Angiotensin-II-Rezeptor-Expression und Bezug auf Helicobacter pylori-Infektion im Magen des mongolischen gerbil

Angiotensin-II-Rezeptor-Expression und Bezug auf Helicobacter pylori
-Infektion im Magen des mongolischen Wüstenrennmaus
Zusammenfassung
Hintergrund
die Rolle des Renin-Angiotensin-System in Magenphysiologie und Krankheit noch worden dünn erforscht. Das erste Ziel der Studie war es, die Basis Vorhandensein und die Position von Angiotensin II-Rezeptoren (AT1R und AT2R) im Magen des mongolischen Wüstenrennmaus zu untersuchen. Ein zweites Ziel war es zu klären, ob die Anwesenheit von H. pylori
Infektion mit Veränderungen in der Expression dieser Rezeptoren assoziiert ist.
Methods
H. pylori -negativen
und H. pylori
infiziert (Stamm SS1 oder TN2GF4) wurden männliche mongolische Rennmäuse untersucht. Die Mägen wurden bei sechs oder 12 Monate nach der Impfung untersucht unter Verwendung von Immunhistochemie, Western Blot und mikroskopische Morphometrie.
Ergebnisse
AT1R und AT2R wurden in einer Vielzahl von Zellen in der Gerbil Magenwand befindet, einschließlich einer Subpopulation von endokrinen Zellen in der Antrum-Schleimhaut und Entzündungszellen infiltriert H. pylori
infiziertem Mägen. Gerbils mit dem SS1-Stamm infiziert zeigten eine signifikant antral AT1R Proteinexpression und eine erhöhte Anzahl von infiltrierenden polymorphkernigen Leukozyten erhöht (PMNs) nach 12 Monaten. Die AT1R Proteinexpression mit der Anzahl der PMNs und dem Antrum Expression von Myeloperoxidase korreliert.
Schlussfolgerungen
Angiotensin II-Rezeptoren sind in einer Vielzahl von Zellen in der Magenwand des mongolischen Gerbil. Die Ergebnisse zeigen einen Einfluss abhängig von der H. pylori-Stamm
auf die Magen-AT1R Ausdruck und eine Beziehung zwischen Magen AT1R Ausdruck und Schleimhaut PMN-Infiltration.
Hintergrund
Die Rolle des Renin-Angiotensin-Systems (RAS) im Magen-Physiologie und Krankheit wurde noch spärlich erforscht. Einige Studien haben berichtet Wirkungen von Angiotensin II (Ang II) auf Blutung der Schleimhaut, Säuresekretion und Kontraktion der glatten Muskulatur [1-3]. Andere den Einfluss von RAS in Stress induzierten Magen-Schädigung und Ischämie /Reperfusion Schädigung der Magenschleimhaut beteiligt sind [4, 5]. Die klassische endokrine Charakter RAS
bekannt für seine Auswirkungen auf die hämodynamischen Regulierung und Körperflüssigkeit Homöostase bekannt ist. Weniger ist über die regulatorischen Auswirkungen der Gewebe bekannten lokalen RAS zugrunde, dass in einer Reihe von Organen nachgewiesen wurde, z.B. das Gehirn, Pankreas, Speiseröhre und Kolon [6-8]. Interstitielle Produktion von Ang II durch andere lokal exprimierten Enzymen wie Cathepsin D und Chymase AGT folgende lokale Produktion von Angiotensinogen (AGT), ACE und Renin oder durch alternative Wege einschließlich Spaltung von zirkulierendem [9] auftreten können. Ang II arbeitet in erster Linie durch zwei Rezeptoren, bezeichnet Ang II-Typ 1-Rezeptor (AT1R) und Ang II-Typ-2-Rezeptor (AT2R). Folglich ist die Abbildung der Expression und Position von Ang II-Rezeptoren von großer Bedeutung Potential Ang II-Signalisierung in verschiedenen physiologischen und pathologischen Einstellungen in der Erforschung. In den letzten Jahren in verschiedenen pathologischen Zuständen, wie Entzündung, Wundheilung und Karzinogenese [10, 11] RAS wurde einbezogen werden gezeigt. Epidemiologische Studien haben auch Verbindungen zwischen RAS im Zusammenhang mit Gen-Polymorphismus (SNPs) und die Entwicklung von Magengeschwüren und Magenkrebs nachgewiesen [12, 13]. Jedoch haben Zuordnungen zwischen Gewebeexpression von Ang II-Rezeptoren und Helicobacter pylori-Infektion
nicht berichtet. Das Potenzial der RAS zu lokalen Entzündungsreaktionen modulieren es interessant macht seine Beziehung zum wohldefinierten Gastritis durch H. pylori
evozierte zu untersuchen. In der vorliegenden Studie
, untersuchten wir die Expression von Ang II-Rezeptoren in der nicht infizierten und infizierten mongolischen gerbil
H. pylori. Dieses Tiermodell ist interessant, weil es leicht mit H. pylori
infiziert werden können, eine chronische Entzündung aktiv mit pathologischen Veränderungen geben, dass die meisten der gefundenen Läsionen bei Menschen, darunter Magengeschwüre, Magen-Darm-Metaplasie und Magenkrebs-ähnliche imitieren Bild [14]. Ob H. pylori-Infektion
allein verursacht Magenkrebs in der mongolischen Wüstenrennmäusen bleibt umstritten [15]. Ein erstes Ziel der Studie war es, die
Basis Anwesenheit und die Position des AT1R und die AT2R im Magen des zu untersuchen mongolische Wüstenrennmaus. Ein zweites Ziel war es zu klären, ob die Anwesenheit von H. pylori-Infektion
mit Veränderungen in der Expression dieser Rezeptoren zugeordnet ist.
Methoden Tiere
Die Versuche von der Ethikkommission der Versuche genehmigt wurden Tiere, Universität Göteborg. Dreißig spezifische pathogenfreie (SPF) männliche Mongolische Rennmäuse (Charles River, Uppsala, Schweden), 7 Wochen alt, wurden verwendet. Sie wurden zufällig in drei Gruppen gleicher Größe getrennt werden, bestehend aus einer Kontrollgruppe und zwei Gruppen, die mit H. pylori infiziert
werden sollten. Fünf Tiere wurden in jedem Käfig und der Raum gehalten wurde geregelt bezüglich der Temperatur (18-22 ° C), Feuchtigkeit (etwa 55%) und Licht /Dunkel-Zyklus (12 /12h). Die gerbils hatten freien Zugang zu Nahrung (2016F, Harlan Tek. Lab, Schlehe, England) und Trinkwasser. Sie waren eine Woche Akklimatisierung vor der Impfung erlaubt.
Bakterienstämme und Impfung
Zwei verschiedene H. pylori
Stämme zur Impfung verwendet wurden, die TN2GF4 Stamm [16] und der Sydney-Stamm 1 (SS1) [ ,,,0],17]. Beide Stämme sind bekannt, eine chronische aktive Entzündung im gerbil GAVE und körperliche Schleimhaut zu verursachen. Die Bakterien wurden auf Columbia-Platten gezüchtet. Diese Kulturen wurden dann zum Beimpfen von 500 ml Brucella-Brühe, enthaltend 5% Serum von neugeborenen Kälbern verwendet, 10 ug /ml Vancomycin und 5 ug /ml Trimethoprim. Die Kolben wurden für 24 Stunden unter mikroaerobischen Bedingungen bei 37 ° C inkubiert. Die Bakterien wurden durch Phasenkontrastmikroskopie untersucht, bevor den Tieren verabreicht werden. Die Gerbils wurden mit 0,5 ml der Bakteriensuspension oder Brucella-Brühe infiziert nur (Kontrollen) eine Fütterungsnadel. Lebensfähige Zählungen wurden in der Suspension hergestellt, die tatsächlichen infektiösen Dosen zu bestimmen, die waren 7 x 10 7 Einheiten und 4 x 10 7 Einheiten für SS1 und TN2GF4 sind.
Zeitverlauf und opfern
eine 24-Stunden-Fastenzeit mit freiem Zugang zu Trinkwasser, fünf Tiere aus jeder Gruppe wurden folgende sechs oder 12 Monate nach der Impfung getötet. Die Tiere wurden durch intraperitoneale Injektion von medetomodin (0,5 mg /kg) und Ketamin (75 mg /kg) anästhesiert. Eine Mittellinie Laparotomie wurde durchgeführt und die Mägen wurden dann entlang der Haupt Krümmung entfernt und geöffnet. Eine Hälfte wurde für die Kultur verwendet, und Proben wurden von der anderen Hälfte für die histologische Analysen und Western-Blot-Analyse gesammelt. Die Tiere wurden durch kardiale Inzision geopfert. Die histopathologische Befunde und bakteriologische Status wurden zuvor berichtet [14].
Immunhistochemie
Die Vollwandproben (Antrum und Corpus) wurden unmittelbar nach der Eröffnung der Mägen gesammelt, fest in Histofix (Histolab Produkte AB, Göteborg, Schweden ) bei Raumtemperatur (RT) über Nacht und dann für 24 Stunden in PBS gespült. Die Proben wurden anschließend dehydriert, in Paraffin eingebettet, geschnitten in 5-μ
dicke Abschnitte und montiert auf Glasobjektträger. Bevor immunohistocemical Anfärbung wurden die Schnitte in Zitronensäurepuffer (0,01 M, pH 6,0, 10 min) entparaffiniert und zum Sieden erhitzt. Die ImmunoCruz TM Färbesystem (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) wurde für die Immunhistochemie-Protokoll verwendet. Nach Hemmung der endogenen Peroxidase-Aktivität wurde für 30 min bei RT mit normalem Ziegenserum unspezifische Bindung von sekundären Antikörpern durch Inkubation blockiert. Die folgenden zwei polyklonalen primären Antikörper, Verdünnungen und Inkubationszeiten wurden dann verwendet: Kaninchen-anti-AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech, 1: 100 in PBS, 2 h bei RT) und Kaninchen-anti-AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech, 1: 100 in PBS, 2 h bei RT). Nach der Inkubation mit primärem Antikörper wurden die Schnitte dreimal in PBS gewaschen und mit einem biotinylierten sekundären Antikörper sondiert; mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) wurde der Komplex nachgewiesen -streptavidin und die Farbe wurde mit entwickelt 3,3'-Diaminobenzidin (DAB).
Eine unerwartete, starke Färbung von Zellen mit einer typischen Erscheinungsbild von endokrinen Zellen wurde nach immunhistochemischen Färbung festgestellt mit diesem Peroxidase basierten Verfahren. Immunoflourescens Markierung wurde durchgeführt, um die Möglichkeit auszuschließen, daß diese Färbung eine Folge von endogenem Biotin, endogener Peroxidase-Aktivität oder der unspezifischen Bindung des sekundären Antikörpers war. Das folgende Protokoll wurde verwendet: Nach dem in Zitronensäurepuffer, nicht spezifische Bindung von sekundären Antikörpern Sieden wurde 30 min bei RT durch Inkubation mit normalem Ziegenserum (sc-2043, Santa Cruz Biotech) blockiert. Die Schnitte wurden mit primären Antikörpern, wie oben inkubiert. Die Objektträger wurden dann dreimal in PBS gewaschen und mit einem sekundären Antikörper von Alexa Flour 488 konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-IgG (A-11034, Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA) untersucht, verdünnt 1: 400 in PBS für 1 Stunde bei RT. Die Objektträger wurden gewaschen nächsten dreimal in PBS und montiert mit fluoreszenzBefestigungsMedium (DakoCytomation, Glostrup, Dänemark), nach dem die Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen wurden. Um die Position AT1R in endokrinen Zellen, Doppelimmunfärbungs bestätigen wurde ausgeführt, um die oben beschriebene Peroxidase-basiertes Protokoll für AT1R verwendet und die oben beschriebenen immunoflorescens Markierungsprotokoll für einen primären Antikörper, der gegen Chromogranin A (C-20, Santa Cruz Biotech, 1: 100 in PBS, 2 h bei RT). Unspezifisch des sekundären Antikörperbindung (Alexa Flour 568-konjugiertem Esel-anti-Ziege-IgG, A-11057, Molecular Probes Inc, 1: 800 in PBS, 1 h bei RT) wurde durch Inkubation mit normalem Eselserum (sc-2044 blockiert , Santa Cruz Biotech). Preabsorpion mit einem Überschuß (5 ×) blockierenden Peptids (sc-1173P, Santa Cruz Biotech) wurde als eine Kontrolle für die Spezifität des Antikörpers AT1R durchgeführt, während der primäre Antikörper für die AT2R weggelassen wurde.
Der Gerbil AT1R und AT2R haben > 90% Aminosäurehomologie Sequenzidentität mit der menschlichen, Ratten- und Maus-Ang II-Rezeptoren [18, 19]. In Gerbils, wie in Ratten und Mäusen, gibt es zwei Subtypen AT1R (AT1aR und AT1bR), die von verschiedenen Genen kodiert werden, aber mit 95% Aminosäuresequenzhomologie. Diese Rezeptor-Subtypen bekannt sind differentiell lokalisiert und geregelt werden, aber eine ähnliche Affinität für Ang II sind. Wegen der hohen Aminosäuresequenzhomologie zwischen dem Gerbil AT1aR und AT1bR gingen wir davon aus gleichen Bindungsaffinität zu den AT1R Subtypen für die AT1R Antikörper in der vorliegenden Studie verwendet. Außerdem verwendet die Antikörper für die Färbung Ang II-Rezeptoren werden durch den Hersteller in Mäusen, Ratten und Menschen etabliert. Daher wurden die Spezifität dieser Antikörper in Wüstenspringmäusen, Abschnitte von in Paraffin eingebetteten Blöcken von normalen Gerbil und menschlichen Nebennieren zu bestätigen gefärbt, wie oben (außer, dass sowohl primäre Antikörper wurden in PBS verdünnt, 01.50) und den Verteilungsmuster für den Ang II Rezeptor-Antikörper untersucht. Die Nebenverteilungsstudien zeigten, dass die Anti-AT1R Antikörper überwiegend stained Nebennierenrindenzellen in der zona glomerulosa in beiden (Färbung der Kapsel der Drüse umgebenden vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) und Endothelzellen wurde ebenfalls festgestellt) Gerbil und menschlichen Abschnitte. Die Anti-AT2R Antikörper gefärbt Nebennierenmark-Zellen und Zellen in der Zona Glomerulosa in Gerbils und menschlichen Nebenniere (Färbung von VSMCs und Endothelzellen wurde auch zur Kenntnis genommen mit diesem Antikörper). Diese Ergebnisse stimmen mit den zuvor berichteten Studien [20], und die starke Ähnlichkeit der Färbungsmuster in der Wüstenrennmaus und die menschlichen Nebenniere unterstützen eine allgemeine Nützlichkeit der Antikörper in gerbil Geweben.
Western-Blot
Nach den Mägen öffnen, volle Dicke antral Wand Proben wurden sofort gesammelt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70 ° C gelagert. Die Proben wurden auf Eis homogenisiert (Polytron, PT-MR 2100, Kinematica, Schweiz) in Puffer A (10% Glycerin, 20 mM Tris-HCL pH 7,3, 100 mM NaCl, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 2 mM EDTA, 2 nM EGTA , 10 mM Natriumorthovanadat, 10 &mgr; g /ml Leupeptin und 10 ug /ml Aprotinin) [21] und bei 30.000 g für 30 min bei 4 ° C zentrifugiert. Die Pellets wurden in Puffer B (1% NP-40 [Sigma-Aldrich, Stockholm, Schweden] in Puffer A) und rührt bei 4 ° C für 1 Stunde vor der Zentrifugation bei 30.000 g für 30 min bei 4 ° C resuspendiert. Die Überstände wurden auf ihren Proteingehalt nach der Methode von Bradford [21] und gelagert bei -70 ° C bis zur weiteren Analyse analysiert. Proben wurden vor der auf einem NuPage 10% BisTris-Gel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) geladen wird für 10 min in SDS-Puffer und erhitzt auf 70 ° C verdünnt. Eine Spur wurde beladen mit vorgefärbten Molekulargewichtsstandards (SeeBlue ™, Invitrogen AB, Lidingo, Schweden) und Ganzzelllysaten von PC-12 (für AT1R; sc-2250, Santa Cruz Biotech), HEP G2 (für AT2R; sc- 2227, Santa Cruz Biotech) und HL60 (für Myeloperoxidase (MPO), 12-354, Upstate Lake Placid, NY, USA) wurden als positive Kontrollen verwendet. Polyvinyldifluorid Membranen (Amersham, Buckinghamshire, UK) wurden mit polyklonalen Kaninchen-Antikörpern gegen AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech) inkubiert, AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech) oder MPO (07-496, Upstate). Eine alkalische Phosphatase-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (sc-2007, Santa Cruz Biotech für die AT1R und AT2R Antikörper und IgG 12-448, Upstate, für die MPO-Antikörper) und CDP-Star-Substrat (Tropix, Bedford, MA, USA ) verwendet wurden immunoreaktive Proteine ​​durch Chemilumineszenz zu identifizieren. Die Bilder wurden mit einer gekühlten CCD-Kamera erfasst (LAS-1000; Fujifilm, Tokyo, Japan). Und halb Quantifizierung erfolgte durch Proben zu positiven Kontrollen Vergleich der Spur 3.3 Software (Fujifilm, Tokyo, Japan)
Mikroskopische morphometry
Gewebeproben aus der Kieferhöhlenwand wurden in Histofix (Histolab Products aB) und in Paraffin eingebettet. Vier-μ
dicke Abschnitte wurden auf codierten Glasobjektträger aufgebracht und routinemäßig gefärbt mit Hämatoxylin /Eosin (H & E). Der Grad der mukosalen Infiltration mononukleärer und polymorphkernigen Leukozyten wurde im Lichtmikroskop untersucht. Die Lamina propria wird dazu neigen, in Volumen als Ergebnis des Zustroms von Entzündungszellen zu erhöhen. Daher wurde die relative Volumen der Lamina propria durch Morphometrie beurteilt die Infiltration von mononukleären beiden und polymorphkernige Leukozyten zu reflektieren. Dies wurde durch H.F.H. durchgeführt in einem Lichtmikroskop, mit einem 10 × 10-Quadrat-Raster in das Okular eingefügt und ein × 25 Objektivlinse. Verwendung des Punkt-Zählmethode [22] wurde die Volumendichte der Lamina propria bestimmt und in Prozent der Schleimhaut (in diesem Fall definiert als der Bereich zwischen der Schleimhautoberfläche und dem Boden des den Drüsen) ausgedrückt. Mucosal Volumen wird als Epithelschicht + Lamina propria hier definiert. Die Schleimhaut-Infiltration von polymorphkernigen Leukozyten (PMN) wurde durch P.H. beurteilt in einem Lichtmikroskop, mit einem 10 × 10-Quadrat-Raster in das Okular eingesetzt ist, eine x 50 -Ölimmersionsobjektiv Linse (N. A. 1.4) und eine Öltauchfrontlinse des Kondensators (N. A. 1.4). PMN wurden wie etwa Rundzellen in der Lamina propria mit einem dunkel gefärbten polyzyklische oder bilobulated Kern identifiziert. Die Anzahl der PMNs in einem quadratischen Bereich der Schleimhaut wurde bestimmt, wie die Gesamtzahl der Quadrate über der Lamina propria war; die Anzahl der PMNs pro 1 mm 2 Lamina propria ausgedrückt. Das Zählen von der Unterseite der Drüsen begann und endete nach Einschätzung von ein bis sieben Voll Schwaden der Schleimhaut, was zu einem Minimum von 0,077 mm 2lamina propria pro Abschnitt analysiert. Eine systematische Probenahme mit einem zufälligen Start wurde für die Auswahl der Bereiche, die in den beiden Analysen untersucht werden. Gebiete mit Lymphfollikeln wurden nicht berücksichtigt.
Statistische Analyse
Der Kruskal-Wallis-Test und der Mann-Whitney-U-Test beurteilt Bedeutung der Unterschiede der Proteinexpression zwischen der Steuerung, der TN2GF4-infizierten und der SS1-infizierten Gruppen. Der Mann-Whitney U-Test beurteilt Bedeutung Unterschiede in mukosalen Infiltration von Entzündungszellen zwischen den TN2GF4-infizierten und SS1-infizierten Gerbils. Eine lineare Beziehung zwischen AT1R-Protein und PMNs, und eine lineare Beziehung zwischen AT1R und ln (MPO) in der Antrum-Mucosa wurden mit Pearson-Korrelations getestet. Alle Tests wurden zweiseitig, und die statistische Signifikanz wurde bei p <gesetzt; 0,05. Alle statistischen Analysen wurden mit SPSS durchgeführt, Version 15.0 (SPSS Inc. Chicago, Illinois).
Ergebnisse | Lokalisierung von AT1R und AT2R Protein
Immunoreactivity zum AT1R und die AT2R Proteine ​​in allen gerbil beobachtet wurde Proben untersucht, und keine Färbung wurde in den Steuerabschnitten gesehen. Der AT1R Antikörper im Allgemeinen eine deutlichere Färbung als die AT2R Antikörper induziert.
Mehrere Gewebekammern in sowohl dem Korpus und Antrum, unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von H. pylori
Infektion zeigten Immunreaktivität sowohl des Ang II Rezeptor-Subtypen (Tabelle 1 für einen Überblick über die Ergebnisse und Abbildung 1 für repräsentative Abschnitte zu sehen. siehe auch Zusätzliche Datei 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 und 15 für Bilder mit hoher Auflösung). Somit wird Immunreaktivität sowohl der AT1R und AT2R wurden in Endothelzellen von Gefäßen gefunden in der Lamina propria befindet, der Submukosa (1B) und der Muscularis propria sowie in glatten Muskelzellen der Tunica muscularis mucosae und Muscularis propria (Fig 1C und 1G) und in einigen mesenchymalen Zellen in der Lamina propria und submucosa entfernt. Schwache Färbung beider Rezeptoren wurde ebenfalls, vor allem in den basalen Teil der meisten Epithelzellen festgestellt. Distinct Färbung von intra- neuralen Strukturen wurde nicht beobachtet. Immunreaktivität nur AT1R wurde in den vaskulären glatten Muskelzellen der Gefäße in der Submucosa, der Muscularis propria und der Serosa sowohl des Korpus und Antrum-Teile des Magens (1A und 1G) beobachtet. Interessanterweise erschien eine starke Immunfärbung für AT1R in einer Untergruppe von Zellen vor allem in der Basis der antralen Drüsen. Diese Zellen zeigten eine typische endokrinen Zelle Aussehen, das heißt, sie waren recht klein, mit den Zellkörpern der Nähe der Basalmembran; eine schmale Reihe von Zytoplasma wurde in einigen Fällen (Figur 1G, 1H und 1I) beobachtet. Solche AT1R Färbung in endokrinen ähnlichen Zellen werden konnte in der oxyntic Schleimhaut nicht gefunden. Doppel-Immunfärbung für AT1R und für die pan-endokrinen Marker Chromogranin A [23] bestätigt die Position von AT1R in einer Subpopulation von endokrinen Zellen in der gerbil Antrum-Schleimhaut (Abbildung 1M und 1N) .Tabelle 1 Lokalisierung von AT1R und AT2R Protein im Magen Wand des mongolischen gerbil
Gewebekompartimenttabelle

Zelltyp
AT1R

AT2R
mucosae
Epithels
die meisten Epithelzellen
+ hauptsächlich in den basalen Teilen
+ hauptsächlich in den basalen Teilen
Kleine Epithelzellen in der Basis der Drüsen
+++ in einigen endokrinen wie Zellen in Antrum
kein
Lamina propria

+ Gefäßsystem in Endothel
+ in Endothel
Nervenstrukturen keine
keine

mesenchymalen Zellen
++ in einigen Zellen;
++ in Leukozyten in H. pylori
infiziertem
+ in einigen Zellen;
++ in Leukozyten in H. pylori
infiziertem
Muscularis mucosae
glatte Muskelzellen
++
+
Submukosa
Gefäßsystem
in Endothel +;
++ in VSMCs
+ in Endothel;
nein in VSMCs
Nervenstrukturen
keine
keine
mesenchymalen Zellen
++ in einigen Zellen;
++ in Leukozyten in H. pylori
infiziertem
+ in einige Zellen;
++ in Leukozyten in H. pylori
infiziertem
Muscularis propria
glatte Muskelzellen
++
+

+ Gefäßsystem in Endothel;
++ in VSMCs
+ in Endothel;
keine in VSMCs
Nervenstrukturen
N.O.
N.O.
Serosa

N.O. Gefäßsystem in Endothel;
++ in VSMCs
keine
no: nicht beobachtet (oder unspezifisch) Immunreaktivität
+: schwache Immunreaktivität aber mit deutlichen Lage
++: leicht erkannt Immunreaktivität
+ ++: starke Immunreaktivität
VSMCs: glatten Gefäßmuskelzellen
1 Aufzeigen der immunhistochemischen Lage von AT1R und AT2R im Magen des mongolischen Wüstenrennmaus Bild. A-F zeigt Abschnitte aus dem Antrum-Region eines SS1-infizierten Gerbil, 12 Monate nach der Impfung. A) vaskulären glatten Muskelzellen (VSMC) in einem in der Serosa Fleck befindet artery positiv für die AT1R Protein (grüne Farbe). B) Endothelial-Zellen (end) und nicht identifizierte Mesenchymzellen (m), die in der Submucosa zeigt Immunreaktivität für das AT2R Protein. C) glatte Muskelzellen in der Muskelschicht der Muscularis propria Fleck positiv für das AT2R Protein. D) Eine negative Kontrolle (in Folge den Abschnitt A) vorabsorbiertem mit dem Blockierungspeptid für den AT1R Antikörper, zeigt gelb Autofluoreszenz von Erythrozyten. E & F) Negative Kontrollen für den AT2R Antikörper, in Folge auf die Abschnitte in B & C, respectively. G, H zeigt Abschnitte aus dem Antrum Bereich eines Kontrolltieres 6 Monate nach der Impfung und dem Abschnitt in (I) von einem TN2GF4 infizierten Gerbil, 12 Monate nach der Impfung. Starke Immunfärbung für AT1R wurde in Zellen, die mit einem typischen Aussehen von endokrinen Zellen (e) gefunden. Muscularis mucosae (mm), Muscularis propria (mp) und glatten Gefäßmuskelzellen (VSMC) auch positiv für die AT1R gefärbt. Ein Peroxidase-basiertes Verfahren (braune Farbe) wurde für die Färbung von AT1R in G, H und Immunofluoreszenz (grüne Farbe) verwendet wurde, für die Färbung von AT1R in (I) verwendet. J, K und L) aufeinanderfolgende Abschnitte von der antralen Bereich eines TN2GF4 infizierten Gerbil, 6 Monate nach der Impfung. J) Immunostaining für AT1R (grüne Farbe) zeigt Aggregate von Leukozyten (leu) Expression des AT1R Protein. K) Eine negative Kontrolle auf den Abschnitt in J, gelb Autofluoreszenz von Erythrozyten zeigt. L) Der konsekutive Abschnitt den Abschnitt K, routinemäßig gefärbt mit H & E, die bestätigt, dass die Aggregate Leukozyten sind. M und N zeigt Doppelimmunfärbung für AT1R (braune Farbe in M) und für die pan-endokrinen Marker Chromogranin A (rote Farbe in N) eines antral Schnitt eines Kontrolltier. Der weiße Pfeil in M ​​und N Punkten in einer Zelle, in der Basis eines antralen Drüse, die positiv gefärbt sowohl AT1R und Chromogranin A. Mehrere der Chromogranin A-positiven Zellen nicht AT1R immun wurden. Abschnitt O zeigt Neutrophilen (PMN) in der Antrum-Schleimhaut eines SS1-infizierten Gerbils, 12 Monate nach der Impfung.
Die Intensität und Verteilung der oben beschriebenen hat Immunreaktivität nicht anders zu sein scheinen zwischen H. pylori
-ausschließend und H. pylori
infizierten Tieren oder zwischen die Tiere getötet, um sechs oder 12 Monate nach der Impfung. Es wurde jedoch ein offensichtlicher Unterschied festgestellt zwischen H. pylori
-negative und H. pylori
infiziertem Tiere: Im Gegensatz zu den nicht infizierten gerbils, die Abschnitte sowohl des Antrum und Corpus der infizierten Tiere zeigten eine Fülle von Entzündungszellen in der Lamina propria mit Immunreaktivität sowohl dem AT1R und AT2R. In einer der TN2GF4-infizierten Tiere nach sechs Monaten getötet, Aggregate von Entzündungszellen wurden ebenfalls in der Muscularis propria (Figur 1J, 1K und 1L) zu sehen. Keine offensichtlichen Unterschiede in der Färbung Muster oder Intensität wurden zwischen infizierten Tieren mit dem TN2GF4 Stamm oder der SS1 Stamm gesehen oder zwischen die Tiere getötet, um sechs oder 12 Monate nach der Impfung.
Quantifizierung von AT1R und AT2R Protein und Bezug auf Entzündungszellen
Aufgrund der ähnlichen immunhistochemische Auftreten von Angiotensin II-Rezeptoren im Corpus und Antrum (mit Ausnahme des AT1R erwähnt Subpopulation von endokrinen Zellen, oben) antralen Proben nach 12 Monaten nach der Inokulation an beiden sechs und 12 Monaten wurden quantitative Einschätzungen eingeschränkt
. Sowohl AT1R und AT2R Proteine ​​wurden durch western-Blotting in allen Proben (Figur 2) identifiziert. Nach 12 Monaten der Infektion wurde das AT1R Proteinexpression signifikant höher in SS1-infizierten Tieren als in den Kontrollen zu dieser Zeit (Abbildung 3). Keine signifikanten Unterschiede in AT2R Protein-Expression zwischen den verschiedenen Gruppen von Gerbils (nicht gezeigt) gefunden. Abbildung 2 beispielhaftes Bild der Western-Blots. Oben: Immunreaktivität gegen AT1R bei 41 kDa in PC-12-Zelllysat (positive Kontrolle) und in antral Vollwandproben. Bodenplatte: Immunreaktivität gegen AT2R eine schwache Bande bei 44 kDa in Hep G2 (positive Kontrolle) und Bänder in antral Vollwandproben angibt
Abbildung 3 Boxplot zeigt AT1R-Protein-Expression von 12 Monaten nach der Impfung in gerbils mit H. pylori infiziert. Stämme TN2GF4 und SS1 und in Kontrollen. Der Ausdruck AT1R Protein war signifikant höher als bei den SS1-infizierten Tieren im Vergleich zu den Kontrollen (Kruskal-Wallis-Test und Mann-Whitney-U-Test). Proteinspiegel werden als optische Dichte (OD) dargestellt. Die Mittelwerte werden durch die Querlinie innerhalb des Kastens, der Quartilabstand von der vertikalen Ausdehnung der Box und den gesamten Bereich von der Whisker angegeben.
Da H. pylori
infiziertem Tiere eine Fülle von AT1R zeigte ausdrückt Entzündungszellen in die Magenschleimhaut und eine erhöhte antral AT1R Expression wurde eine quantitative Analyse der Entzündungszellen in der Schleimhaut, ob die hoch~~POS=TRUNC von AT1R Protein wurde in SS1-infizierten Gerbils Bezug zu beurteilen aus Infiltration von Entzündungszellen an Schleimhaut.
der Grad der mukosalen Infiltration beider einkernigen und polymorphkernigen Leukozyten (durch die Volumendichte der Lamina propria reflektiert) unterschied sich nicht zwischen SS1-infizierten und infizierten TN2GF4 Gerbils. Jedoch war die Schleimhaut Infiltration von polymorphkernigen Leukozyten (PMNs) signifikant höher in der SS1-infizierten Tieren als in TN2GF4-infizierten Tieren 12 Monate nach der Impfung (Tabelle 2). Die PMN in der H. pylori
infiziertem Schleimhaut bestand fast ausschließlich aus Neutrophilen (Abbildung 1O); nur wenige eosinophilen und basophilen keine Zellen konnten in den microscope.Table 2 Quantitative Analyse von Entzündungszellen in Gerbil Antrum-Schleimhaut nach 12 Monaten von Helicobacter pylori-Infektion


Steuerung
TN2GF4
SS1
Mucosal Infiltration von mononukleären und polymorphkernigen Leukozyten (durch die Volumendichte (%) der Lamina propria reflektiert)
26,7 ± 2,4
47,1 ± 2,2
41,3 ± 2,4
Mucosal Infiltration von polymorphkernigen Leukozyten (PMN /mm2 Lamina propria)
198 ± 37
1892 ± 169
4166 ± 275 * *
Werte sind Mittelwert ± Standardabweichung vom Mittelwert
** p <. 0,01, SS1 gegen TN2GF4. Mann-Whitney U-Test
eine lineare Beziehung (r = 0,75, p < 0,01) wurde zwischen dem AT1R Proteinexpression im Antrum und die Zahl der polymorphkernigen Leukozyten in der Antrum-Mucosa nach 12 Monaten von H. pylori gesehen
Infektion (Abbildung 4). Diese Beziehung wurde durch die logarithmische Korrelation zwischen der Expression von antralen AT1R und die Expression von Myeloperoxidase unterstützt (r = 0,58, p < 0,05) (Figur 5). Myeloperoxidase (MPO) ist ein Enzym, das in Neutrophilen und in geringerem Maße in Monozyten und bestimmte Arten von Makrophagen [24] reichlich exprimiert wird. Daher diente Gewebespiegel von MPO als Proteinmarker von Neutrophilen-Infiltration in dieser Studie. Wenn der Ausreißerwert mit einem Dreieck in Abbildung markiert 5 von der Analyse ausgeschlossen (nicht in einer separaten Figur nicht gezeigt) die Beziehung zwischen AT1R und MPO wird deutlich stärker (r = 0,86 und p < 0,01). Abbildung 4 Beziehung zwischen AT1R Ausdruck in der Kieferhöhle und die Zahl der polymorphkernigen Leukozyten (PMN) in der Antrum-Schleimhaut nach 12 Monaten von H. pylori-Infektion.
Abbildung 5 Beziehung zwischen AT1R Ausdruck und Myeloperoxidase (MPO) Ausdruck in der Antrum-Schleimhaut nach 12 Monate von H. pylori-Infektion. Wenn der Ausreißerwert mit einem Dreieck markiert von der Analyse ausgeschlossen ist (nicht dargestellt) die Beziehung zwischen AT1R und MPO wird deutlich stärker (r = 0,86 und p < 0,01).
Diskussion
Die vorliegende Studie untersuchte die Basis Vorhandensein und die Position von Angiotensin II-Rezeptoren in der Antrum-und Körperwand der mongolischen Wüstenrennmaus und gezeigt, dass AT1R und AT2R durch eine Vielzahl von Zellen exprimiert wurden. Die Feststellung von besonderem Interesse war, dass eine Subpopulation von endokrinen Zellen in der Antrum-Schleimhaut eine deutliche Expression von AT1R zeigte. Die Gültigkeit des immunhistochemischen Verfahren in der vorliegenden Studie verwendet wurde, auf verschiedene Weise bestätigt. Die Rezeptor-Antikörper Ang II wurden unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Techniken detektiert und die Spezifität der primären Antikörpern sowohl für Western-Blotting und Immunhistochemie verwendet wurde, durch einen Vergleich der Färbungsmuster der Wüstenrennmaus mit denen der menschlichen Nebenniere und durch Präabsorption geprüft mit dem Peptid blockiert ( AT1R).
die ubiquitäre Verteilung von Ang II-Rezeptoren im Magen, die hier berichtet wird in Übereinstimmung mit dem, was zuvor im Kolon berichtet [7]. Die Autoradiographie der Ratte Magen hat auch, dass AT1R angegeben und geringe Anzahl von AT2R, sind in allen Schichten des Magens [4]. Allerdings hat sich die genaue Lage der AT1R und AT2R im Magen noch nur spärlich erforscht. Matsuo et al
. gebrauchte Immunhistochemie AT1R in menschlichen Antrum zu finden und fanden, dass es in vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs), mesenchymalen Zellen und glatten Muskelzellen in den Muskelschichten der Schleimhaut und Muscularis propria [25]. Ferner Bregonzio et al
.

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