O exame de lesões no estômago glandular equinos para bactérias Helicobacter spp, incluindo por hibridização fluorescente in situ

Exame de lesões glandulares do estômago de eqüinos para bactérias, incluindo Helicobacter spp
por fluorescência in situ
hibridação da arte abstracta
Fundo
O estômago glandular equina é comumente afetada pela erosão e ulceração. O objetivo deste estudo foi avaliar se as bactérias, incluindo Helicobacter, poderiam estar envolvidos na etiologia das lesões glandulares gástricos observados em cavalos.
Resultados
lesões do estômago, bem como mucosa aparecendo do normal foram obtidos de cavalos abatidos para consumo humano. Todas as amostras foram testadas para a actividade da urease usando o Pyloritek ® ensaio, enquanto o conteúdo bacteriano das mucosas foi avaliada utilizando fluorescência A hibridação in situ
. Na sub amostras selecionadas, caracterização de bactérias foi aprofundada por clonagem e sequenciação. As lesões mucosas foram encontrados em 36/63 estômagos e incluiu rugae hiperplásico, estruturas polipóides e erosões focais. Nenhuma das amostras foram testadas para a actividade da urease positiva ou por FISH utilizando a sonda específica do género Helicobacter. Em amostras de lesões, bem como amostras normais, clones com 99% de semelhanças com Lactobacillus salivarius Comprar e Sarcina ventrículos
foram encontrados. Escherichia
como clones bactéria e clones de Enterococcus foram demonstrados em uma erosão focal. Com base em uma árvore filogenética destes clones teve 100% de similaridade com Escherichia fergusonii e Enterococcus faecium
. O Enterococcus foram encontrados colonizando a superfície da mucosa, enquanto E. fergusonii
organismos também foram demonstrados intraepitelial.
Conclusão
gástrica Helicobacter spp. não puderam ser verificados como estando envolvidos em lesões do estômago glandular do cavalo. Desde E. fergusonii
tem sido descrito como um patógeno emergente em ambos os seres humanos e animais, a descoberta desta bactéria em warrants erosão gástrica mais esclarecimentos sobre se a infecção gástrica com este tipo de bactéria é importante para cavalos.
Fundo
em cavalos, as lesões da parte não-glandular do estômago são altamente prevalentes e parece ser causada pela exposição excessiva de ácido [1], mas pouco tem sido descrito em relação a lesões na parte glandular. Lesões localizadas na região glandular foram demonstrados em 58% dos 162 cavalos hospitalizados [2] e em 47% dos 345 cavalos de corrida [3] e, enquanto a causa destes não têm recebido muita atenção, exposição ácida não parece ser o principal fator , como não houve correlação entre as lesões das duas regiões do estômago foi encontrado [3].
bactérias gástricas como a causa para as lesões do estômago glandular têm sido sugeridas para muitas espécies animais e em seres humanos estes constituem um importante factor de risco verificado. Dos organismos encontrados gástricas, Helicobacter pylori foi descrito
mais, devido ao seu potencial patogénico de induzir gastrite, úlceras crónicas, adenocarcinomas e (MALT) mucosa tecido linfóide associado em seres humanos [4-6]. As bactérias deste género também foram encontrados em amostras de tecido gástrico a partir de animais, incluindo cães, porcos, carneiros e gado [7-10].
No cavalo, sai evidências contraditórias quanto ao facto de as bactérias que podem causar especificamente ocorrer lesões gástricas. Alguns estudos têm indicado que a Helicobacter gástrica spp
. estão presentes na mucosa aparentemente normal usando PCR e imunoquímica [11, 12], enquanto outros não encontraram nenhuma evidência de uma ligação entre a presença de lesões e bactérias [13]. Como espécies bacterianas gástricas foram confirmados ou sugerido como parte da patogénese de certos tipos de patologias gástricas em seres humanos e outras espécies animais, o objectivo deste estudo foi avaliar se as bactérias podem estar envolvidos na patologia observada no estômago glandular equinos. Um foco principal foi o de fornecer mais evidências sobre a presença e localização de bactérias em geral ao nível da mucosa do estômago glandular equina. Ênfase especial foi colocada sobre a obtenção de informações sobre a presença e participação de todos os Helicobacter espécies
nas lesões das mucosas. A fluorescência in situ
hibridação (FISH) foi utilizado para este fim, que permite que a utilização de sondas de rRNA segmentados, tanto para a população bacteriana total e definidos género /espécie. Esta abordagem permite a determinação da morfologia bacteriana, abundância, localização nos tecidos, e até mesmo indicações sobre as taxas de crescimento e de atividades fisiológicas [14].
Resultados
lesões glandulares brutas foram observadas em 36 dos 63 estômagos examinados (57,1 %). A maioria das lesões foram vistos na região do antro (91,7%). Em seis estômagos, as lesões foram adicionalmente ou exclusivamente visto na região da cárdia ou corpus. Não havia lesões no duodeno
As lesões foram classificadas em três grupos como:. Polypous (2 estômagos com massas polipóides localizados tanto na cárdia e do antro com tamanhos entre 1 e 5 centímetros de diâmetro), ii: rugae Hyperplastic lesões (13 estômagos) ou III:. Hyperaemic, erosivas ou ulcerativas lesões, que foram observados em 21 estômagos
o rugae hiperplásica foram todos vimos no antro e variou de ter intensa hiperemia com exsudado rugas com aspecto normal da superfície da mucosa. espessamento bruto da rugae antro foi causada principalmente por hiperplasia da foveolae gástrica em comparação com as respectivas amostras normais. As lesões restantes foram todos encontrados para ser pequenas lesões solitárias de não mais do que cerca de 1 × 2 cm de tamanho. áreas focais de gastrite erosiva foram os achados mais comuns destas lesões do tipo e caracterizada como descamação das células superficiais do epitélio luminal com um exsudato fibrino concorrente, restos celulares luminal e um infiltrado celular predominantemente mononuclear da lâmina. erosões mais profundas encontrados em 9 de estômagos corroído tanto na região dos poços gástricos e partes das glândulas, que foi observado com gastrite única dos tecidos imediata. Uma verdadeira úlcera foi encontrado que se estende a toda a espessura da lâmina, expondo as lamina muscularis para o lúmen. Um máximo de duas lesões foram encontradas em cada um desses estômagos.
Teste de Helicobacter e Produção de urease
Usando a sonda específica do género Helicobacter há sinais positivos foram encontrados em nenhuma das amostras de tecido 79 (36 amostras pareadas e 7 controles) . De acordo com estes resultados do peixe, nenhuma das amostras testaram positivo para a actividade da urease também. controles internos de todos os testes de urease foram positivos como a indicação de um kit de teste funcional.
Bactérias no
geral Em geral, apenas algumas bactérias foram observadas relacionada à superfície da mucosa em ambos os feridos, bem como no estômago saudável amostras. No geral, quatro tipos diferentes morfológicas das células bacterianas pode ser visualizado com a sonda Eubacteria: 1), pequenas curtos (0,2-0,5 uM), varetas cocóide 2) distintas hastes (1 x 3 mm), 3) varetas de cadeia longa (até 60 mm) ou 4) grandes (2-3 diâmetro mm) bactérias cocóide claramente dividindo em pares. Tipicamente, quando presente, as bactérias foram observados em grupos associados a partículas alimentares ou localizado próximo à superfície da mucosa
Evidência de gastrite bacteriana foi encontrado no estômago uma lesão grosseiramente caracterizadas como uma erosão solitária, 1 x 2 cm de tamanho, o centro sendo hyperaemic e rodeado por um rebordo epitelial proliferativa (Fig. 1). Microscopicamente, erosão focal da mucosa com exsudação de eritrócitos e leucócitos, principalmente de origem neutrofílica, foi visto. Os exsudados foram adicionalmente visto nos poços gástricos. Uma reacção inflamatória celular com células mononucleares foi visto que se prolonga tão profunda como a muscularis em lâmina. A superfície da mucosa inflamada e os poços gástricas foram encontrados muito colonizado por cocóide de hastes curtas aplicar a sonda para as bactérias em geral (Fig. 2). As hastes curtas foram observadas principalmente infiltrando a erosão. Eles também foram observadas intracelular em células epiteliais, bem como dentro de granulócitos neutrófilos. A colonização bacteriana do estômago estava restrita à lesão uma vez que não foram observadas bactérias na amostra correspondente mucosa sã. Figura 1 lesão erosiva Focal (seta branca) demonstrando gastrite bacteriana na avaliação histológica. Lesão era aproximadamente 2 × 2 cm, localizada no antro perto da entrada do piloro.
Figura 2 mucosa gástrica com gastrite erosiva associada com bactérias. A superfície mucosa e detritos celulares adjacente é severamente colonizada por bactérias (vermelho). Algumas bactérias são vistas intracelular no epitélio intacto (ponta de seta), bem como no interior das células epiteliais degeneradas e necróticas (seta). Além disso, as bactérias são encontrados dentro de granulócitos. Hibridização fluorescente in situ com a sonda alvo bactérias, conjunto de filtros 43, bar = 25 um.
Clonagem e sequenciamento
Com base na morfologia e intensidade de bactérias demonstrada utilizando FISH, foram selecionados sub-amostras das amostras C /C para clonagem e sequenciação de representar amostras incluindo aquele com gastrite bacteriana.
das subamostras escolhidos de estômagos demonstrando várias morfologias bactérias, dois tipos diferentes de clones foram encontrados em amostras de mucosa aparecendo do normal (amostras c), um clone tinha 99% de similaridade para Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AB370881) e o outro tipo de clones tinha 99% de semelhança com Sarcina ventrículos
DSM 316 (X76650).
das lesões (amostras C), clones também foram encontrados com 99 % de semelhança com Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AF182725). A partir da mucosa com gastrite bacteriana, quatro dos dez clones combinado 100% Enterococcus faecium
, enquanto os restantes seis clones (sequência obtida depositado no GenBank com a adesão não. GQ423062) pertencia a uma Escherichia como
bactéria. Uma árvore filogenética foi construída com a seis Escherichia
como clones de lesão e todos tiveram 100% de similaridade com as estirpes do tipo de ambos E. fergusonii Comprar e Shigella flexneri
(fig 3). Aplicando uma sonda específica Proteobacteria gama das hastes curtas que se infiltram no epitélio, bem como intracelular encontrados dentro de granulócitos neutrófilos, foram verificados como a Escherichia
como bactéria Enterococcus faecium enquanto
organismos foram identificados colonizando a superfície epitelial pela sonda específica Enterococcus (Fig 4 e 5). Figura 3 Uma árvore filogenética de rRNA 16S similaridade de sequência de genes, que mostra a posição dos seis clones que pertencem a Gammaproteobacteria encontrado no cavalo 50L e as estirpes do tipo mais proximamente relacionados que pertencem ao género Escherichia. Os seis clones (acc.no. GQ423062) tiveram 100% de semelhança com Shigella flexneri Comprar e E. fergusonii
. Enterobacter sakazakii (AB004746) foi utilizado como um grupo externo. números de acesso sequência são apresentados.
Figura 4 mucosa gástrica do cavalo 50L com gastrite erosiva associada a bactérias. A aplicação de uma sonda marcada com fluoresceína para Gammaproteobacteria e uma sonda marcada com Cy3 para Enterococcus, uma E. coli como organismo
(verde) (ponta de seta) foi encontrado intracelular no interior das células epiteliais e na superfície epitelial enquanto que E. faecium (vermelho) ( ' estrela branca '(somente colonizaram a superfície epitelial. Filtro definir 43/38, bar = 10 mm.
Figura 5 mucosa gástrica de 50L cavalo com gastrite erosiva associada a bactérias. ampliação elevada demonstrando E. coli
como hastes ( verde) dentro das células epiteliais extrudados. hibridização fluorescente in situ com a sonda alvo Gammaproteobacteria, conjunto de filtros 38, bar = 10 mm.
Discussão
estudos anteriores envolvendo o estômago eqüino ter usado, por exemplo PCR para o gene 16S rRNA de especial Helicobacter
spp. [12]. as desvantagens usando PCR são de que a quantidade e localização das bactérias não é conhecido e é incerto se as bactérias estão vivas ou mesmo se o DNA está nu. Por isso, decidiu-se que utilizando a técnica FISH iria proporcionar um melhor e mais informações das bactérias encontradas no estômago glandular do cavalo, uma vez que estes problemas são superados com esta técnica. Esta técnica tem sido utilizada anteriormente para descrever a distribuição espacial da Helicobacter
spp. no tracto gastrointestinal de cães e no estômago de cavalos saudáveis ​​para demonstrar a microbiota da mucosa escamosa e glandular aparentemente normais [15, 16]. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo utilizando FISH para examinar lesões do estômago glandular.
No presente estudo um caso de gastrite associada a colonização bacteriana foi revelado. Especialmente a distribuição de bactérias sugeriu uma conexão com a patologia observada. A quantidade de bactérias foi marcadamente aumentada em torno da lesão e foram firmemente aderido às células epiteliais, com as bactérias que se estendem para as criptas e intracelular localizada. A clonagem mostrou que era uma infecção dupla com Enterococcus faecium
e um Escherichia
como bactéria, mas foi posteriormente verificada usando o in situ
hibridação com um proteobactérias gama sonda que era apenas a Escherichia
como bactéria que se infiltraram as ulcerações superficiais e foram encontrados intracelular em células epiteliais e dentro de granulócitos neutrófilos. infecção Enterobacterial no intestino é um fenômeno comum, mas é raro encontrar estas infecções no estômago e que nunca antes foi relatada em equinos adultos. Este resultado é muito intrigante, mas mais estudos preciso esclarecer o quão comum este fenómeno está em cavalos. Além disso, se este tipo de infecção é de origem primária ou secundária iria precisar de mais esclarecimentos. A Escherichia
como clones todos tiveram 100% 16S rRNA similaridade genética para ambos E. fergusonii Comprar e Shigella flexneri
. Assim, no presente estudo, não se pode precised experimentalmente qual destes dois organismos que estavam presentes nessa lesão glandular. No entanto, os seres humanos têm sido referidos como sendo o único hospedeiro natural para Shigella
[17] enquanto que E. fergusonii
tem sido associada a uma grande variedade de infecções intestinais e extra-intestinais de seres humanos e animais, incluindo cavalos [18 , 19]. Por isso, é mais provável que a Escherichia
como bactéria encontrada neste estudo pertence a E. fergusonii
. Estudos relataram E. fergusonii
como um patógeno emergente e associados com bacteriémia e especialmente infecção da ferida, mas o seu papel preciso em infecções em seres humanos e animais que ainda tem de ser esclarecida [20].
Microbiologia nas amostras
o ambiente no estômago glandular é geralmente muito hostil para microorganismos [21]. Está bem estabelecido que, ao contrário de seres humanos e cães que são alimentadores refeição, os cavalos são produtores de ácido contínuos, provavelmente devido a um padrão de alimentação contínua [22, 23]. O pH na parte ventral do estômago equino é estável a cerca de pH 1-3 durante todo o período de 24 horas [24], consequentemente, a baixa diversidade relativa de bactérias observadas em amostras de mucosa neste estudo não foi inesperado.
A característica fenótipo morfológico de grande cocos crescendo em tetrads regulares foi criado para ser um clone com uma similaridade de 99% a Sarcina ventrículos
. Este organismo é conhecido por ser capaz de crescer no conteúdo do estômago e tem a estrutura característica Tetrade quando cultivadas a partir de pH de pH 1- 3 [25]. No presente estudo, não foi possível estabelecer a conclusão de que esses organismos possam ser parte de qualquer patologia específica, uma vez que foram encontrados em números baixos nas amostras emparelhadas (i.e. lesão e normal), bem como nas amostras de controlo. bactérias Sarcina semelhantes foram encontrados em uma variedade de espécies, onde foram supostamente para causar abomasal inchaço, hemorragias e úlceras em cordeiros e cabritos [26, 27] e uma possível ligação com dilatação gástrica em cães e cavalos também tem sido sugerido [28]. Não há provas de acumulações de gás foi observada macroscopicamente em qualquer destes cavalos e, portanto, não parece que a presença de Sarcina ventriculi
contribuiu para a patologia observada nestes cavalos.
Não foi surpreendente que o Lactobacillus (Lactobacillus salivarius
) foi encontrado nos tecidos estudados e foi anteriormente relatado que vários Lactobacillus
spp., incluindo L. salivarius
, estão presentes em cavalos saudáveis ​​[16, 29]. As funções proximais equinos estômago como armazenamento para alimentos para animais, bem como um compartimento para a fermentação intragástrica. O ecossistema nesta região consiste de bactérias anaeróbias e utilizando-lactato em grandes números, que são responsáveis ​​pelo aumento em ácidos gordos voláteis mediante fermentação de hidratos de carbono [30]. Especialmente lactobacilos foram encontrados aderindo ao epitélio na parte proximal do estômago equina [31] e estas bactérias provavelmente vai passar para o estômago glandular como parte do turn-over normal. Nós só examinaram subamostras e taxa mais bacteriana será encontrado na parte saudável do estômago glandular se um estudo mais abrangente comunidade microbiota foi feito.
Validade das conclusões de Helicobacter
Nenhuma das amostras de tecido do antro região demonstrou sinais positivos do Helicobacter spp
. sondar neste estudo e nenhuma bactéria em forma de espiral foram observadas utilizando a técnica de FISH também. Em um estudo recente da Venezuela, bactérias em forma de espiral foi relatada em biópsias da região cardíaca do estômago eqüino manchada com a mancha Warthin-Starry [12]. Helicobacter spp
. conhecido por ser capaz de colonizar o estômago produzir grandes quantidades de urease citoplasmática [32] O teste da urease utilizado nesta investigação, Pyloritek ®, detecta a actividade da urease de a amostra de tecido pela produção de amoníaco quando a ureia está presente. É amplamente utilizado na prática humana para detectar a gastrite causada pelo Helicobacter spp
. Os valores preditivos positivos e negativos foram entre 98,1-100% e 95,8-100%, respectivamente, em um estudo testando pacientes humanos antes e depois da erradicação da bactéria [33]. Neste estudo, não houve testes positivos foram encontradas, indicando que as biópsias no presente estudo não continha bactérias com a capacidade de produzir urease.
Conclusões
gástrica Helicobacter
spp. não foi encontrada e não podia ser ligada às lesões no estômago dos 36 cavalos analisadas neste estudo. A patologia encontrada neste estudo incluiu estruturas polipóides, rugae hiperplásico e pequenas erosões, mas o envolvimento de bactérias foi encontrado em apenas um caso de uma erosão. Neste lesão, um clone de Escherichia, como, provavelmente E. fergusonii
, foi encontrado intracelular. Se isso era uma infecção primária ou secundária não pôde ser concluído. quantidades muito limitadas de bactérias, em geral, foram encontrados na região glandular equinos como esperado. Assim, a detecção de uma moderada a quantidades elevadas de qualquer bactéria ao nível da mucosa glandular, bem como nas criptas deve ser motivo de preocupação, isto não parece ser um sinal normal no estômago glandular equinos. Novos estudos envolvendo bactérias e a relação com lesões gástricas de cavalos com sinais clínicos confirmados são garantidos, uma vez que estes cavalos não foram incluídos no estudo atual.
Métodos
Cavalos e desenho do estudo
O estudo foi feito como um estudo transversal de estômagos de uma população de 63 cavalos de abate na Dinamarca. Cavalos foram aprovados pelo Serviço Veterinário tão saudável para o abate. Os cavalos foram atordoados com um dardo cativo e sangrados. O estômago, incluindo 5 - 10 cm do esôfago distal e 10 cm do duodeno proximal, foi removida imediatamente após a evisceração e abriu ao longo da curvatura maior. Ingesta foram removidos e, se necessário, a mucosa foi suavemente enxaguado com um mínimo de água da torneira antes da inspecção. Somente estômagos com lesões graves na mucosa glandular foram incluídos, bem como sete estômagos de controle sem evidência bruta de lesões gástricas.
Lesões glandulares foram definidos como a mucosa ter um aspecto macroscópico anormal ou seja hyperaemic, aumento da espessura, erosões ou úlceras . As posições anatômicas das lesões foram notadas como: O cárdia, corpus ou antro região (Fig. 6). Figura 6 regiões anatômicas do estômago aberto ao longo da curvatura maior. A região não-glandular tem um epitélio que aparece branca, ao passo que a região glandular é tons de vermelho. Eles são separados pelo Margo plicatus
. As três regiões amostradas incluem: Cardia como a pequena área tira um pouco abaixo e ao longo da margo plicatus
, a região do corpus contendo ácido, pepsinogen e muco glândulas secretoras (vermelho escuro) e na região do antro contendo muco primarly e glândulas secretoras de gastrina.
procedimento de amostragem
de cada estômago com lesões glandulares, três amostras de tecidos onde obtidos da maior lesão (a, b, C), bem como três emparelhado amostras de tecidos normais aparecendo (a, b, c) a partir da mesma região anatómica, mas, pelo menos, pelo menos, 5 cm de distância. A /a:, um tamanho pequeno de biópsia (0,5 × 0,5 cm) de uma amostra de mucosa foi obtido para o teste da urease imediato com o Pyloritek ® ensaio de acordo com as instruções do fabricante. Os testes foram lidos após 60 minutos de tempo padrão e os resultados anotados como positivo ou negativo. As amostras B /b: uma amostra de tecido de espessura total de 3 x 3 cm incluindo a mucosa e submucosa foram obtidos para os peixes e fixada em formalina a 10% tamponada. . Após 24 horas de fixação as amostras foram transferidas para 70% de etanol, embebidas em parafina, seccionadas a 3 um e montados em SuperFrost /Plus Slides (Menzel-Glaser, Braunschweig Alemanha)

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