Undersøkelse av equine glandular magen lesjoner for bakterier, inkludert Helicobacter spp ved fluorescens in situ hybridisation

undersøkelse av hest glandular magen lesjoner for bakterier, inkludert Helicobacter spp
av fluorescens in situ
hybridisering
Abstract
Bakgrunn
The equine kjertelmagen er ofte påvirket av erosjon og sårdannelse. Hensikten med denne studien var å vurdere om bakterier, inkludert Helicobacter, kan være involvert i etiologien av mage glandular lesjoner sett i hester.
Resultater
mage lesjoner, samt normalt utseende slimhinnen ble hentet fra hester slaktet for konsum. Alle prøvene ble testet for urease-aktivitet ved hjelp av Pyloritek ® assay, mens slimhinnebakterieinnhold ble evaluert ved hjelp av fluorescens in situ
Hybridisering. I utvalgte underprøver, ble bakteriene karakterisering forfulgt videre ved kloning og sekvensering. Slimhinnere ble funnet i 36/63 mager og inkludert hyperplastic rugae, polypoid strukturer og fokal erosjon. Ingen av prøvene ble testet positivt for urease-aktivitet eller for FISH hjelp av Helicobacter slekten spesifikk probe. I prøver av lesjoner, samt normale prøver, kloner med 99% likheter med Lactobacillus salivarius Hotell og Sarcina ventriculi
ble funnet. Escherichia
like bakterien kloner og Enterococcus kloner ble demonstrert i en samlings erosjon. Basert på en fylogenetisk tre disse klonene hadde 100% likhet til Escherichia fergusonii og Enterococcus faecium
. Den Enterococcus ble funnet kolonisere slimhinneoverflaten, mens E. fergusonii
organismer ble også demonstrert intraepitelial.
Konklusjon
Gastric Helicobacter spp. kunne ikke bli verifisert som blir involvert i lesjoner i kjertelmagen av hesten. Siden E. fergusonii
har blitt beskrevet som en ny patogen hos både mennesker og dyr, funn av denne bakterien i mage erosjon warrants nærmere avklaring på om mageinfeksjon med denne type bakterie er viktig for hester.
Bakgrunn
i hester, lesjoner i den ikke-kjertel del av magesekken er svært utbredt og synes å være forårsaket av overdreven syreeksponering [1], men lite er blitt beskrevet av lesjoner i kjertel del. Lesjoner lokalisert i kjertel regionen ble påvist i 58% av 162 innlagte hester [2] og i 47% av 345 veddeløpshester [3] og mens årsaken til disse ikke har fått mye oppmerksomhet, syreeksponering ser ikke ut til å være den primære faktor , da ingen korrelasjon mellom lesjoner av de to regionene i magen blitt funnet [3].
Gastriske bakterier som årsak for kjertelmagen lesjoner er blitt foreslått for mange dyrearter og hos mennesker disse utgjør en vesentlig verifisert risikofaktor. Av de gastriske organismer ble funnet, har Helicobacter pylori
blitt beskrevet den mest på grunn av sin sykdomsfremkallende potensiale til å indusere kronisk gastritt, magesår, adenokarsinomer og mukosa-assosiert lymfoidvev (MALT) lymfom hos mennesker [4-6]. Bakterier av denne slekten er også blitt funnet i mage vevsprøver fra dyr, inkludert hunder, griser, sauer og kveg [7-10].
I hest, går motstridende bevis med hensyn til om bakterier som spesifikt kan forårsake gastriske lesjoner forekomme. Noen studier har indikert at mage Helicobacter spp
. er tilstede i normal slimhinne vises ved hjelp av PCR og immunkjemi [11, 12], mens andre har ikke funnet bevis for en sammenheng mellom tilstedeværelsen av lesjoner og bakterier [13]. Som mage bakteriearter er blitt bekreftet eller foreslått som en del av patogenesen av visse typer mage patologi hos mennesker og andre dyrearter, er målet med denne studien var å vurdere om bakterier kan være involvert i patologi observert i hestens kjertelmagen. Et hovedfokus var å gi mer bevis om tilstedeværelse og lokalisering av bakterier generelt på slimhinnene nivå av hestens kjertelmagen. Spesiell vekt ble lagt på å skaffe informasjon om tilstedeværelse og involvering av alle Helicobacter arter
i slimhinnelesjoner. Fluorescensen In situ
hybridisering (FISH) teknikk som ble benyttet for dette formål, som tillater bruk av rRNA-målrettede prober for både den totale bakterielle populasjonen og definerte genus /arter. Denne tilnærmingen tillater bestemmelse av bakterie morfologi, overflod, plassering i vev, og til og med indikasjoner på vekst og fysiologiske aktiviteter [14].
Resultater
Brutto kjertel lesjoner ble sett i 36 av de 63 magene undersøkt (57,1 %). De fleste av lesjoner ble observert i antrum region (91,7%). I seks mager, ble lesjoner i tillegg eller utelukkende sett i Cardia eller corpus regionen. Ingen lesjoner ble funnet i tolvfingertarmen
Forandringene ble klassifisert i tre grupper som:. Polypous (2 magene med polypoid massene som ligger i både Cardia og antrum med størrelser mellom 1 og 5 centimeter i diameter), ii: Hyperplastisk rugae lesjoner (13 mager) eller III:. Hyperaemic, erosive eller ulcerøs lesjoner, som ble sett i 21 mager
hyperplastisk rugae ble alle sett i antrum og varierte fra å ha intens hyperemia med sårvæske til rugae med normalt vises slimhinneoverflaten. Gross fortykning av antrum rugae ble forårsaket først og fremst ved hyperplasi av gastriske foveolae i forhold til de respektive normale prøver. De resterende lesjoner ble alle funnet å være små ensomme lesjoner av ikke mer enn ca 1 × 2 cm i størrelse. Fokusområder av erosiv gastritt var de vanligste funnene i disse type lesjoner og karakteriseres som sloughing av overfladiske celler av luminal epitel med en samtidig fibrinopurulent sårvæske, luminal cellerester og en overveiende mononukleære celle infiltrere av lamina propria. Dypere erosjoner funnet i 9 mager erodert både regionen av mage groper og deler av kjertler, som ble observert med gastritt eneste av de umiddelbare vev. En sann sår ble funnet som strekker seg i hele tykkelsen av lamina propria, utsette lamina muscularis til lumen. Maksimalt to lesjoner ble funnet i hver av disse magene.
Helicobacter og Urease-aktivitet test
Ved hjelp av slekten Helicobacter spesifikke sonde ikke noen positive signaler ble funnet i noen av de 79 vevsprøver (36 parede prøver og 7 kontroller) . I samsvar med disse resultatene av fisken, ingen av prøvene testet positivt for urease-aktivitet enten. Intern kontroll i alle urease tester ble funnet positive som indikasjon på en funksjonell test kit.
Bakterier generelt
generelt bare ble observert beslektet par bakterier til slimhinnen i både de skadde så vel som i den friske magen prøver. Totalt fire morfologiske ulike typer bakterieceller kan bli visualisert med eubacteria probe: 1) små, korte (0,2-0,5 mikrometer) coccoide stenger, 2) forskjellige stenger (1 × 3 mm), 3) langkjedete stenger (opptil 60 um) eller 4) store (2-3 um diameter) coccoide bakterier klart dele i par. Vanligvis når den er tilstede, bakterier ble observert i klynger forbundet med forpartikler eller ligger i nærheten av den mukosale overflaten
Bevis for bakteriell gastritt ble funnet i magesekken en lesjon grovt karakterisert som en enslig erosjon, 1 x 2 cm i størrelse, da sentrum befinner seg hyperaemic og er omgitt av en proliferativ epitel kant (fig. 1). Mikroskopisk, focal erosjon av slimhinnene med oser av erytrocytter og leukocytter, hovedsakelig av nøytrofil opprinnelse, ble sett. Eksudater ble også sett i mage groper. En cellulær inflammatorisk reaksjon med mononukleære celler ble sett som strekker seg så dypt som til lamina muscularis. Overflaten av den betente slimhinnen og de gastriske gropene ble funnet tungt kolonisert av kokkoid til korte stenger påføring av sonden for generelle bakterier (fig. 2). De korte stenger ble spesielt observert infiltrere erosjon. De ble også observert intracellulær i epitel-celler, så vel som i løpet av neutrofile granulocytter. Den bakteriekolonisering av magen var begrenset til lesjonen som ingen bakterier ble observert i de tilsvarende friske mucosa prøven. Figur 1 Focal erosive lesjon (hvit pil) viser bakteriell gastritt ved histologisk evaluering. Lesjon var ca 2 x 2 cm og ligger i antrum nær pyloriske inngangen.
Figur 2 mageslimhinnen med erosiv gastritt assosiert med bakterier. Slimhinnen og tilstøtende cellerester er sterkt kolonisert av bakterier (rød). Noen bakterier er sett intracellulært i det intakte epitel (pilspiss) samt innenfor degenererte og nekrotiske epitelceller (pil). I tillegg er bakterier innenfor granulocytter. Fluorescerende in situ hybridisering med sonden rettet mot bakterier, filtersett 43, bar = 25 mikrometer Kloning og sekvensering
Basert på morfologien og intensiteten av bakterier påvises ved hjelp av FISH.
, Delprøver av C /C-prøver ble valgt for kloning og sekvensering av representerer sampler blant annet en med bakteriell gastritt.
av de valgte delprøver av magene som viser forskjellige bakterier morfologi, ble to forskjellige typer av kloner som finnes i normalt utseende slimhinne prøver (c prøver), en klon hadde 99% likhet til Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AB370881) og den andre typen kloner hadde 99% likhet til Sarcina ventriculi
DSM 316 (X76650).
fra lesjoner (C prøver), ble kloner også funnet med 99 % likhet med Lactobacillus salivarius
JCM 1231 (AF182725). Fra slimhinnene med bakteriell gastritt, fire av ti kloner matchet 100% Enterococcus faecium
, mens de resterende seks klonene (oppnådd sekvens deponert ved GenBank med aksesjons no. GQ423062) tilhørte en Escherichia som
bakterie. En fylogenetisk tre ble konstruert med seks Escherichia
like kloner fra lesjonen og alle hadde 100% likhet med typen stammer av både E. fergusonii Hotell og Shigella flexneri plakater (fig 3). Påføre et gamma Proteobacteria spesifikk probe de korte stengene som trenger ned til epitel, samt funnet intracellulært innenfor neutrofile granulocytter, ble verifisert som Escherichia
som bakterie mens Enterococcus faecium
organismer ble identifisert kolonisere den epiteliale overflate av det Enterococcus spesifikk probe (fig 4 og 5). Figur 3 A fylogenetisk tre av 16S rRNA-genet sekvenslikhet, som viser stillingen av de seks kloner som tilhører Gammaproteobacteria som finnes i heste 50L, og de mest beslektede typen stammer tilhørende slekten Escherichia. De seks kloner (acc.no. GQ423062) hadde 100% likhet med Shigella flexneri Hotell og E. fergusonii
. Enterobacter sakazakii (AB004746) ble brukt som en utgruppe. Sequence tiltredelses tallene er presentert.
Figur 4 Gastric slimhinnene hest 50L med erosiv gastritt assosiert med bakterier. Påføring av et fluorescein-merket probe for Gammaproteobacteria og en Cy3 merket probe for Enterococcus, en E. coli-
like organismen (grønn) (pilspiss) ble funnet intracellulært i epitelceller og på den epiteliale overflate, mens E. faecium (rød) ( ' hvit stjerne "(bare koloniserte epithelial overflaten. Filter satt 43/38, bar = 10 mikrometer.
Figur 5 Gastric slimhinnene hest 50L med erosiv gastritt assosiert med bakterier. Høy forstørrelse demonstrere E. coli
som stenger ( grønn) innen ekstruderte epitelceller. Fluorescent in situ hybridisering med sonden målretting Gammaproteobacteria, filter satt 38, bar = 10 mikrometer.
diskusjon
Tidligere studier som involverer hestens mage har eg brukt PCR rettet mot 16S rRNA-genet av spesielt Helicobacter
spp. [12]. ulempene ved hjelp av PCR er at mengden og plasseringen av bakteriene ikke er kjent, og det er usikkert hvorvidt bakteriene er i live, eller selv om den DNA er naken. Derfor ble det bestemt at bruk av FISH teknikk ville gi bedre og mer informasjon om de bakterier som finnes i kjertelmagen på hesten, så disse problemene er overvunnet med denne teknikken. Denne teknikken har blitt brukt tidligere for å beskrive den romlige fordelingen av Helicobacter spp
. i mage-tarmkanalen hos hunder og i magen hos friske hester å demonstrere den bakterieflora av den normale vises plateepitel og kjertel mukosa [15, 16]. Så langt vi kjenner til er dette den første studien bruker FISH å undersøke lesjoner i kjertelmagen.
I denne studien ett tilfelle av gastritt assosiert med bakteriell kolonisering ble avslørt. Spesielt fordelingen av bakterier foreslått en forbindelse med patologien observeres. Mengden av bakterier ble markert øket rundt lesjonen, og ble tett festet til epitelceller, med bakterier som strekker seg inn i kryptene og lokalisert intracellulært. Kloning viste at det var en dobbel infeksjon med Enterococcus faecium Hotell og en Escherichia
som bakterien, men det ble senere bekreftet ved hjelp av in situ
hybridisering med gamma Proteobacteria sondere at det var bare Escherichia
som bakterien som infiltrerte de overfladiske sår og ble funnet intracellulært i epitelceller og innen nøytrofile granulocytter. Enterobacterial infeksjon i tarmen er et vanlig fenomen, men det er sjelden å finne slike infeksjoner i magen og det har aldri før blitt rapportert hos voksne hester. Dette resultatet er veldig interessant, men videre studier må avklare hvor vanlig dette fenomenet er i hester. Også om denne typen infeksjon er av primær eller sekundær opprinnelse trenger ytterligere avklaring. Escherichia
som kloner alt hadde 100% 16S rRNA-genet likhet med både E. fergusonii Hotell og Shigella flexneri
. Således, i denne studien, kan det ikke bli presisert eksperimentelt hvilken av disse to organismer som var til stede i denne kjertel lesjon. Men mennesker er rapportert å være den eneste naturlig vert for Shigella product: [17] mens E. fergusonii
har vært forbundet med et bredt utvalg av tarm og ekstra-tarminfeksjoner hos både mennesker og dyr, inkludert hester [18 , 19]. Det er derfor mest sannsynlig at Escherichia
som bakterien funnet i denne studien tilhører E. fergusonii
. Studier har rapportert E. fergusonii
som en ny patogen og forbundet med spesielt bakteriemi og sårinfeksjon men dens presise rolle i infeksjoner hos både mennesker og dyr har fortsatt ikke klarlagt [20].
Mikrobiologi i prøvene
miljøet i kjertelmagen er generelt svært fiendtlig mot mikrober [21]. Det er godt etablert at, i motsetning til mennesker og hunder som er måltid brett, hester er kontinuerlig syreprodusenter, sannsynligvis på grunn av en kontinuerlig fôring mønster [22, 23]. PH i den ventrale delen av hestens mage er stabil på rundt pH 1-3 i hele 24 timer [24], og dermed den relative lave mangfold av bakterier observert i slimhinneprøver i denne studien var ikke uventet.
Karakteristiske morfologiske fenotype av store kokker vokser i vanlige Tetrads ble etablert for å være en klone med en 99% likhet til Sarcina ventriculi
. Denne organisme er kjent for å være i stand til å vokse i mageinnhold og har den karakteristiske Tetrade struktur når dyrket fra pH 1- pH 3 [25]. I denne studien, kan det funn av disse organismene ikke fastslås å være en del av en hvilken som helst spesifikk patologi, slik de ble funnet i lave antall i de parede prøver (dvs. lesjon og normal), så vel som i kontrollprøvene. Sarcina-lignende bakterier har blitt funnet i en rekke arter, hvor de har blitt antatt å forårsake abomasal bloat, blødninger og sår i lam og geitekill [26, 27] og en mulig kobling til mage dilatasjon i både hunder og hester har også blitt foreslått [28]. Ingen tegn på gassansamlinger ble observert makroskopisk i noen av disse hestene, og dermed er det ikke synes at tilstedeværelsen av Sarcina ventriculi
bidratt til patologi observert i disse hestene.
Det var ikke overraskende at Lactobacillus (Lactobacillus salivarius
) ble funnet i de undersøkte vev, og det har tidligere blitt rapportert at flere Lactobacillus
spp., inklusive L. salivarius
, er til stede hos friske hester [16, 29]. Den proksimale mage equine fungerer som lagring for innmating, samt et kammer for intragastrisk fermentering. Økosystemet i denne regionen består av både anaerob og laktat utnytte bakterier i store tall, som er ansvarlig for økningen i flyktige fettsyrer ved gjæring av karbohydrater [30]. Spesielt Lactobacilli ble funnet en ånd av epitel i proksimale del av hestens mage [31] og disse bakteriene vil trolig passere til kjertelmagen som en del av normal turn-over. Vi har bare undersøkt delprøver og mer bakteriell taxa vil bli funnet i sunn del av magekjertler hvis en mer omfattende bakterieflora samfunnet studien ble gjort.
Gyldighet av funnene i Helicobacter
Ingen av vevsprøver fra antrum region viste positive signaler fra Helicobacter spp
. undersøke i denne studien, og ingen spiralformede bakterier ble registrert ved hjelp av FISH teknikk heller. I en fersk studie fra Venezuela, ble spiralformede bakterier rapportert i biopsier fra hjerte regionen i hestens mage farget med Warthin-Starry flekken [12]. Helicobacter spp
. kjent for å være i stand til å kolonisere magen produsere store mengder av cytoplasmisk urease [32] Den hurtige urease test som brukes i denne undersøkelsen, Pyloritek ®, registrerer ureaseaktiviteten av vevsprøven ved fremstilling av ammoniakk når urea er tilstede. Det er mye brukt i menneskelig praksis å oppdage gastritt forårsaket av Helicobacter spp
. De positive og negative prediktiv verdi var mellom 98,1 til 100%, og 95,8 til 100%, henholdsvis i en studie testing av humane pasienter før og etter utrydde bakterien [33]. I denne studien ble det ikke funnet positive prøver, noe som indikerer at biopsier i den foreliggende undersøkelsen inneholdt ingen bakterier med evne til å produsere urease.
Konklusjoner
Gastric Helicobacter spp
. ble ikke funnet og kunne ikke være knyttet til mage lesjoner av de 36 hestene som ble analysert i denne studien. Den patologi funnet i denne studien inkluderte polypoid strukturer, hyperplastisk rugae og små erosjoner, men bakteriell engasjement ble funnet i bare ett tilfelle av en erosjon. I denne lesjon, et Escherichia lignende klon, mest sannsynlig E. fergusonii
, ble funnet intracellulært. Hvorvidt dette var en primær eller sekundær infeksjon kan ikke bli avsluttet. Svært begrensede mengder bakterier generelt ble funnet i hestens kjertel region som forventet. Således påvisning av en moderate til høye mengder av eventuelle bakterier på slimhinner kjertel nivå, så vel som i kryptene bør være grunn til bekymring, da dette ikke synes å være et vanlig funn i hestens kjertelmagen. Videre studier som involverer bakterier og forholdet til helsefare av hester med bekreftede kliniske tegn er garantert, da disse hestene ikke ble inkludert i studien
. Metoder
Hester og studiedesign
Undersøkelsen ble gjort som en tverrsnittsundersøkelse av magen fra en befolkning på 63 slakteri hester i Danmark. Hester ble godkjent av Veterinary Officer så sunt for slakting. Hester var stunned med en fange bolt og tappet for blod. Magen, inkludert 5 - 10 cm fra den distale spiserør og 10 cm av proksimal duodenum, ble fjernet umiddelbart etter uttak av indre organer og åpnet langs den store kurvatur. Ingesta ble fjernet og, om nødvendig, ble den mucosa forsiktig skylt med et minimum av vann fra springen før inspeksjon. Kun mager med store lesjoner i kjertelslimhinnen ble tatt, så vel som sju kontroll mager uten brutto tegn på gastriske lesjoner.
Kjertel lesjoner ble definert som den mucosa ha en unormal makroskopiske utseende dvs. hyperaemic, økt tykkelse, erosjoner eller sår . De anatomiske posisjoner av lesjonene ble notert som: The Cardia, corpus eller antrum region (Fig. 6). Figur 6 Anatomiske områder i magesekken åpnes langs den store kurvatur. Den ikke-kjertel regionen har en hvit vises epitel, mens kjertel regionen er nyanser av rødt. De er atskilt av Margo plicatus
. De tre samplede regioner inkluderer: Cardia som liten stripe området rett under og langs margo plicatus
, corpus området som inneholder syre, pepsinogen og slim sekresjon kjertler (mørk rød) og antrum regionen inneholder hovedsaklig av slim og gastrin sekresjon kjertler.
Sampling prosedyre
fra hver mage med kjertel lesjoner, tre vevsprøver hvor innhentet av de største lesjon (A, B, C) samt tre sammen vises vevsprøver normale (a, b, c) fra samme anatomisk område, men i hvert fall på minst 5 cm. A /a: en liten biopsi størrelse (0,5 x 0,5 cm) mukosa prøve ble oppnådd for umiddelbar urease testing med Pyloritek ® assay i henhold til produsentens anbefalinger. Tester ble lest etter en 60 minutters standard tid og resultater notert som positiv eller negativ. Prøvene B /b: en 3 × 3 cm full tykkelse vevsprøve inkludert slimhinnene og submucosa ble oppnådd for fisk og fiksert i 10% bufret formalin. . Etter 24 timer feste prøvene ble overført til 70% etanol, parafin-embedded, seksjonert i tre mikrometer og montert på Superfrost /pluss lysbilder (Menzel-Glaser, Braunschweig Tyskland)
Prøver C /c: a tredje par av vev prøver for kloning og sekvensering ble oppnådd og hurtigfrosset ved hjelp av tørris (Hvis lesjon størrelse tillater det).
fra de syv styre magene med ingen makroskopiske gastriske lesjoner, prøvene a, b og c ble tatt fra normale vises slimhinnen i antrum. Tre av disse hestene ble i tillegg prøvetatt i Cardia, corpus og tolvfingertarmen også.
Den prøvetakingsprosedyrer fant sted fra august til oktober 2007. Historiske data om tidligere helsen hestene kunne ikke hentes.
Fluorescent In Situ hybridisering for bakterier
for mikrobiell deteksjon ble vevssnitt hybridiserte samtidig med to 16S rRNA-prober merket med forskjellige fluorophores. Oligonukleotidproben S-D-Bact-0338-en-A-18 rettet mot bakterier (5'GCTGCCTCCCGTAGGAGT3 ') [34] var 5' merket med fluoresceinisotiocyanat og med isotiocyanat derivat Cy3. Oligonukleotidproben HEL717 rettet mot Helicobacter slekten (5'AGGTCGCCTTCGCAATGAGTA3 ') [35] var 5' merket med isotiocyanat derivat Cy3. Hvis du vil kontrollere kloning resultatene en tredje og fjerde sonde, LC-gProt-1027-AA-17 (5'GCCTTCCCACATCGTTT3 ') rettet mot 23S rRNA av Gammaproteobacteria var 5' merket med fluoresceinisotiocyanat og sonde SG-Enteroco-184 (5'CAAATCAAAACCATGCGG3 ') var Cy3 merket målretting 16S rRNA av Enterococcus
spp [36]. Alle prober ble syntetisert ved DNA-teknologi, Århus, Danmark. Glassene ble deparaffinized i xylen og overført til 100% alkohol i 30 min før hybridisering. Den hybridiseringen ble utført ved 45 ° C med 40 ml hybridiseringsbuffer (100 mM tris [pH 7,2], 0,9 M NaCl, 0,1% natriumdodecylsulfat) og 200 ng av hver probe i 16 timer i en Sequenza Slide Rack (Thermo Shandon, Cheshire, UK). Prøvene ble så vasket tre ganger i forvarmet (45 ° C) hybridisering buffer i 15 minutter og hvorpå tre ganger i forvarmet (45 ° C) vaskeløsning (100 mM tris [pH 7,2], 0,9 M NaCl). Prøvene ble skyllet i vann, lufttørket og montert i Vectashield (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) for epifluorescens mikroskopi. En Axioimager M1 epifluorescence mikroskop utstyrt for epifluorescence med en 100-W HBO lampe og filter setter 43 og 38 ble brukt til å visualisere Cy3 og fluorescein, henholdsvis. Bilder ble oppnådd ved anvendelse av en AxioCam MRM versjon 3 FireWiremonocrome kamera og programvare AxioVision versjon 4.5 (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland).
Evaluering av epifluorescens mikroskopi ble utført ved beskrivelse av den subjektive beløp, morfologisk utseende og plassering av celler som fluorescerer tydelig i hver vevsprøve. I tillegg ble alle vevssnitt farget med H &Co. E og evaluert histopathologically
16S rDNA amplifisering og kloning
Etter påvisning av bakterier ved hjelp av FISH, ble under prøver fra hester som viser bakterier av forskjellige morfologier valgt for 16S rRNA-genet. kloning. DNA ble isolert fra 4 vevsprøver ved å bruke Easy-DNA kit (Invitrogen, Tåstrup, Danmark) i henhold til produsentens instruksjoner. 16S rRNA-genet ble amplifisert ved anvendelse av primere SD-Bact-0008-aS-20 (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ') [37] og S - * - Univ-1492-aA-19 (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3) [38]. PCR sykling bestod av en initiell denaturering ved 94 ° C i 6 min; etterfulgt av 30 sykluser med denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 55 ° C i 45 s og forlengelse ved 72 ° C i 2 minutter; og en endelig forlengelse ved 72 ° C i 3 minutter. Amplifisert DNA ble bekreftet ved elektroforese på agarosegeler. PCR-produktene ble renset ved anvendelse av QIAquick PCR-rensesett kolonne (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). For å opprette butt-endete DNA følgende ble blandet i et 0,5 ml mikrosentrifugerør, 4 pl 5 x T4-DNA-polymerase-buffer, 14,7 ul av rensede PCR-produkt 0,8 ul dNTP (2,5 mmol l -1 hver) og 0,5 ul (1,2 U) T4 DNA-polymerase (Invitrogen) og inkubert ved 12 ° C i 15 min. T4 DNA-polymerase ble varme-inaktivert, og det butt-endede DNA ble renset ved anvendelse av QIAquick PCR-rensesett kolonne (Qiagen GmbH) og eluert i et sluttvolum på 10 ul dobbeltdestillert vann. Etter produsentens beskrivelser kloning ble utført ved hjelp av en Zero sløv TOPO kloning kit (Invitrogen). Ti kolonier fra hver kloning ble plukket og sekvensert på en automatisk sekvens analysator (ABI PRISM 373 DNA Sequencer, PE Biosystems, Foster City, CA, USA) ved hjelp av to standard vektor primere (T3 og T7) følger med i pakken. Sekvensen ble montert i Bionumerics versjon 4.0 (Applied Math, Sint-Martens-Latem, Belgia) og sjekket for chimeras både ved sprengning de enkelte sekvenser i GenBank http:.... //Www NCBI NLM nih gov og av programvaren Pintail versjon 1.1 http:... //www cardiff ac uk /biosi /forskning /Biosoft /. Fylogenetisk analyse av kloner som tilhører Escherichia
slekten ble gjort ved å laste ned 16S rRNA gensekvenser lenger enn 1200 bp fra RDP v.9 databasen av Escherichia
typen stammer http:. //RDP cme . MSU. edu. Sekvensene ble trimmet til den samme lengde av 1327 bp og innrettet parvis (UPGMA) etterfulgt av en global sekvenssammenstilling. En endelig fylogenetisk tre ble konstruert ved hjelp av WARD algoritmen hvor Enterobacter sakazakii plakater (AB004746) ble brukt som outgroup.
Erklæringer
Takk
Forfatterne ønsker å takke Hanne H. Møller, Katja Kristensen og Johanna Z Amenuvor for teknisk bistand i laboratoriene. Også takk til Stina VESTER for å hjelpe samle vev. Dette arbeidet ble støttet av Kongeriget Danmarks Horseinsurance g /s og Intervet Danmark. Sponsorer hadde ingen involvering i den praktiske delen eller konklusjoner av denne studien.
Forfatternes opprinnelige innsendte filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes opprinnelige innsendte filer for bilder. 12866_2009_1040_MOESM1_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 1 12866_2009_1040_MOESM2_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 2 12866_2009_1040_MOESM3_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 3 12866_2009_1040_MOESM4_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 4 12866_2009_1040_MOESM5_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 5 12866_2009_1040_MOESM6_ESM.jpeg Forfatteroriginalfilen for figur 6

• Etablering og identifisering av en kanin modell av peritoneal karsinomatose fra magekreft
• NO-indusert motilitet effekter i mage fundus og pylorus av sGCβ1his105phe mutant mice