sloughing iš paviršutiniškų ląstelių luminal epitelio su tuo pačiu metu fibrinopurulent eksudato, luminal ląstelių nuolaužų ir daugiausia limfocitų įsiskverbti į plonų sluoksnių Propria. Gilesnės erozijų rasta 9 skrandžius griovė tiek skrandžio duobes ir jų dalių liaukos, kurios buvo pastebėtas su gastritu tik tiesioginių audinių regioną. Vienas tiesa opa buvo nustatyta, einančią per visą storį, plonų sluoksnių Propria, kad matytųsi LAMINA muscularis į spindį. Ne daugiau kaip du pažeidimai buvo rasti kiekvienoje iš šių skrandžius.
Helicobacter ir ureazės aktyvumo bandymas
Naudojant genties Helicobacter konkretų zondą jokių teigiamų signalų Nerastas nė iš 79 audinių mėginių (36 suporuotų pavyzdžių ir 7 kontrolę) , Sutinka su šiais žuvies rezultatus, nė vienas iš pavyzdžių testas buvo teigiamas ureazės aktyvumo arba. Vidaus kontrolės visų ureazės testus buvo rasta teigiamas, nes nuoroda funkcinio tyrimo rinkinio.
Bakterijos apskritai
Apskritai, tik buvo pastebėtas, susijusios kelios bakterijos į gleivinės paviršių tiek nukentėjusioji, taip pat sveiką skrandį pavyzdžiai. Apskritai, keturi morfologiniai įvairių tipų bakterijų ląstelių galėtų būti pavaizduojami su Eubacteria zondas: 1) mažas, trumpas (0,2-0,5 mkm) coccoid strypai, 2) atskiri strypai (1 × 3 mikronų), 3) ilgio grandžių strypų (iki 60 mkm) arba 4) didelis (2-3 mkm skersmens) coccoid bakterijos aiškiai paskirstyti poromis. Paprastai kai yra, bakterijos buvo pastebėtas grupių, susijusių su pašarų dalelių arba netoli gleivinės paviršiaus pervežimas įrodinėjimas bakterijų gastritas buvo rastas vienoje skrandžio pažeidimo šiurkščiai būdingas kaip vienišas erozijos, 1 × 2 cm dydžio, centras yra hyperaemic ir apsuptas proliferacinės epitelio ratlankio (1 pav.). Mikroskopiškai, židinio erozija gleivinės su lėtai eritrocitų ir leukocitų, daugiausia neutrofilinių kilmės, buvo pastebėtas. Eksudatas buvo papildomai vertinamas skrandžio duobes. Korinio uždegiminė reakcija su vienabranduolėse ląstelių buvo pastebėtas išplėsti taip giliai, kaip į plonų sluoksnių muscularis. buvo nustatyta, kad iš uždegimo paveiktą gleivinės ir skrandžio duobes paviršius labai kolonizavo coccoid trumpų strypų taikant už bendrųjų bakterijų zondas (2 pav.). Trumpi strypai buvo ypač pastebima infiltrating erozija. Jie taip pat buvo pastebėta, viduląstelinės į epitelio ląstelių, taip pat per neutrofilinių granuliocitų. Bakterijų kolonizacija skrandžio buvo tik pažeidimo kaip nėra bakterijos buvo pastebėtas į atitinkamą sveiką gleivinės mėginio. 1 pav Židinio erozinio pažeidimui (baltos rodyklės) įrodo, bakterijų gastritas ne histologinio vertinimą. Pažeidimas buvo maždaug 2 × 2 cm įsikūręs antralinėje dalyje šalia prievarčio įėjimo.
2 paveikslas skrandžio gleivinę su erozinio gastrito, susijęs su bakterijų. Gleivinės paviršius ir greta korinio nuolaužų labai kolonizuoti bakterijas (raudona). Keletas bakterijos yra vertinama ląstelėje sveikas epitelis (Arrowhead), taip pat per degeneruotuose ir nudžiūvusiuose epitelio ląstelių (rodyklė). Be to, bakterijos yra rastos granulocitų. Chromosomų dažymas su zondu orientacijos Bakterijos, filtras nustatyti 43, baras = 25 mkm.
Klonavimas ir sekos
Remiantis morfologijos ir intensyvumo bakterijų įrodytas, naudojant žuvies, mėginių į C /C mėginių buvo atrinkti klonavimas ir seka atstovaujanti mėginius, įskaitant vieną su bakterijų gastritas.
pasirinktos mėginių skrandžiams, įrodančių įvairių bakterijų morphologies, buvo nustatyta dviejų skirtingų rūšių klonai normaliomis pasirodo gleivinėje mėginių (c mėginiai), vienas klonas turėjo 99% panašumo į Lactobacillus salivarius pervežimas JCM 1231 (AB370881) ir kito tipo klonų turėjo 99% panašumo į SARCINA ventriculi
DSM 316 (X76650).
iš pažeidimų (C pavyzdžiai), klonai taip pat buvo rasta 99 % panašumo į Lactobacillus salivarius pervežimas JCM 1231 (AF182725). Nuo gleivinės su bakterijų gastritas, keturi iš dešimties klonai atitiko 100% Enterococcus faecium
, o likusios šešios klonai (gauta seka deponuojami GenBank su prisijungimo GQ423062 Nr.) Priklausė Escherichia kaip pervežimas bakterijos. Filogenetyczna medis buvo pastatytas su šešių Escherichia
kaip klonai iš pažeidimo ir visi turėjo 100% panašumo į padermes tiek E. ferguaonii
ir Shigella flexneri
(3 pav). Taikant gama proteobakterijos konkretų zondas trumpi strypai patekę į epitelis, taip pat rado Intraląstelinė per neutrofilinių granuliocitų, buvo patikrinta, kaip Escherichia
kaip bakterijos, o Enterococcus faecium
organizmai buvo nustatyti kolonizavimo epitelio paviršių Enterococcus konkretaus zondas (4 pav ir 5). 3 pav filogenetyczna medis 16S rRNR geno sekų panašumo, rodantis šešių klonų priklausančių Gammaproteobacteria poziciją rasta Horse 50L ir labiausiai glaudžiai susijusi padermes priklausančių Escherichia genties. Šeši klonai (Acc.No. GQ423062) turėjo 100% panašumą Shigella flexneri
ir E. ferguaonii
. Enterobacter sakazakii (AB004746) buvo naudojamas kaip outgroup. Seka stojimo numeriai pateikti.
4 pav skrandžio gleivinę arklių 50L su erozinio gastrito, susijęs su bakterijų. Taikant fluoresceiną zondas Gammaproteobacteria ir Cy3 užrašu zondas Enterococcus, E.coli
kaip organizmo (žalias) (Arrowhead) buvo nustatyta Intraląstelinė per epitelio ląstelių ir epitelio paviršiaus tarpu E. faecium (raudona) ( " White Star "(tik kolonizavo epitelio paviršių. filtras nustatytas 43/38, baras = 10 mkm.
5 paveikslas skrandžio gleivinę arklių 50L su erozinio gastrito, susijęs su bakterijų. Aukštos didinimas rodo E.coli
kaip strypų ( žalia) per ekstruzinio epitelio ląstelių. chromosomų dažymas su zondu orientacijos Gammaproteobacteria, filtras nustatyti 38, baras = 10 mkm.
Diskusijos
Ankstesni tyrimai įtraukiant arklių skrandžio turite pvz naudojamas PGR orientacija 16S rRNR geno ypač Helicobacter
spp. [12]. trūkumai naudojant PGR yra tai, kad dydis ir vieta bakterijų, nėra žinoma ir tai neaišku, ar bakterijos yra gyvi ar net jei DNR yra nuogas. Taigi, buvo nuspręsta, kad naudojant FISH metodu būtų geriau ir daugiau informacijos rastų liaukų skrandžio arklio bakterijų, nes šie klausimai yra išspręsti šią technologiją. Šis metodas buvo naudojamas anksčiau aprašyti erdvinio paskirstymo Helicobacter
spp. virškinimo trakto šunims ir sveikų arklių skrandžio įrodyti normalios išvaizdos suragėjusių ir liaukinio gleivinės [15, 16] mikrobiotą. Kiek mums žinoma, tai pirmasis tyrimas, naudojant FISH išnagrinėti pakitimų liaukų skrandį.
Šioje tyrimas Vienu atveju gastrito, susijęs su bakterijų kolonizacija buvo atskleista. Ypač bakterijų paskirstymo pasiūlė ryšį su patologijos stebimas. Bakterijų dydis buvo ženkliai išaugo aplink pažeidimo ir buvo sandariai laikomasi epitelio ląstelių, bakterijų, nusidriekę į bendrą kriptos ir įsikūręs ląstelėje. Klonavimas parodė, kad tai buvo dviguba infekcija Enterococcus faecium
ir Escherichia
kaip bakterijos, tačiau vėliau ji buvo patikrinta naudojant in situ hibridizacijos
su gama proteobakterijos zondas, kad tai buvo tik Escherichia
kaip bakterija, kuri infiltravo paviršutinius išopėjimas ir buvo nustatyta, Intraląstelinė į epitelio ląsteles ir per neutrofilinių granulocitų. Enterobacterial infekcija žarnyne yra dažnas reiškinys, tačiau tai retai galima rasti šias infekcijas, skrandžio ir niekada anksčiau nebuvo pranešta suaugusių žirgų. Šis rezultatas yra labai intriguojanti, tačiau tolesni tyrimai turi paaiškinti, kaip bendra šis reiškinys yra arkliai. Be to, ar ši infekcija tipas yra pirminės arba antrinės kilmės reikės papildomo paaiškinimo. Escherichia
kaip klonai visi turėjo 100% 16S rRNR genų panašumu tiek E. ferguaonii parsisiųsti ir Shigella flexneri
. Tokiu būdu, šiame tyrime, jis negali būti precised eksperimentiškai, kuri iš šių dviejų organizmų, kad buvo pateikti šiame liaukų pažeidimo. Tačiau, žmonės buvo pranešta, kad vienintelis natūralus host Shigella
[17], kadangi E. ferguaonii
buvo susijęs su įvairių žarnyno ir Extra-žarnyno infekcijų žmonėms ir gyvūnams, įskaitant arklius [18 , 19]. todėl yra labiausiai tikėtina, kad Escherichia
kaip bakterija nustatyta, šiame tyrime yra siejamas su E. ferguaonii
. Tyrimai pranešė E. ferguaonii
kaip naujos patogeno ir susijęs su ypač bakteriemija ir žaizdų infekcija, bet jo tikslus vaidmuo infekcijų žmonėms ir gyvūnams vis dar reikia išsiaiškinti [20] mikrobiologija Atrinktos <.
Br> į liaukų skrandžio aplinka paprastai yra labai priešiška link mikrobų [21]. Jis yra gerai nustatyta, kad, skirtingai nuo žmonių ir šunų, kurie yra maisto dalytuvai, arkliai yra nuolat rūgšties gamintojai, tikriausiai dėl nuolatinio šėrimo modelis [22, 23]. Į pilvo dalis arklių skrandžio pH yra stabilus maždaug pH 1-3 visoje 24 valandų laikotarpį [24], todėl santykinis mažai įvairovė pastebėtas gleivinės mėginiai šiame tyrime bakterijų nebuvo netikėtas.
Charakteristika morfologinis fenotipas didelio kokų auga reguliariai tetrads buvo įkurta būti klonas su 99% panašumo į SARCINA ventriculi pervežimas. Šis organizmas yra žinoma, kad būtų galima augti skrandžio turinio ir turi būdingą TETRADE struktūrą, kai jie auginami iš pH 1- pH = 3 [25]. Dabartiniame tyrime, nebuvo galima nustatyti šių organizmų aptikimo, kad dalis bet specifinę patologiją, kaip jie buvo rasta į žemos skaičius yra suporuotas mėginių (t.y., odos pažeidimo ir įprastų), taip pat kaip ir kontrolinių mėginių. Sarcina panašios bakterijos buvo rastas rūšių, kur buvo tariamų jie sukelia bandos šliužo dislokacijos pasipūsti, kraujavimas ir opos ėriukų ir ožkų vaikams įvairovė [26, 27] ir galimą ryšį skrandžio išsiplėtimas tiek šunims ir arkliams taip pat turi buvo pasiūlyta [28]. Nėra dujų sankaupų požymių nepastebėta makroskopinis bet kuriuo iš šių arklių ir todėl neatrodo, kad SARCINA ventriculi pervežimas buvimas prisidėjo prie patologijos pastebėtas šių arklių.
Tai buvo nenuostabu, kad Lactobacillus (Lactobacillus salivarius
) buvo nustatyta tirtų audinių ir jis anksčiau buvo pranešta, kad kelios Lactobacillus
spp., įskaitant L. salivarius
, yra esančių sveikų arklių [16, 29]. Proksimalinės arklių skrandžio veikia kaip saugojimo pašarų, taip pat kaip už intragastrinį fermentacijos skyrius. Šio regiono ekosistemą sudaro tiek anaerobinių ir laktato naudojant bakterijas dideliais kiekiais, kurie yra atsakingi už lakiųjų riebalų rūgščių padidinimui fermentacijos angliavandenių [30]. Ypač laktobacilų buvo rasta prilipęs prie į proksimalinės dalies arklių skrandžio [31] ir šių bakterijų epitelio, greičiausiai, bus pereiti į liaukinio skrandžio dalis normalios apyvarta per. Mes tik išnagrinėjo mėginių ir daugiau bakterijų taksonai bus rasta sveika dalis liaukinio skrandžio jei išsamesnė mikroflora bendruomenė tyrimas buvo atliktas.
Galiojimo Helicobacter išvadas
nė vienas iš audinių mėginių iš antralinėje dalyje regionas parodė teigiamus signalus iš Helicobacter spp
. zondas šiame tyrime ir nėra spiralės formos bakterijos buvo pastebėti naudojant FISH metodu arba. Neseniai atliktas tyrimas iš Venesuelos, spiraliniai formos bakterijos buvo pranešta biopsijų iš širdies regione arklių skrandžio tamsintas su Warthin-Žvaigždėtas dėmių [12]. Helicobacter spp
. žinoma, kad būtų galima kolonizuoti skrandį gaminti didelius kiekius citoplazminio ureazės [32] greito ureazės testą taikyti šiame tyrime, Pyloritek ®, aptinka ureazės aktyvumą audinio mėginio, amoniako gamyba, kai karbamido yra. Jis plačiai naudojamas žmogaus praktikos aptikti gastritas, kurią sukelia Helicobacter spp
. Teigiami ir neigiami prognozinės reikšmės buvo 98.1-100% ir 95.8-100%, atitinkamai tyrimą prieš ir po likvidavimo bakterijos [33] bandymų sergančių žmonių. Šiame tyrime nėra teigiami testai buvo rasta, nurodant, kad šios studijos biopsijos pateikta jokių bakterijų su galimybe gaminti ureazės.
Išvadas
skrandžio Helicobacter
spp. nerasta ir negalėjo būti susijęs su skrandžio pakitimų 36 analizuotų šiame tyrime arklius. Nustatytas šio tyrimo patologiją įtraukti Polipveidīgs struktūras, hiperplazinį rugae ir mažų erozija, tačiau bakterijų dalyvavimas buvo rastas tik vienas įvykus erozijos. Šiuo pažeidimo, Escherichia-kaip klonas, greičiausiai E. ferguaonii
, buvo nustatyta Intraląstelinė. Nesvarbu, ar tai buvo pirminis arba antrinis infekcija negalėjo būti sudarytas. Labai ribotas kiekis bakterijų apskritai buvo rasta arklių liaukų regione, kaip tikėtasi. Tokiu būdu, aptikimas nuo vidutinio iki aukšto kiekio bet bakterijų veiklos liaukų gleivinės lygiu, taip pat kaip ir kriptos turėtų būti priežastis nerimą, nes tai neatrodo, kad būti normalus išvada arklių liaukų skrandį. Tolesni tyrimai, susiję su bakterijų ir ryšį su skrandžio pakitimų arkliams, sergantiems patvirtintas klinikiniais požymiais, yra pagrįstos, nes šie arkliai buvo neįtrauktas į dabartinį tyrimą.
Metodai
Arkliai ir studijų dizainas
Tyrimas buvo atliekamas, kaip skerspjūvio tyrimas skrandžių iš 63 skerdyklų arklių Danijos gyventojų. Arkliai buvo patvirtintas veterinarijos tarnybos sveikas skersti. Arkliai buvo priblokšti su strypo ir exsanguinated. Skrandžio, įskaitant 5 - 10 cm distalinio stemplės ir 10 cm nuo proksimalinio dvylikapirštės žarnos, buvo pašalintas iš karto po to, kai jos buvo išdarinėtos ir atidarytas išilgai didesnio kreivumo. Ingesta buvo pašalinta ir, jei reikia, gleivinė buvo atidžiai nuplauti vandentiekio vandens minimali sąlyga ir prieš patikrinimą. Tik skrandžiai su bruto pakitimus liaukų gleivinės buvo įtraukti, taip pat septynis kontrolės skrandžius be bendrųjų įrodymų skrandžio pakitimų.
Liaukų pakitimai buvo apibrėžiama kaip gleivinės turinčio nenormalus makroskopinį išvaizdą ty hyperaemic, padidėjo storis, erozijų ar opų , buvo pastebėti anatominės padėtys pažeidimų kaip: CARDIA, corpus arba Ertmė regione (. 6 pav). 6 pav Anatomijos regionai skrandžio atidarė kartu didesnio kreivumo. Ne liaukų regionas turi baltą atsiradusią epitelis, o liaukų regionas atspalvių raudonos spalvos. Jie atskiriami į Margo plicatus
. Trys atrinkti regionai: CARDIA kaip mažas juostelės plotas šiek tiek žemiau ir palei Margo plicatus
, corpus regione, kuriame rūgšties, pepsinogen ir gleivių sekretuojančių liaukos (tamsiai raudonos) ir Ertmė regione, kuriame primarly gleives ir gastrinas išskiriančių liaukų.
mėginių ėmimo metodika
iš kiekvienos skrandžio su liaukų pažeidimų, trys audinio mėginiai, kur gauti iš didžiausių pažeidimui (A, b, c), taip pat trijų prijungtų normalus rodomi audinio mėginiai (a, b, c) iš tos pačios anatomijos regionas, bet bent jau ne mažiau kaip 5 cm atstumu. A /A: mažas, biopsija dydis (0,5 × 0,5 cm), gleivinės mėginys buvo gautas nedelsiant ureazės bandymų su Pyloritek ® tyrimą pagal gamina instrukcijas. Bandymai buvo skaityti po 60 minučių standartiniu laiku ir rezultatai pažymėti kaip teigiamas arba neigiamas. Mėginiai B /B: 3 × 3 cm, pilnas storis audinio mėginio įskaitant gleivinės ir submucosa buvo gautas žuvis ir nustatomas 10% buferiniame formalino. . Po 24 valandų fiksavimo mėginiai buvo perduotos 70% etanolio, parafiną integruotas, suskirstyta ne 3 m ir sumontuota ant SuperFrost /Plus Skaidrės (Menzel-Glaser, Braunšveigas Vokietija)
Pavyzdžiai C /C: trečioji pora audinio mėginiai klonavimo ir sekos buvo gauta ir snap įšaldytos naudojant sausą ledą (jei pažeidimas dydis leido ją).
iš septynių kontrolės skrandžius be makroskopinių skrandžio pažeidimų, mėginiai a, b ir c paimti iš normalios išvaizdos gleivinės iš Ertmė. Trys iš šių arklių buvo papildomai imami į CARDIA, corpus ir dvylikapirštės žarnos taip pat.
Mėginių ėmimo procedūros vyko nuo rugpjūčio iki spalio negalėjo būti gautas 2007. Istoriniai duomenys apie ankstesnį sveikatai arklius.
Fluorescencinis In Situ hibridizacija bakterijų
dėl mikrobų aptikimo, audinių dalys buvo kryžminosi vienu metu su dviem 16S rRNR zondai paženklinti skirtingų fluoroforezės. Oligonukleotide zondas "S-D-BACT-0338-A-A-18 skirtos Bakterijos (5'GCTGCCTCCCGTAGGAGT3) [34] buvo 5 'lapeliai su fluoresceino izotiocijanato ir izotiocijanato išvestinių Cy3. Oligonukleotide zondas HEL717 orientacija Helicobacter genties (5'AGGTCGCCTTCGCAATGAGTA3 ") [35] buvo 5 'paženklinti izotiocijanato išvestinių Cy3. Norėdami patikrinti klonavimo Rezultatų trečią ir ketvirtą zondą, LC-gProt-1027-AA-17 (5'GCCTTCCCACATCGTTT3) orientacija 23s rRNR iš Gammaproteobacteria buvo 5 'lapeliai su fluoresceino izotiocianato ir zondas SG Enteroco-184 (5'CAAATCAAAACCATGCGG3 ) buvo Cy3 paženklinti orientacija 16S rRNR Enterococcus spp
[36]. Visi zondai susintetinti ne DNR technologijos, Aarhus, Danija. Skaidres buvo deparaffinized ksilene ir perkelti į 100% alkoholio, skirto 30 min prieš hibridizacijos. Hibridizacijos buvo atliktas 45 ° C su 40 ml hibridizavimo buferio (100 mmol Tris [pH 7,2], 0,9 M NaCl, 0,1% natrio laurilsulfatas) ir 200 ng kiekvieno zondo 16 valandų A Sequenza skaidrių padėklą (Thermo Shandon, Cheshire, Jungtinė Karalystė). tada mėginiai buvo plaunamos tris kartus, pašildyto (45 ° C) hibridizavimo buferyje 15 min, po to iš tris kartus, pašildyto (45 ° C) skalbimo tirpalo (100 mM Tris [pH 7,2], 0,9 M NaCl). Bandiniai buvo išplautas vandeniu, džiovinami ore ir montuojamas Vectashield (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, JAV) epifluorescenciniu mikroskopu. Axioimager M1 epifluorescenciniu mikroskopas įrengtas epifluorescenciniu su 100-W HBO lempos ir filtro nustato 43 ir 38 buvo naudojamas vizualizuoti Cy3 ir fluoresceino, atitinkamai. Vaizdai buvo gauti naudojant AxioCam MRM versija 3 FireWiremonocrome fotoaparatą ir programinė įranga AxioVision versija 4.5 (Carl Zeiss, Oberkochen, Vokietija).
Įvertinimas epifluorescenciniu mikroskopijos atliko aprašymas subjektyvaus suma, morfologinio išvaizdą ir vietą švytinčių ląstelių matyti kiekvieno audinio mėginį. Be to, visi audinių skyriai buvo tamsintas H & E ir vertinamos histopathologically
16S rDNR stiprinimas ir klonavimo
Po bakterijų naudojant FISH aptikti, buvo pasirinktos posistemės mėginiai iš arklių, įrodančių bakterijas įvairių morphologies už 16S rRNR geno. klonavimas. DNR buvo išskirta iš 4 audinių mėginių naudojant "Easy-DNR rinkinys (Invitrogen, Tastrup, Danija), pagal gamintojo instrukcijas. 16S rRNR genas buvo amplifikuotas naudojant pradmenis SD-BACT-0008-as-20 (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ') [37] ir S - * - Univ-1492-AA-19 (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') [38]. PGR dviračiu sudarė nuo pradinės denatūruojant 94 ° C temperatūroje 6 min; o po to 30 ciklų denatūruojant 94 ° C temperatūroje 30 S, atkaitinimo 55 ° C temperatūroje 45 s ir pratęsimo esant 72 ° C temperatūroje 2 min; ir galutinis išplėtimas 72 ° C temperatūroje 3 min. Amplifikuotos DNR, kuri yra tikrinama elektroforezės agarozės gelyje. PGR produktai buvo išvalytas taikant QIAquick PGR valymo rinkinys stulpelius (Qiagen GmbH, Hilden, Vokietija). Norėdami sukurti bukas-baigėsi DNR tokia buvo sumaišyti 0,5 ml mikrocentrifugoje vamzdis, 4 įxL 5 × T4 DNR polimerazės buferio, 14,7 įxL išgryninto PGR produkto 0,8 įxL dNTP (2,5 mmol l -1 kiekvienas) ir 0,5 mikrol (1,2 V), skirtų T4 DNR polimerazės (Invitrogen) ir inkubuojama 12 ° C temperatūroje 15 min. T4 DNR polimerazė buvo šilumos-inaktyvuota, ir bukus baigėsi DNR buvo gryninamas naudojant QIAquick PGR valymo komplektas stulpelių (Qiagen GmbH "), ir išplaunami galutinis tirpalo tūris būtų 10 pL du kartus distiliuotu vandeniu. Pagal gamintojo aprašymo klonavimas buvo atliktas naudojant nulio bukas Topo klonavimo rinkinį (Invitrogen). Dešimt kolonijos iš kiekvienos klonavimo buvo nuskintos ir sekos ant automatinio sekos analizatoriumi (ABI PRISM 373 DNR sekos; PE Biosystems Foster Miestas, CA, JAV), naudojant dvi standartines vektorinę pradmenis (T3 ir T7) įtraukta į rinkinį. Seka buvo surinkti Bionumerics versija 4.0 (Taikomosios matematikos, Sint-Martens-Latem, Belgija) ir tikrinama chimerų ir sprogdinimo atskirus sekas GenBank http:.... //Www ncbi NLM NIH GOV ir programinės įrangos smailiauodegės antys versija 1.1 http:... //www Cardiff AC UK /biosi /tyrimai /biosoft /. Filogenetinė analizė klonų priklausančių Escherichia
genties buvo padaryta atsisiųsti 16S rRNR geno sekų ilgiau nei 1200 bp iš KPP V.9 duomenų bazėje Escherichia
padermes http: //. KPP CME . MSU. edu ". Sekos buvo apipjaustyta to paties ilgio 1327 bp ir suderinti Porinis (UPGMA), po pasaulio sekai derinimą. Galutinis Filogenetinė medis buvo apskaičiuota naudojant Ward algoritmą, kur Enterobacter sakazakii
(AB004746) buvo naudojamas kaip outgroup.
Deklaracijos
Padėka
Autoriai norėtų padėkoti Hanne H. Møller, Katja Kristensen ir Johanna Z Amenuvor techninei pagalbai laboratorijose. Taip pat dėka Stina Vesterholm už pagalbą rinkti audinius. Šis darbas buvo remiamas Kongeriget Danmark anketa Horseinsurance g /s ir Intervet Danijoje. Rėmėjai neturėjo dalyvavimą praktinėje dalyje ar išvadų šio tyrimo.
Autorių originalios pateikti failai vaizdų
Žemiau išvardintos nuorodos į autorių originalus pateiktų failų vaizdų. 12866_2009_1040_MOESM1_ESM.tiff Autorių originalus failas 1 pav 12866_2009_1040_MOESM2_ESM.tiff Autorių originalus failas 2 pav 12866_2009_1040_MOESM3_ESM.pdf Autorių originalios 3 pav 12866_2009_1040_MOESM4_ESM.tiff Autorių originalaus failo 4 pav 12866_2009_1040_MOESM5_ESM.tiff Autorių originalaus failo 5 paveiksle 12866_2009_1040_MOESM6_ESM.jpeg Autorių originalus failas 6 pav

• Steigimas ir identifikavimas triušio modelio peritoninės karcinomatoze nuo skrandžio vėžio
• NE sukeltos judrumas poveikį skrandžio dugno ir fazė prievartyje iš sGCβ1his105phe mutantas pelėmis