L'angiotensina II recettore espressione e relazione con Helicobacter pylori infezione nello stomaco della Mongolia gerbil

angiotensina II recettore espressione e relazione con Helicobacter pylori
-infection nello stomaco del gerbillo mongolo
Abstract
sfondo
il ruolo del sistema renina-angiotensina in fisiologia gastrica e della malattia è stata finora scarsamente esplorata. Il primo obiettivo di questo studio è stato quello di indagare la presenza della linea di base e la posizione dei recettori dell'angiotensina II (AT1R e AT2R) nello stomaco del gerbillo della Mongolia. Un secondo obiettivo è stato quello di chiarire se la presenza di H. pylori
infezione è associata a cambiamenti nell'espressione di questi recettori.
Metodi
H. pylori
-negativa e H. pylori,
infettati (ceppo SS1 o TN2GF4) gerbilli mongoli maschi sono stati studiati. Gli stomaci sono stati esaminati a sei o 12 mesi dopo l'inoculazione con l'uso di immunoistochimica, western blot e morfometria microscopica.
Risultati
AT1R e AT2R erano situati in una varietà di cellule nella parete gastrica gerbillo, compresa una sottopopolazione di cellule endocrine della mucosa antrale e le cellule infiammatorie infiltranti H. pylori
stomaci -infected. Gerbilli infettati con il ceppo SS1 hanno mostrato un aumento significativo del espressione della proteina antrale AT1R e un aumento del numero di leucociti infiltranti polimorfonucleati (PMN) a 12 mesi. L'espressione proteica AT1R correlata con il numero di PMN e l'espressione antrale di mieloperossidasi.
Conclusioni
angiotensina II recettori sono presenti in una varietà di cellule nella parete gastrica del gerbillo della Mongolia. I risultati indicano una influenza dipende dalla H. pylori
dura prova l'espressione AT1R gastrica e una relazione tra espressione AT1R gastrica e della mucosa PMN infiltrazione.
Sfondo
Il ruolo del sistema renina-angiotensina (RAS) in fisiologia gastrica e della malattia è stata finora scarsamente esplorata. Alcuni studi hanno riportato gli effetti dell'angiotensina II (Ang II) sul flusso ematico della mucosa, la secrezione acida e la contrazione della muscolatura liscia [1-3]. Altri hanno implicato l'influenza di RAS a stress indotto lesioni gastriche e danni da ischemia /riperfusione della mucosa gastrica [4, 5].
Il carattere endocrino classica della RAS è ben noto per i suoi effetti sulla regolazione emodinamica e l'omeostasi corpo fluido. Meno si sa circa l'impatto normativo del tessuto basato RAS locale che è stato dimostrato in un certo numero di organi, ad esempio, il cervello, pancreas, esofago e colon [6-8]. la produzione interstiziale di Ang II può verificarsi a seguito di produzione locale dell'angiotensinogeno (AGT), ACE e renina, o attraverso percorsi alternativi tra cui scissione del circolanti AGT da altri enzimi espressi a livello locale come la catepsina D e chimasi [9]. Ang II funziona principalmente attraverso due recettori, designato Ang II di tipo 1 recettore (AT1R) e di tipo 2 del recettore Ang II (AT2R). Di conseguenza, la mappatura l'espressione e la posizione dei recettori Ang II è di grande importanza per esplorare il potenziale di segnalazione Ang II in diversi contesti fisiologici e patologici. Negli ultimi anni RAS ha dimostrato di essere coinvolto in varie condizioni patologiche quali infiammazione, la guarigione delle ferite e carcinogenesi [10, 11]. Studi epidemiologici hanno dimostrato anche le associazioni tra il polimorfismo RAS relative gene (SNP) e lo sviluppo di ulcera peptica e cancro gastrico [12, 13]. Tuttavia, non sono stati segnalati associazioni tra espressione tissutale dei recettori Ang II e Helicobacter pylori
infezione. Il potenziale della RAS di modulare le reazioni infiammatorie locali rende interessante indagare sua relazione con la gastrite ben definito evocata da H. pylori
.
Nel presente studio, abbiamo esaminato l'espressione dei recettori Ang II nel non infetto e H. pylori
-infected gerbillo della Mongolia. Questo modello animale è interessante perché può essere facilmente infettati da H. pylori
, dando una infiammazione attiva cronica con alterazioni patologiche che imitano la maggior parte delle lesioni riscontrate in esseri umani, tra cui le ulcere gastriche, metaplasia intestinale gastrica e un cancro gastrico simile immagine [14]. Sia H. pylori
infezione da solo provoca il cancro gastrico in gerbilli della Mongolia rimane in discussione [15].
Un primo obiettivo di questo studio è stato quello di indagare la presenza della linea di base e la posizione del AT1R e la AT2R nello stomaco del gerbillo della Mongolia. Un secondo obiettivo è stato quello di chiarire se la presenza di H. pylori
infezione è associata a cambiamenti nell'espressione di questi recettori.
Metodi
Animali
Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato Etico di esperimenti su Animali, Università di Göteborg. Trenta specifici patogeni liberi (SPF) gerbilli mongoli maschi (Charles River, Uppsala, Svezia), sette settimane di età, sono stati utilizzati. Essi sono stati separati in modo casuale in tre gruppi di uguali dimensioni, costituite da un gruppo di controllo e due gruppi che dovevano essere infettati da H. pylori
. Cinque animali sono stati tenuti in ogni gabbia e la camera era regolata rispetto alla temperatura (18-22 ° C), umidità (circa 55%) e la luce /buio ciclo (12 /12h). I gerbilli hanno avuto libero accesso al cibo (2016F, Harlan Tek. Lab, Prugnolo, Inghilterra) e l'acqua potabile. Essi sono stati autorizzati una settimana acclimatazione prima della inoculazione.
Ceppi batterici e inoculazione
Due diversi H. pylori
ceppi sono stati utilizzati per l'inoculazione, il ceppo TN2GF4 [16] e il ceppo Sydney 1 (SS1) [ ,,,0],17]. Entrambi i ceppi sono noti per causare una infiammazione cronica attiva nella mucosa antrale e corporale gastrica gerbillo. I batteri sono state coltivate su piastre Columbia. Tali colture sono state poi usate per inoculare 500 ml di brodo Brucella contenente 5% di siero di vitello appena nato, 10 ug /ml vancomicina e 5 ug /ml trimetoprim. Le beute sono state incubate per 24 ore in condizioni aerobiche micro a 37 ° C. I batteri sono stati esaminati al microscopio a contrasto di fase, prima di essere somministrati agli animali. I gerbilli sono state infettate con 0,5 ml della sospensione batterica o brodo Brucella solo (controlli) utilizzando un ago di alimentazione. conte vitali sono state effettuate in sospensione per determinare le dosi infettive effettive, che sono stati 7 × 10 7 unità e 4 × 10 7 unità rispettivamente per SS1 e TN2GF4,.
corso tempo e sacrificio
a seguito di un periodo di digiuno di 24 ore con libero accesso all'acqua potabile, cinque animali di ciascun gruppo sono stati sacrificati sei o 12 mesi dopo l'inoculazione. Gli animali sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di medetomodin (0,5 mg /kg) e ketamina (75 mg /kg). Una laparotomia mediana è stata eseguita e lo stomaco sono stati poi rimossi e aperto lungo il maggiore curvatura. Una metà è stato utilizzato per la cultura, e gli esemplari sono stati raccolti da l'altra metà per le analisi istologiche e l'analisi Western Blot. Gli animali sono stati sacrificati mediante incisione cardiaca. reperti istopatologici e lo stato batteriologico sono stati riportati in precedenza [14].
immunoistochimica
I campioni parete piena (antro e corpo) sono stati raccolti subito dopo l'apertura degli stomaci, fissata in Histofix (Histolab prodotti AB, Gothenburg, Svezia ) a temperatura ambiente (RT) per una notte e poi sciacquati in PBS per 24 ore. I campioni sono stati poi disidratati, inclusi in paraffina, tagliati in sezioni di spessore 5 μ
e montate su vetrini. Prima di colorazione immunohistocemical, sezioni sono state deparaffinate e bolliti in tampone acido citrico (0,01 M, pH 6,0, 10 min). Il TM sistema Immunocruz colorazione (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) è stato utilizzato per il protocollo immunoistochimica. Dopo l'inibizione dell'attività perossidasica endogena, non legame specifico di anticorpi secondari è stata bloccata mediante incubazione con siero normale di capra per 30 minuti a RT. I seguenti due anticorpi primari policlonali, diluizioni e tempi di incubazione sono stati poi utilizzati: coniglio anti-AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech, 1: 100 in PBS, 2 ore a temperatura ambiente) e di coniglio anti-AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech, 1: 100 in PBS, 2 ore a RT). Dopo incubazione con anticorpi primari, le sezioni sono state lavate tre volte in PBS e sondato con un anticorpo secondario biotinilato; il complesso è stato rilevato utilizzando perossidasi di rafano (HRP) -streptavidin e il colore è stato sviluppato utilizzando 3,3'-diaminobenzidina (DAB).
An, forte colorazione inattesa di cellule con un aspetto tipico di cellule endocrine è stato osservato dopo la colorazione immunoistochimica con questo metodo basato perossidasi. Immunoflourescens marcatura è stato fatto per escludere ulteriormente la possibilità che questa colorazione era un risultato di biotina endogena, perossidasi endogena o di legame aspecifico dell'anticorpo secondario. Il protocollo stata utilizzata la seguente: dopo ebollizione in tampone acido citrico, non legame specifico di anticorpi secondari è stata bloccata mediante incubazione con siero normale di capra (sc-2043, Santa Cruz Biotech) per 30 minuti a RT. Le sezioni sono state incubate con anticorpi primari come sopra. I vetrini sono state poi lavate tre volte in PBS e sondato con un anticorpo secondario di Alexa Farina 488 coniugato capra anti-IgG di coniglio (A-11034, Molecular Probes Inc, Eugene, OR, Stati Uniti d'America), diluito 1: 400 in PBS per 1 ora a RT. I vetrini sono stati prossimo lavate tre volte in PBS e montati con fluorescenza mezzo di montaggio (DakoCytomation, Glostrup, Danimarca), dopo di che le immagini sono state catturate con un microscopio a fluorescenza. Per confermare la posizione di AT1R nelle cellule endocrine, doppia immunoistochimica è stata effettuata utilizzando il descritto protocollo di cui sopra perossidasi based per AT1R e la sopra descritta protocollo immunoflorescens etichettatura per un anticorpo primario diretto contro cromogranina A (C-20, Santa Cruz Biotech, 1: 100 in PBS, 2 ore a RT). Non legame specifico dell'anticorpo secondario (Alexa Farina 568-coniugato asino anti-IgG di capra, A-11057, Molecular Probes Inc, 1: 800 in PBS, 1 ora a RT) è stato bloccato da incubazione con siero normale asino (SC-2044 , Santa Cruz Biotech). Preabsorpion con un eccesso (5 ×) bloccando peptide (sc-1173P, Santa Cruz Biotech) è stata eseguita come controllo per la specificità dell'anticorpo AT1R, mentre l'anticorpo primario è stato omesso per la AT2R.
Il gerbillo AT1R e AT2R che > 90% aminoacido identità di sequenza omologia con umano, ratto e topo Ang II recettori [18, 19]. In gerbilli, come in ratti e topi, ci sono due sottotipi AT1R (AT1aR e AT1bR) che sono codificati da geni differenti ma con il 95% degli aminoacidi omologia di sequenza. Questi sottotipi recettoriali sono noti per essere differenzialmente localizzata e regolata ma hanno una affinità per Ang II. A causa di alta sequenza aminoacidica omologia tra il gerbillo AT1aR e AT1bR, abbiamo assunto pari affinità di legame per i sottotipi AT1R per l'anticorpo AT1R utilizzato in questo studio. Inoltre, gli anticorpi utilizzati per i recettori Ang II di colorazione sono stabilite dal produttore in topi, ratti e gli esseri umani. Pertanto, per confermare la specificità di questi anticorpi in gerbilli, sezioni di paraffina blocchi di gerbillo normale e ghiandole surrenali umane sono state colorate come sopra (tranne che entrambi gli anticorpi primari sono stati diluiti 1:50 in PBS) ei modelli di distribuzione per l'Ang II anticorpi anti-recettore sono stati studiati. Gli studi di distribuzione surrenali hanno dimostrato che l'anticorpo anti-AT1R prevalentemente macchiati cellule corticali surrenali nella zona glomerulare (colorazione della capsula che circonda la ghiandola, cellule vascolari muscolari lisce (VSMC) e le cellule endoteliali è stato anche osservato) sia gerbillo e sezioni umani. Le cellule midollare del surrene di anticorpi anti-AT2R macchiate e le cellule della zona glomerulare nel gerbillo e ghiandola surrenale umana (colorazione delle VSMC e cellule endoteliali stato anche osservato utilizzando questo anticorpo). Questi risultati sono in accordo con gli studi precedentemente riportati [20], e la forte somiglianza dei pattern di colorazione nel gerbillo e la ghiandola surrenale umani supportano l'utilità generale degli anticorpi nei tessuti gerbillo.
Western Blot Dopo aver aperto lo stomaco, esemplari parete antrale pieno spessore sono stati subito raccolti, congelati in azoto liquido e conservati a -70 ° C. I campioni sono stati omogeneizzati in ghiaccio (Polytron, PT-MR 2100, Kinematica, Svizzera) nel tampone A (10% glicerolo, 20 mM Tris-HCL pH 7.3, 100 mM NaCl, 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoro, 2 mM EDTA, 2 nm EGTA , 10 mM orthovanadate sodio, 10 mg /ml leupeptina e 10 ug /ml aprotinina) [21] e centrifugati a 30.000 g per 30 minuti a 4 ° C. I pellet sono stati risospesi in tampone B (1% NP-40 [Sigma-Aldrich, Stoccolma, Svezia] in tampone A) e agitata a 4 ° C per 1 ora prima della centrifugazione a 30.000 g per 30 minuti a 4 ° C. I supernatanti sono stati analizzati per il contenuto di proteine ​​con il metodo di Bradford [21] e conservati a -70 ° C fino ad ulteriore analisi. I campioni sono stati diluiti in tampone SDS e riscaldata a 70 ° C per 10 minuti prima di essere caricati su un NuPage 10% BisTris gel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Una corsia è stata caricata con gli standard Prestained peso molecolare (SeeBlue ™, Invitrogen AB, Lidingo, Svezia), e intere lisati cellulari di PC-12 (per AT1R; SC-2250, Santa Cruz Biotech), HEP G2 (per AT2R; SC- 2227, Santa Cruz Biotech) e HL60 (per mieloperossidasi (MPO), 12-354, Upstate Lake Placid, NY, USA) sono stati utilizzati come controlli positivi. membrane Polyvinyldifluoride (Amersham, Buckinghamshire, Regno Unito) sono state incubate con anticorpi policlonali di coniglio diretti contro AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech), AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech) o MPO (07-496, Upstate). Un fosfatasi alcalina di capra coniugata con l'anticorpo anti-coniglio (SC-2007 Santa Cruz Biotech per gli anticorpi AT1R e AT2R, e IgG 12-448, Upstate, per l'anticorpo MPO) e del substrato CDP-Star (Tropix, Bedford, MA, Stati Uniti d'America ) sono stati utilizzati per identificare le proteine ​​immunoreattive per chemiluminescense. Le immagini sono state catturate da una telecamera CCD raffreddata (LAS-1000; Fujifilm, Tokyo, Giappone). E quantificazione semi è stata fatta confrontando campioni di controlli positivi utilizzando il software Gauge 3.3 (Fujifilm, Tokyo, Giappone) microscopico morfometria
I campioni di tessuto dalla parete antrale sono stati fissati in Histofix (Histolab Products AB) e inclusi in paraffina. Quattro-μ
sezioni spesse sono stati montati su vetrini codificati e di routine colorate con ematossilina /eosina (H & E). Il grado di infiltrazione della mucosa mononucleari e polimorfonucleati leucociti è stata studiata al microscopio ottico. La lamina propria tenderà ad aumentare di volume a causa dell'afflusso di cellule infiammatorie. Pertanto, il volume relativo della lamina propria è stata valutata mediante morfometria per riflettere l'infiltrazione di leucociti mononucleari e sia polimorfonucleati. Questo è stato realizzato da H.F.H. in un microscopio ottico, con una griglia 10 × 10-square inserito nel oculare e una lente obiettivo 25 ×. Utilizzando il metodo di conteggio punto [22], la densità di volume della lamina propria è stata determinata ed espressa in percentuale della mucosa (in questo caso definita come la regione tra la superficie della mucosa e la parte inferiore delle ghiandole). il volume della mucosa viene qui definito come epiteliali strato + lamina propria. L'infiltrazione della mucosa dei leucociti polimorfonucleati (PMN) è stata valutata mediante P.H. in un microscopio ottico, con una griglia 10 × 10-square inserito l'oculare, una lente obiettivo 50 × olio di immersione (N.A. 1.4) ed una lente superiore immersione in olio del condensatore (N.A. 1.4). PMN sono stati identificati come cellule più o meno rotonde in lamina propria con un nucleo polilobata o bilobulated scuro macchiato. Il numero di PMN in un'area quadrata della mucosa è stata determinata, come era il numero totale dei quadrati oltre lamina propria; il numero di PMN è espressa per 1 mm 2 lamina propria. Il conteggio iniziato dal fondo delle ghiandole e finito dopo la valutazione di uno a sette andane completi della mucosa, risultante in un minimo di 0,077 mm 2lamina propria analizzato per sezione. campionamento sistematico con un inizio casuale è stato utilizzato per la selezione delle aree da studiare in entrambe le analisi. Le aree con follicoli linfoidi non sono stati inclusi.
Analisi statistica
Il test di Kruskal-Wallis e il Mann-Whitney U-test di significatività valutato le differenze di espressione proteica tra il controllo, la TN2GF4-infetti e la SS1-infetti gruppi. Il Mann-Whitney U-test ha valutato significato differenze di infiltrazione di cellule infiammatorie della mucosa tra i gerbilli TN2GF4-infetti e SS1-infetti. Una relazione lineare tra AT1R-proteine ​​e PMN, e una relazione lineare tra AT1R e ln (MPO) nella mucosa antrale, sono stati testati con correlazione di Pearson. Tutti i test sono stati due code, e la significatività statistica è stato fissato a p < 0.05. Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando SPSS, versione 15.0 (SPSS Inc. Chicago, Illinois).
Risultati
localizzazione di AT1R e proteine ​​AT2R
immunoreattività alla AT1R e le proteine ​​AT2R stato osservato in tutti gerbillo esemplari studiato, e nessuna colorazione è stata osservata in sezioni di controllo. L'anticorpo AT1R generalmente indotto una colorazione più distinto rispetto anticorpo AT2R.
Diversi compartimenti sia nel corpus e antro, indipendente dalla presenza o assenza di H. pylori
infezione, esposto immunoreattività sia del Ang II sottotipi recettoriali (vedi Tabella 1 per una panoramica dei risultati e Figura 1 per sezioni rappresentative. Vedere anche Ulteriori file di 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 e 15 per immagini ad alta risoluzione). Così, immunoreattività sia al AT1R e AT2R sono stati trovati in cellule endoteliali dei vasi ubicata nella lamina propria, la sottomucosa (Figura 1B) e la muscolare propria, così come nelle cellule muscolari lisce della mucosa muscolare e muscolare propria (Figura 1C e 1G) e in alcune cellule mesenchimali ubicata nella lamina propria e sottomucosa. debole colorazione di entrambi i recettori è anche notato, soprattutto nella parte basale della maggior parte delle cellule epiteliali. colorazione distinta di strutture neurali intramurale non è stata osservata. Immunoreattività solo per AT1R è stata osservata nelle cellule vascolari muscolari lisce dei vasi nella sottomucosa, la muscolare propria e la sierosa sia del corpus e parti antrali dello stomaco (Figura 1A e 1G). È interessante notare, una forte immunocolorazione per AT1R apparso in un sottogruppo di cellule principalmente nella base delle ghiandole antrali. Queste cellule hanno mostrato un aspetto tipico delle cellule endocrine, cioè erano piuttosto piccole, con i corpi cellulari nei pressi della membrana basale; una stringa stretta di citoplasma stato osservato in alcuni casi (Figura 1G, 1H e 1I). Tale AT1R colorazione non è stato trovato nelle cellule endocrine come nella mucosa ossintiche. Doppia immunostaining per AT1R e per il marcatore pan-endocrino cromogranina A [23] ha confermato la posizione di AT1R in una sottopopolazione di cellule endocrine della mucosa antrale gerbillo (Figura 1M e 1N) .table 1 Localizzazione di AT1R e AT2R proteine ​​nel gastrica muro del gerbillo mongolo
Tissue Vano

tipo cellulare
AT1R

AT2R
mucosa
Epithelium
maggior parte delle cellule epiteliali
+ principalmente nelle parti basali
+ principalmente in parti basali
piccole cellule epiteliali nella base di ghiandole
+++ in qualche endocrino come cellule in antro
non
lamina propria
Vasculature
+ in endotelio
+ in endotelio
strutture nervose
non
no
cellule mesenchimali
++ in alcune cellule,
++ in leucociti in H. pylori
-infected
+ in alcune cellule,
++ in leucociti a H. pylori
-infected
Muscolaris mucose
cellule muscolari lisce
++
+
Sottomucosa
Vasculature
+ in endotelio,
++ in VSMC
+ in endotelio;
no in VSMC
strutture nervose
non
non
cellule mesenchimali
++ in alcune cellule,
++ in leucociti in H. pylori
-infected
+ in alcune cellule;
++ in leucociti in H. pylori
-infected
muscolare propria
muscolatura liscia cellule
++
+
Vasculature
+ in endotelio;
++ in VSMC
+ in endotelio;
no in VSMC
strutture nervose
N.Ö.
N.Ö.
sierosa
Vasculature
N.Ö. in endotelio,
++ in VSMC
no
no: non osservata (o non specifico) immunoreattività
+: immunoreattività debole, ma con una posizione distinta
++: facilmente riconoscibile immunoreattività
+ ++: forte immunoreattività
VSMCs: cellule muscolari lisce vascolari
Figura 1 Dimostrare la posizione immunoistochimica di AT1R e AT2R nello stomaco del gerbillo della Mongolia. A-F mostra sezioni della regione antrale di un gerbillo SS1-infetti, 12 mesi dopo l'inoculazione. A) cellule vascolari muscolari lisce (VSMC) in un'arteria situata nella macchia sierosa positivo per la proteina AT1R (colore verde). B) Le cellule endoteliali (finali) e le cellule mesenchimali non identificati (m) che si trova nella sottomucosa che mostra immunoreattività per la proteina AT2R. C) cellule muscolari lisce nello strato muscolare della muscolare propria macchia positivo per la proteina AT2R. D) Un controllo negativo (consecutiva alla sezione A) preabsorbed con il peptide di blocco per l'anticorpo AT1R, mostrando autofluorescenza giallo eritrociti. E & F) I controlli negativi per l'anticorpo AT2R, consecutiva alle sezioni in B & C rispettivamente. G, H mostra sezioni della regione antrale di un animale di controllo 6 mesi dopo l'inoculazione e la sezione a (I) è da un gerbillo TN2GF4-infetti, 12 mesi dopo l'inoculazione. Forte immunostaining per AT1R stato trovato nelle cellule con un aspetto tipico di cellule endocrine (e). Muscolaris mucose (mm), muscolare propria (mp) e cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) anche macchiato positivo per il AT1R. Un metodo basato perossidasi (colore marrone) è stato utilizzato per la colorazione di AT1R in G, H e immunofluorescenza (colore verde) è stato utilizzato per la colorazione di AT1R in (I). J, K e L) sezioni consecutive della regione antrale di un gerbillo TN2GF4-infetti, 6 mesi dopo l'inoculazione. J) immunocolorazione per AT1R (colore verde) mostra aggregati di leucociti (leu) che esprimono la proteina AT1R. K) Un controllo negativo alla sezione J, mostrando autofluorescenza giallo eritrociti. L) La sezione consecutiva alla sezione K, abitualmente colorate con H & E, confermando che gli aggregati sono leucociti. M e N mostra doppia immunostaining per AT1R (colore marrone M) e per il marcatore pan-endocrino cromogranina A (colore rosso in N) di una sezione antrale di un animale controllo. La freccia bianca in M ​​e N punti in una cella nella base di una ghiandola antrale che macchiato positivo sia per AT1R e cromogranina A. Molti dei cellule positive Cromogranina A non sono stati immunopositive a AT1R. Sezione O dimostra neutrofili (PMN) nella mucosa antrale di un gerbillo SS1-infetti, 12 mesi dopo l'inoculazione.
L'intensità e la distribuzione della immunoreattività sopra descritto non sembra essere diverso tra H. pylori
-negativa e H. pylori
animali -infected o tra gli animali sacrificati a sei o 12 mesi dopo l'inoculazione. Tuttavia, una differenza evidente è stata osservata tra H. pylori
pylori
animali -infected -negative e H.: a differenza dei gerbilli non infetti, le sezioni sia l'antro e corpus di animali infetti hanno mostrato una grande varietà di cellule infiammatorie nella lamina propria con immunoreattività sia alla AT1R e AT2R. In uno degli animali infetti TN2GF4 sacrificati a sei mesi, aggregati di cellule infiammatorie sono stati osservati anche nella muscolare propria (Figura 1J, 1K e 1L). Non ci sono ovvie differenze nei modelli di colorazione o intensità sono stati osservati tra gli animali infettati con il ceppo TN2GF4 o il ceppo SS1, o tra animali sacrificati a sei o 12 mesi dopo l'inoculazione
. Quantificazione dei AT1R e AT2R proteine ​​e relazione con le cellule infiammatorie
a causa del simile aspetto immunoistochimica dei recettori dell'angiotensina II nel corpus e antro (con l'eccezione del AT1R esprimere sottopopolazione di cellule endocrine di cui sopra) in entrambe le sei e 12 mesi, valutazioni quantitative sono stati limitati a campioni antrale a 12 mesi dopo l'inoculazione .
Sia AT1R e proteine ​​AT2R sono stati identificati mediante western blotting in tutti i campioni (Figura 2). Dopo 12 mesi di infezione, l'espressione della proteina AT1R era significativamente maggiore negli animali SS1-infetti rispetto ai controlli in quel momento (Figura 3). Nessuna differenza significativa nell'espressione delle proteine ​​AT2R stata trovata fra i diversi gruppi di gerbilli (non mostrati). Figura 2 immagine esemplare delle macchie occidentali. Pannello superiore: immunoreattività contro AT1R a 41 kDa in PC-12 lisato cellulare (controllo positivo) e nei campioni a tutta parete antrali. Pannello inferiore: immunoreattività contro AT2R indicando una fascia debole a 44 kDa a Hep G2 (controllo positivo) e le fasce in campioni a tutta parete antrali
figura 3 Boxplot che mostra l'espressione della proteina AT1R 12 mesi dopo l'inoculazione in gerbilli con infezione da H. pylori. ceppi TN2GF4 e SS1 e nei controlli. L'espressione della proteina AT1R era significativamente più alta negli animali SS1-infetti rispetto ai controlli (test di Kruskal-Wallis e test di Mann-Whitney U). I livelli della proteina sono presentati come densità ottica (OD). I valori mediani sono indicati con la linea trasversale all'interno della scatola, l'intervallo interquartile per l'estensione verticale della scatola e la gamma complessiva dai baffi.
Dato che H. pylori
animali -infected hanno mostrato una grande varietà di AT1R esprimere cellule infiammatorie nel loro mucosa gastrica e un aumento dell'espressione antrale AT1R, un'analisi quantitativa delle cellule infiammatorie nella mucosa è stato fatto per valutare se l'up-regolazione di proteine ​​AT1R in gerbilli SS1-infetti era legato a mucosa infiltrazione di cellule infiammatorie.
il grado di infiltrazione della mucosa di entrambi i leucociti mononucleari e polimorfonucleati (riflesso dalla densità di volume della lamina propria) non differiva tra i gerbilli SS1-infetti e TN2GF4-infetti. Tuttavia, l'infiltrazione della mucosa dei leucociti polimorfonucleati (PMN) era significativamente più alta negli animali SS1-infetti che negli animali TN2GF4-infetti 12 mesi dopo l'inoculazione (Tabella 2). I PMN nel H. pylori
mucosa -infected consistevano quasi esclusivamente di neutrofili (Figura 1o); solo pochi eosinofili e basofili nessuna cellula potrebbero essere identificati nella microscope.Table 2 Analisi quantitativa di cellule infiammatorie nella mucosa antrale gerbillo dopo 12 mesi di Helicobacter pylori
infezione

controllo
TN2GF4
SS1
mucose infiltrazione di mononucleari e polimorfonucleati leucociti (riflessa dalla densità di volume (%) della lamina propria)
26.7 ± 2.4
47,1 ± 2,2
41.3 ± 2.4
mucose infiltrazione dei leucociti polimorfonucleati (PMN /mm2 lamina propria)
198 ± 37
1892 ± 169
4166 ± 275 * *
I valori sono media ± errore standard della media
** p <.; 0,01, SS1 contro TN2GF4. Mann-Whitney U-test
una relazione lineare (r = 0,75, p < 0.01) è stata osservata tra l'espressione della proteina AT1R nel antro e il numero di leucociti polimorfonucleati nella mucosa antrale dopo 12 mesi di H. pylori
infezione (Figura 4). Questa relazione è stata sostenuta dalla correlazione logaritmica tra l'espressione antrale AT1R e l'espressione di mieloperossidasi (r = 0,58, p < 0,05) (Figura 5). Mieloperossidasi (MPO) è un enzima che è abbondantemente espresso nei neutrofili e, in misura minore nei monociti e di alcuni tipi di macrofagi [24]. Quindi, i livelli tissutali di MPO servito come marcatori proteici di infiltrazione dei neutrofili in questo studio. Se il valore outlier contrassegnato con un triangolo in figura 5 è esclusa dall'analisi (non mostrato in figura separata) la relazione tra AT1R e MPO diventa sensibilmente più forte (r = 0,86 e p < 0.01). Figura 4 Relazione tra espressione AT1R nel antro e il numero di leucociti polymorphnuclear (PMN) nella mucosa antrale dopo 12 mesi di infezione da H. pylori.
Figura 5 Relazione tra espressione AT1R e mieloperossidasi espressione (MPO) nella mucosa antrale dopo 12 mesi di infezione da H. pylori. Se il valore di outlier contrassegnato con un triangolo è escluso dall'analisi (non mostrato) il rapporto tra AT1R e MPO diventa sensibilmente più forte (r = 0.86 e P < 0,01).
Discussione
Il presente studio ha esplorato la linea di base presenza e la posizione di angiotensina II recettori nella parete antrale e corporale del gerbillo della Mongolia e hanno dimostrato che AT1R e AT2R sono stati espressi da una varietà di cellule. Un risultato di particolare interesse è che una sottopopolazione di cellule endocrine nella mucosa antrale mostrato una marcata espressione di AT1R. La validità della procedura immunoistochimica utilizzato nel presente studio è stato confermato in vari modi. Gli anticorpi recettore Ang II sono stati rilevati utilizzando due tecniche differenti, e la specificità degli anticorpi primari utilizzati sia per western blotting ed immunoistochimica è stata verificata confrontando i pattern di colorazione del gerbillo con quelli della ghiandola surrenale umana e preassorbimento con il blocco peptide ( AT1R).
la distribuzione ubiquitaria dei recettori Ang II nello stomaco qui riportato è in accordo con quanto riportato in precedenza nel colon [7]. Autoradiografia dello stomaco di ratto ha indicato anche che AT1R e basso numero di AT2R, sono presenti in tutti gli strati dello stomaco [4]. Tuttavia, la posizione precisa di AT1R e AT2R nello stomaco è ancora stata solo scarsamente esplorata. Matsuo et al
. immunoistochimica utilizzato per individuare AT1R in antro umana e l'ho trovato nelle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC), cellule mesenchimali e le cellule muscolari lisce negli strati muscolari della mucosa e muscolare propria [25]. Inoltre, Bregonzio et al
.

• infezione da Helicobacter pylori indotto il cancro gastrico; avanzare nella ricerca sulle cellule staminali gastrica e le sfide rimanenti
• Valutazione e significato clinico del modello dell'età stomaco per valutare l'invecchiamento dello stomaco-uno studio multicentrico in Cina