Angiotensin II-receptoruttryck och relation till Helicobacter pylori-infektion i magen av den mongoliska gerbil

angiotensin II-receptoruttryck och relation till Helicobacter pylori
-infection i magen av den mongoliska gerbilen Bild Sammanfattning
Bakgrund
rollen av renin-angiotensinsystemet i magsäcken fysiologi och sjukdom som ännu glest undersökas. Det främsta syftet med studien var att undersöka baslinjen närvaro och placering av angiotensin Il-receptorer (AT1R och AT2R) i magen av den mongoliska gerbilen. Ett andra mål var att klarlägga om förekomsten av H. pylori
infektion i samband med förändringar i uttrycket av dessa receptorer.
Metoder
H. pylori
-negativ och H. pylori
infekterade (stam SS1 eller TN2GF4) manliga mongoliska ökenråttor undersöktes. Magarna undersöktes vid sex eller 12 månader efter inokulering genom användning av immunohistokemi, western blöt och mikroskopisk morfometri.
Resultat
AT1R och AT2R var belägna i ett flertal celler i gerbil magväggen, inklusive en subpopulation av endokrina celler i antral slemhinnan och inflammatoriska celler infiltrerar H. pylori
infekterade magar. Ökenråttor infekterade med SS1-stammen visade en signifikant ökad antral AT1R proteinuttryck och ett ökat antal infiltrerande polymorfonukleära leukocyter (PMNs) vid 12 månader. Den AT1R proteinexpressions korrelerade med antalet PMN och antral expression av myeloperoxidas.
Slutsatser
Angiotensin Il-receptorer är närvarande i en mängd olika celler i den gastriska väggen hos mongolisk gerbil. Resultaten indikerar en påverkan beroende av H. pylori
belastning på gastric AT1R uttryck och en relation mellan gastric AT1R uttryck och mucosal PMN infiltration.
Bakgrund
roll renin-angiotensinsystemet (RAS) i mag-fysiologi och sjukdom som ännu glest undersökas. Vissa studier har rapporterat effekter av angiotensin II (Ang II) på mucosal blodflöde, magsyra och glatt muskulatur [1-3]. Andra har blandat inflytande RAS i stressinducerad gastrisk skada och ischemi /reperfusion skada av magslemhinnan [4, 5].
Klassiska endokrina karaktär RAS är välkänt för dess effekter på hemodynamiska reglering och kroppsvätskor homeostas. Mindre är känt om den reglerande effekten av vävnad baserade lokala RAS som har visats i ett antal organ, t.ex. hjärnan, bukspottkörtel, matstrupe och kolon [6-8]. Interstitiell produktion av Ang II kan förekomma efter lokal produktion av angiotensinogen (AGT), ACE och renin, eller genom alternativa reaktionsvägar inklusive klyvning av cirkulerande AGT av andra lokalt uttryckta enzymer såsom katepsin D och chymas [9]. Ang II verkar främst genom två receptorer, betecknade Ang II typ 1-receptorn (AT1R) och Ang II typ 2-receptor (AT2R). Följaktligen kartläggning av uttryck och lokalisering av Ang Il-receptorer är av stor betydelse i att utforska potentialen Ang II signalering i olika fysiologiska och patologiska inställningar. Under de senaste åren RAS har visat sig vara involverade i olika sjukdomstillstånd såsom inflammation, sårläkning och cancer [10, 11]. Epidemiologiska studier har också visat samband mellan RAS relaterad gen polymorfism (SNP) och utvecklingen av magsår och magcancer [12, 13]. Emellertid har associationer mellan vävnadsuttryck av Ang II-receptorer och Helicobacter pylori
infektion inte rapporterats. Potentialen för RAS att modulera lokala inflammatoriska reaktioner gör det av intresse att undersöka dess förhållande till väldefinierade gastrit framkallad av H. pylori
.
I den aktuella studien undersökte vi uttrycket av Ang II-receptorer i oinfekterade och H. pylori
infekterade mongolisk ökenråtta. Denna djurmodell är intressant eftersom det lätt kan infekteras med H. pylori
, vilket ger en kronisk aktiv inflammation med patologiska förändringar som efterliknar de flesta av de skador som finns hos människor, inklusive magsår, gastric intestinal metaplasi och magcancer liknande bilden [14]. Om H. pylori
infektion ensam orsakar magcancer i mongoliska gerbiler förblir under debatt [15]. Review, en första Syftet med studien var att undersöka baslinjen närvaro och placering av AT1R och AT2R i magen av mongolisk ökenråtta. Ett andra mål var att klarlägga om förekomsten av H. pylori
infektion i samband med förändringar i uttrycket av dessa receptorer.
Metoder
Djur
Experimenten godkändes av den etiska kommittén för experiment på djur, Göteborgs universitet. Trettio specifika patogenfria (SPF) manliga mongoliska gerbiler (Charles River, Uppsala, Sverige), sju veckor gamla, användes. De randomiserades separeras i tre lika stora grupper, bestående av en kontrollgrupp och två grupper som skulle vara infekterade med Helicobacter pylori
. Fem djur hölls i varje bur och rummet reglerades med avseende på temperatur (18-22 ° C), fuktighet (ca 55%) och ljus /mörker-cykel (12 /12h). Gerbiler hade fri tillgång till mat (2016F, Harlan Tek. Lab, slån, England) och dricksvatten. De fick en veckas acklimatisering före ympning.
Bakteriestammar och ympning
Två olika H. pylori
stammar användes för ympning, den TN2GF4 stammen [16] och Sydney stammen 1 (SS1) [ ,,,0],17]. Båda stammarna är kända för att orsaka en kronisk aktiv inflammation i gerbil gastric antral och kroppslig slemhinna. Bakterierna odlades på Columbia-plattor. Dessa kulturer användes därefter för att inokulera 500 ml Brucella-buljong innehållande 5% serum från nyfödd kalv, 10 pg /ml vankomycin och 5 | j, g /ml trimetoprim. Kolvarna inkuberades i 24 timmar under mikro aeroba betingelser vid 37 ° C. Bakterierna undersöktes genom faskontrastmikroskopi innan de administrerades till djuren. Gerbiler infekterades med 0,5 ml av bakteriesuspensionen eller Brucella-buljong bara (kontroller) med användning av en matningsnål. Livskraftiga räknas gjordes i suspensionen att fastställa de faktiska infektiösa doser, som var 7 x 10 7 enheter och 4 x 10 7 enheter för SS1 och TN2GF4 respektive. Sälja Tidsförlopp och offrar
efter en 24-hr fasteperiod med fri tillgång till dricksvatten, var fem djur från varje grupp avlivades sex eller 12 månader efter ympning. Djuren sövdes genom intraperitoneal injektion av medetomodin (0,5 mg /kg) och ketamin (75 mg /kg). En mittlinje laparotomi utfördes och magarna avlägsnades sedan och öppnades utmed huvud krökning. En halv användes för odling, och prover togs från den andra hälften för histologiska analyser och Western blot-analys. Djuren avlivades genom hjärt snitt. Histopatologiska fynd och bakteriologisk status har tidigare rapporterats [14].
Immunohistokemi sälja The hela väggen prover (antrum och corpus) samlades omedelbart efter öppnandet av magar, fast i Histofix (Histolab produkter AB, Göteborg, Sverige ) vid rumstemperatur (RT) över natten och sköljdes sedan i PBS under 24 timmar. Prover var därefter uttorkad, inbäddade i paraffin, skuren i 5-| j
tjocka sektioner och monterades på objektglas. Innan immunohistocemical färgning, var sektionerna avparaffiniserades och kokades i citronsyrabuffert (0,01 M, pH 6,0, 10 min). Den Immunocruz TM Färgningssystemet (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) användes för immunohistokemi protokoll. Efter hämning av endogen peroxidasaktivitet, var icke-specifik bindning av sekundära antikroppar blockeras genom inkubation med normalt getserum under 30 min vid RT. Följande två polyklonala primära antikroppar, spädningar och inkubationstider användes sedan: kanin-anti-AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech, 1: 100 i PBS, 2 timmar vid RT) och kanin-anti-AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech, 1: 100 i PBS, 2 timmar vid rumstemperatur). Efter inkubering med primära antikroppar, var sektionerna tvättades tre gånger i PBS och sonderades med en biotinylerad sekundär antikropp; komplexet detekterades med användning av pepparrotsperoxidas (HRP) -streptavidin och färgen utvecklades med användning av 3,3'-diaminobensidin (DAB). Review, en oväntad, stark färgning av celler med en typisk utseende endokrina celler noterades efter immunohistokemisk färgning med denna peroxidas baserade metoden. Immunoflourescens märkning gjordes för att ytterligare utesluta möjligheten att denna färgning var ett resultat av endogen biotin, av endogen peroxidasaktivitet eller av ospecifik bindning av den sekundära antikroppen. Följande protokoll användes: efter kokning i citronsyrabuffert, var icke-specifik bindning av sekundära antikroppar blockeras genom inkubation med normalt getserum (sc-2043, Santa Cruz Biotech) under 30 min vid RT. Sektioner inkuberades med primära antikroppar som ovan. Objektglasen tvättades sedan tre gånger i PBS och sonderades med en sekundär antikropp av Alexa Flour 488 konjugerat get-anti-kanin-IgG (A-11034, Molecular Probes Inc, Eugene, OR, USA), späddes 1: 400 i PBS under 1 h vid RT. Objektglasen tvättas sedan tre gånger i PBS och monterades med fluorescensmonteringsmedium (DakoCytomation, Glostrup, Danmark), varefter bilderna fångades med ett fluorescensmikroskop. För att bekräfta placeringen av AT1R i endokrina celler, var dubbelt immunfärgning utfördes med användning av den ovan beskrivna peroxidas baserat protokoll för AT1R och ovan beskrivna immunoflorescens märkning protokoll för en primär antikropp riktad mot kromogranin A (C-20, Santa Cruz Biotech, 1: 100 i PBS, 2 timmar vid rumstemperatur). Icke-specifik bindning av den sekundära antikroppen (Alexa Flour 568-konjugerad åsne-anti-get-IgG, A-11057, Molecular Probes Inc, 1: 800 i PBS, 1 h vid RT) blockerades genom inkubering med normal donkey serum (sc-2044 , Santa Cruz Biotech). Preabsorpion med ett överskott (5 ×) blockering peptid (sc-1173P, Santa Cruz Biotech) utfördes som en kontroll för specificiteten för AT1R antikropp, medan den primära antikroppen utelämnades för AT2R.
Gerbil AT1R och AT2R har > 90% aminosyrahomologi sekvensidentitet med humant, råtta och mus Ang Il-receptorer [18, 19]. I gerbiler, som i råttor och möss finns två AT1R subtyper (AT1aR och AT1bR) som kodas av olika gener, men med 95% aminosyrasekvenshomologi. Dessa receptorsubtyper är kända för att differentiellt lokaliserad och regleras men har en liknande affinitet för Ang II. På grund av hög aminosyrasekvenshomologi mellan gerbil AT1aR och AT1bR antog vi lika bindningsaffinitet till de AT1R subtyper för AT1R antikropp som används i föreliggande studie. Dessutom är de antikroppar som används för färgning Ang II-receptorer som fastställts av tillverkaren i möss, råttor och människor. Därför att bekräfta specificiteten av dessa antikroppar i gerbiler har sektioner från paraffininbäddade block av normal gerbil och mänskliga binjurar färgades enligt ovan (förutom att både primära antikroppar utspädda 1:50 i PBS) och distributionsmönster för Ang II receptorantikroppar studerades. Adrenal distributionsstudier visade att den anti-AT1R antikropps övervägande färgade adrenala kortikala celler i zona glomerulosa (färgning av kapseln som omger körteln, var vaskulära glatta muskelceller (VSMC) och endotelceller också noterat) i både gerbil och mänskliga sektioner. De anti AT2R antikroppfärgade adrenal medulla celler och celler i zona glomerulosa i gerbil och humant binjure (färgning av VSMC och endotelceller noterades även med användning av denna antikropp). Dessa resultat överensstämmer med tidigare rapporterade studier [20], och den stora likheten av färgningsmönster i gerbil och mänskliga binjurarna stödja en allmän användbarhet av antikropparna i gerbil vävnader.
Western blot
Efter öppna magar, full tjocklek antral vägg prover omedelbart in, frystes i flytande kväve och lagrades vid -70 ° C. Proverna homogeniserades på is (Polytron, PT-MR 2100, Kinematica, Schweiz) i buffert A (10% glycerol, 20 mM Tris-HCL pH 7,3, 100 mM NaCl, 2 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 2 mM EDTA, 2 nM EGTA , 10 mM natriumortovanadat, 10 | ig /ml leupeptin och 10 ^ g /ml aprotinin) [21] och centrifugerades vid 30000 g under 30 min vid 4 ° C. Pelletsen återsuspenderades i buffert B (1% NP-40 [Sigma-Aldrich, Stockholm, Sverige] i buffert A) och omrördes vid 4 ° C under 1 h före centrifugering vid 30000 g under 30 min vid 4 ° C. Supernatanterna analyserades med avseende på proteininnehåll genom metoden enligt Bradford [21] och lagrades vid -70 ° C fram till vidare analys. Prover späddes i SDS-buffert och värmdes vid 70 ° C under 10 minuter innan de lastas på en NuPAGE 10% BisTris gel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Ett körfält var lastad med förfärgade molekylviktsstandarder (SeeBlue ™, Invitrogen AB, Lidingö, Sverige), och hela cellysat av PC-12 (för AT1R, SC-2250, Santa Cruz Biotech), HEP G2 (för AT2R; SC- 2227, Santa Cruz Biotech) och HL60 (för myeloperoxidas (MPO), 12-354, Upstate Lake Placid, NY, USA) användes som positiva kontroller. Polyvinyldifluoride membran (Amersham, Buckinghamshire, UK) inkuberades med polyklonala kaninantikroppar riktade mot AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech), AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech) eller MPO (07-496, Upstate). Ett alkaliskt fosfatas konjugerat get-anti-kanin-antikropp (sc-2007, Santa Cruz Biotech för AT1R och AT2R antikroppar, och IgG 12-448, Upstate, för MPO-antikropp) och CDP-Star-substrat (Tropix, Bedford, MA, USA ) användes för att identifiera immunreaktiva proteiner genom chemiluminescense. Bilder fångades av en kyld CCD-kamera (LAS-1000, Fujifilm, Tokyo, Japan). Och halv kvantifiering gjordes genom att jämföra prover till positiva kontroller med hjälp av Gauge 3,3 programvara (Fujifilm, Tokyo, Japan) Review Mikroskopisk morfometri
Vävnadsprover prover~~POS=HEADCOMP från antral väggen fixerades i Histofix (Histolab Products AB) och bäddas in i paraffin. Fyra | j
tjocka sektioner monterades på kodade objektglas och rutinmässigt färgas med hematoxylin /eosin (H & E). Graden av mucosal infiltration av mononukleära och polymorfonukleära leukocyter studerades i ljusmikroskop. Lamina propria kommer att tendera att öka i volym till följd av tillströmningen av inflammatoriska celler. Därför var den relativa volymen av lamina propria bedömas genom morfometri att spegla infiltration av både mononukleära och polymorfonukleära leukocyter. Detta utfördes genom H.F.H. i ett ljusmikroskop, med en 10 x 10-square grid införd i okularet och a × 25 objektivlins. Med hjälp av punkträkning metoden [22], var volymen densiteten hos lamina propria bestämdes och uttrycktes i procent av slemhinnan (i detta fall definieras som regionen mellan slemhinneytan och botten av körtlar). Mucosal volym definieras här som epitelskikt + lamina propria. Mucosal infiltration av polymorfonukleära leukocyter (PMN) bedömdes av P.H. i ett ljusmikroskop, med en 10 x 10-rutnät in i okularet, en x 50 oljeimmersion objektiv (N.A. 1,4) och en oljeimmersionstopplinsen av kondensorn (N.A. 1,4). PMN identifierades som grovt runda celler i lamina propria med en mörkt färgade multilobulated eller bilobulated kärna. Antalet PMN i ett kvadratiskt område på slemhinnan bestämdes, liksom det totala antalet kvadrater över lamina propria; antalet PMN uttrycks per 1 mm 2 lamina propria. Räkningen startade från botten av körtlar och slutade efter bedömning av en till sju fulla stråk av slemhinnan, vilket resulterar i ett minimum av 0,077 mm 2lamina propria analyse per avsnitt. Systematisk provtagning med en slumpmässig start användes för val av de områden som ska studeras i båda analyserna. Områden med lymfoida folliklar ingick inte.
Statistisk analys
Kruskal-Wallis test och Mann-Whitney U-test bedöms betydelse skillnaderna i proteinuttryck mellan kontroll, TN2GF4-infekterade och SS1-infekterade grupper. Av Mann-Whitney U-test bedömas signifikans i skillnaderna i mukosal infiltrering av inflammatoriska celler mellan de TN2GF4-infekterade och SS1-infekterade gerbiler. Ett linjärt förhållande mellan AT1R-protein och PMN, och ett linjärt förhållande mellan AT1R och ln (MPO) i antral mucosa, testades med Pearson korrelation. Alla tester tvåsidiga, och statistisk signifikans sattes vid p < 0,05. Alla statistiska analyser genomfördes med SPSS, version 15,0 (SPSS Inc. Chicago, Illinois).
Resultat
Lokalisering av AT1R och AT2R protein
Immunoreaktivitet till AT1R och AT2R proteiner observerades i alla gerbil exemplar studeras, och ingen färgning sågs i kontrollsektionerna. Den AT1R antikropp generellt inducerade en mer distinkt färgning än AT2R antikropp.
Flera teoretiska vävnader i både corpus och antrum, oberoende av närvaron eller frånvaron av H. pylori
infektion uppvisade immunreaktivitet både av Ang II receptorsubtyper (se tabell 1 för en översikt över resultaten och Figur 1 för representativa sektioner. se även Ytterligare fil 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 och 15 för högupplösta bilder). Således var immunreaktivitet till både AT1R och AT2R finns i endotelceller i kärl är belägna i lamina propria, submukosa (Figur 1B) och muscularis propria, såväl som i glatta muskelceller i muscularis mucosae och muscularis propria (Figur 1C och 1G) och i vissa mesenkymala celler som finns i lamina propria och submucosa. Svag färgning av båda receptorerna noterades också, framför allt i den basala delen av de flesta epitelceller. Distinkt färgning av intramural neurala strukturer observerades inte. Immunoreaktivitet enbart till AT1R observerades i de vaskulära glatta muskelcellerna i kärl i submukosa, muscularis propria och serosa av både corpus och antrala delar av magsäcken (Figur 1A och 1 g). Intressant, en stark immunfärgning för AT1R dök upp i en delmängd av celler huvudsakligen i basen av antral körtlar. Dessa celler uppvisade en typisk endokrin cell utseende, det vill säga att de var ganska små, med cellkroppar nära basalmembranet; en smal sträng av cytoplasma observerades i vissa fall (Figur 1G, 1H och 1I). Sådan AT1R färgning kunde inte hittas i hormonliknande celler i oxyntic slemhinnan. Dubbel immunfärgning för AT1R och pan-endokrina markör kromogranin A [23] bekräftade platsen för AT1R i en subpopulation av endokrina celler i gerbil antral slemhinnan (figur 1M och 1N) .table en Lokalisering av AT1R och AT2R protein i mag vägg av den mongoliska gerbilen
Tissue Fack
vid Celltyp
AT1R

AT2R
Mucosa
epitel
flesta epitelceller
+ främst i basala delar
+ huvudsakligen i basala delar
Små epitelceller i basen av körtlar
+++ i vissa endokrina liknande celler i antrum
ingen
lamina propria
kärl
+ i endotel
+ i endotel
Nerv strukturer
ingen
ingen
mesenkymala celler
++ i vissa celler;
++ i leukocyter i H. pylori
infekterade
+ i vissa celler;
++ i leukocyter i H. pylori
infekterade
muscularis slemhinnor
Glatta muskelceller
++
+
submucosa
kärl
+ i endotel;
++ i VSMC
+ i endotel;
ingen i VSMC
Nerv strukturer
ingen
inga
mesenkymala celler
++ i vissa celler;
++ i leukocyter i H. pylori
infekterade
+ i vissa celler;
++ i leukocyter i H. pylori
infekterade
muscularis propria
glatta muskelceller
++
+
kärl
+ i endotel;
++ i VSMC
+ i endotel;
nej i VSMC
Nerv strukturer
N.O.
N.O.
serosa
kärl
N.O. i endotel;
++ i VSMC
ingen
nej: inte observerats (eller ospecifik) immunreaktivitet
+: svag immunreaktivitet men med tydlig plats
++: lätt att känna igen immunoreaktivitet
+ ++: stark immunreaktivitet
VSMC: vaskulära glatta muskelceller
Figur 1 Demonstration av immunhistokemiska platsen för AT1R och AT2R i magen av den mongoliska gerbilen. A-F visar sektioner från antral regionen av en SS1-infekterade gerbil, 12 månader efter ympning. A) Vaskulära glatta muskelceller (VSMC) i en artär som ligger i serosa fläcken positiva för AT1R proteinet (grön färg). B) Endotelceller (slut) och oidentifierade mesenkymala celler (m) är belägna i submukosa som visar immunoreaktivitet för AT2R protein. C) Släta muskelceller i muskelskiktet i muscularis propria fläcken positivt för AT2R proteinet. D) En negativ kontroll (rad avsnittet i A) förabsorberats med blockerings peptid för AT1R antikropp, visar gul autofluorescens från erytrocyter. E & F) Negativa kontroller för AT2R antikropp, följd avsnitten i B & C, respektive. G visar H avsnitt från antral regionen ett kontrolldjur 6 månader efter ympning och det avsnitt i (I) är från en TN2GF4-infekterade gerbil, 12 månader efter ympning. Stark immunfärgning för AT1R hittades i celler med en typiska utseende endokrina celler (e). Muscularis slemhinnor (mm), muscularis propria (mp) och vaskulära glatta muskelceller (VSMC) färgades också positivt för AT1R. En peroxidas baserad metod (brun färg) användes för färgning av AT1R i G, H och immunofluorescens (grön färg) användes för färgning av AT1R i (I). J, K och L) på varandra följande sektioner från antral regionen en TN2GF4-infekterade gerbil, 6 månader efter ympning. J) Immunfärgning för AT1R (grön färg) visar aggregat av leukocyter (LEU) uttrycker AT1R proteinet. K) En negativ kontroll till avsnittet i J, visar gul autofluorescens från erytrocyter. L) Den rad avsnitt till avsnitt i K, rutinmässigt färgas med H & E, bekräftar att aggregaten är leukocyter. M och N visar dubbel immunfärgning för AT1R (brun färg i M) och för den pan-endokrina markör kromogranin A (röd färg i N) av en antral sektion av ett kontrolldjur. Den vita pilen i M och N punkter vid en cell i botten av en antral körtel som färgades positivt för både AT1R och kromogranin A. Flera av kromogranin A positiva celler inte var immunpositiva till AT1R. Avsnitt O visar neutrofiler (PMNs) i antral slemhinnan av en SS1-infekterade gerbil, 12 månader efter ympning.
Intensitet och fördelningen av immunoreaktivitet som beskrivs ovan verkar inte vara annorlunda mellan H. pylori
-negativa och H. pylori
infekterade djur eller mellan djuren avlivades vid sex eller 12 månader efter ympning. Dock en uppenbar skillnad noterades mellan H. pylori
-negativa och H. pylori
infekterade djur: till skillnad från i de oinfekterade gerbiler, de delar av både antrum och corpus av infekterade djur uppvisade ett överflöd av inflammatoriska celler i lamina propria med immunreaktivitet till både AT1R och AT2R. I en av de TN2GF4-infekterade djur avlivades vid sex månader, aggregat av inflammatoriska celler sågs också i muscularis propria (figur 1J, 1K och 1L). Inga tydliga skillnader i färgningsmönster eller intensitet sågs mellan djur infekterade med TN2GF4 stammen eller SS1 stammen, eller mellan djur avlivades vid sex eller 12 månader efter Kvantifiering av AT1R och AT2R protein och relation till inflammatoriska celler
> på grund av den liknande immunhistokemisk utseende av angiotensin Il-receptorer i corpus och antrum (med undantag för AT1R uttrycker subpopulation av endokrina celler som nämnts ovan) vid både sex och 12 månader, kvantitativa bedömningar var begränsade till antral prover på 12 månader efter ympning .
Både AT1R och AT2R proteiner identifierades med western blotting i alla prover (Figur 2). Efter 12 månaders infektion, den AT1R proteinuttryck var signifikant högre i SS1-infekterade djur än i kontrollgruppen vid den tiden (Figur 3). Inga signifikanta skillnader i AT2R proteinuttryck påträffades mellan de olika grupperna av gerbiler (ej visad). Figur 2 Exempel bild av western blöt. Topplatta: immunoreaktivitet mot AT1R på 41 kDa i PC-12-cellysat (positiv kontroll) och i antral full vägg prover. Bottenplatta: immunoreaktivitet mot AT2R indikerar en svagt band vid 44 kDa i Hep G2 (positiv kontroll) och band i antral full vägg prover
Figur 3 Boxplot visar AT1R proteinuttryck 12 månader efter ympning i ökenråttor infekterade med H. pylori. stammar TN2GF4 och SS1 och kontroller. Den AT1R proteinuttryck var signifikant högre i SS1-infekterade djur jämfört med kontroller (Kruskal-Wallis test och Mann-Whitney U test). Proteinnivåer presenteras som optisk densitet (OD). Medianvärden anges med den tvärgående linjen i lådan, kvartilavståndet av den vertikala utsträckningen av lådan och det totala området av whiskers.
Tanke på att H. pylori
infekterade djur uppvisade ett överflöd av AT1R uttrycker inflammatoriska celler i deras magslemhinnan och en ökad antral AT1R expression gjordes en kvantitativ analys av de inflammatoriska cellerna i slemhinnan görs för att bedöma om uppreglering av AT1R protein i SS1-infekterade gerbiler var relaterad till mukosala infiltrering av inflammatoriska celler.
graden av mucosal infiltration av både mononukleära och polymorfonukleära leukocyter (reflekteras av volymdensiteten hos lamina propria) inte skiljer sig mellan SS1-infekterade och TN2GF4-infekterade gerbiler. Men mucosal infiltration av polymorfonukleära leukocyter (PMN) var signifikant högre i SS1-infekterade djur än i TN2GF4-infekterade djur 12 månader efter ympning (tabell 2). De PMN i H. pylori
infekterade slemhinnan bestod nästan uteslutande av neutrofiler (Figur 1O); endast ett fåtal eosinofila och inga basofila celler kunde identifieras i microscope.Table 2 Kvantitativ analys av inflammatoriska celler i gerbil antral slemhinnan efter 12 månaders Helicobacter pylori
infektion
vid kontroll
TN2GF4
SS1
Mukös infiltration av mononukleära och polymorfonukleära leukocyter (reflekteras av volymtätheten (%) av lamina propria)
26,7 ± 2,4
47,1 ± 2,2
41,3 ± 2,4
Mukös infiltration av polymorfonukleära leukocyter (PMN /mm2 lamina propria) katalog 198 ± 37
1892 ± 169
4166 ± 275 * *
Värdena är medelvärde ± medelvärdets medelfel
** p <.; 0,01, SS1 kontra TN2GF4. Mann-Whitney U-test Review, en linjärt samband (r = 0,75, p < 0,01) sågs mellan AT1R proteinuttryck i antrum och antalet polymorfonukleära leukocyter i antral mucosa efter 12 månaders H. pylori
infektion (Figur 4). Detta förhållande stöddes av den logaritmiska sambandet mellan antral uttryck AT1R och uttrycket av myeloperoxidas (r = 0,58, p < 0,05) (Figur 5). Myeloperoxidas (MPO) är ett enzym som rikligt uttrycks i neutrofiler och i mindre utsträckning i monocyter och vissa typer av makrofager [24]. Därför, vävnadsnivåer av MPO tjänade som proteinmarkörer av neutrofil infiltration i denna studie. Om avvikande värde markeras med en triangel i fig 5 är undantagna från analysen (ej visad i en separat figur) förhållandet mellan AT1R och MPO blir märkbart starkare (r = 0,86 och p < 0,01). Figur 4 Förhållandet mellan AT1R uttryck i antrum och antalet polymorphnuclear leukocyter (PMN) i antral slemhinnan efter 12 månaders H. pylori-infektion.
Figur 5 Förhållandet mellan AT1R uttryck och myeloperoxidas (MPO) uttryck i antral slemhinnan efter 12 månader H. pylori-infektion. Om avvikande värde markeras med en triangel är utesluten från analysen (ej visad) förhållandet mellan AT1R och MPO blir märkbart starkare (r = 0,86 och p < 0,01).
Diskussion
Den aktuella studien undersökte baslinjen närvaron och läget av angiotensin Il-receptorer i antral och kroppsväggen på mongolisk ökenråtta och demonstrerade att AT1R och AT2R uttrycktes genom ett flertal celler. Fastställandet av speciellt intresse var att en subpopulation av endokrina celler i antral slemhinnan visade en markant uttryck för AT1R. Giltighetstiden för den immunhistokemiska förfarande som används i den aktuella studien bekräftades på olika sätt. De Ang II receptorantikroppar detekterades med användning av två olika tekniker, och specificiteten för de primära antikropparna som används för både Western blotting och immunohistokemi kontrollerades genom att jämföra de färgningsmönster hos gerbil med de hos det mänskliga binjuren och genom preabsorption med blockerande peptid ( AT1R).
allestädes närvarande fördelningen av Ang II-receptorer i magen rapporterats här är i överensstämmelse med vad som har rapporterats tidigare i kolon [7]. Autoradiografi av råttan magen har också indikerat att AT1R, och lågt antal AT2R, förekommer i alla skikt i magen [4]. Men den exakta platsen för AT1R och AT2R i magen har hittills bara varit glest utforskas. Matsuo et al
. begagnade immunohistokemi att lokalisera AT1R i human antrum och fann det i vaskulära glatta muskelceller (VSMC), mesenkymala celler och glatta muskelceller i de muskulära skikt av slemhinnan och muscularis propria [25]. Vidare Bregonzio et al
.

• Helicobacter pylori-infektion framkallad gastric cancer; avancera i gastric stamcellsforskning och de återstående utmaningar
• Utvärdering och kliniska betydelsen av magen ålder modell för utvärdering åldrande magen en multicenterstudie i Kina