izražanje receptorjev angiotenzina II in odnos do Helicobacter pylori okužbe v želodcu Mongolski gerbil

izražanja receptorja angiotenzina II in glede na Helicobacter pylori
-infection v želodcu mongolske gerbil
Abstract
Ozadje
vloga renin-angiotenzin sistema v želodcu fiziologije in bolezni je še redko raziskati. Prvi cilj raziskave je bil ugotoviti izhodiščno prisotnost in lokacijo angiotenzina II receptorjev (AT1R in AT2R) v želodcu mongolske gerbil. Drugi cilj je pojasniti, ali je prisotnost H. pylori
okužbe povezana s spremembami v izražanju teh receptorjev.
Metode
H. pylori
-negativno in H. pylori-
okužena (sev SS1 ali TN2GF4) moški Mongolski peščene bili raziskani. Želodci so bili pregledani na šest ali 12 mesecev po okužbi z uporabo imunohistokemijo, Western Blot in mikroskopski morfometrije.
Rezultati
AT1R in AT2R so se nahajala v različnih celic v gerbil želodčni steni, vključno z podskupini endokrine celice v antralnih sluznice in vnetne celice infiltrirajoče H. pylori
okuženimi želodcev. Peščene podgane okuženi s sevom SS1 pokazale bistveno povečano antralnih AT1R beljakovin izražanja in povečano število razraščati polimorfonuklearnih levkocitov (PMN) na 12 mesecev. izražanja AT1R nebeljakovinske korelaciji s številom PMN in antralnih izražanja mieloperoksidaze.
Zaključki
angiotenzin so prisotne v različnih celicah v želodčni steni mongolske gerbil II receptorjev. Rezultati kažejo vpliv odvisen od H. pylori
obremenjuje želodca AT1R izražanja in razmerju med želodca AT1R izražanja in sluznice PMN infiltracijo.
Ozadje
Vloga sistema renin-angiotenzin (RAS) v želodcu fiziologije in bolezni ni bil do redko raziskati. Nekatere študije so poročali dejanja angiotenzina II (Ang II) na sluznice pretok krvi, izločanje kisline in kontrakcijo gladkega mišičja, [1-3]. Drugi so vpleteni vpliv RAS na stres povzroča poškodbe želodca in škodo, ishemija /reperfuzijske za želodčne sluznice [4, 5].
Klasični endokrini značaj RAS je znan po svojih učinkih na ureditev hemodinamskih in homeostaze telesne tekočine. Manj je znano o regulativnega vpliva tkiva temelji lokalno RAS, da je bilo dokazano v številnih organih, npr možgani, trebušni slinavki, požiralniku in colon [6-8]. Interstitial proizvodnja angiotenzin II se lahko pojavi po lokalni proizvodnji angiotenzinogena (AGT), ACE in renin ali preko alternativnih poti, vključno z odcepitvijo obtoku AGT drugih lokalno izraženih encimi, kot so katepsina D in kimaze [9]. Ang II deluje predvsem prek dveh receptorjev, imenovanih Ang II tipa 1 receptorjev (AT1R) in Ang II tipa 2 receptorjev (AT2R). Zato, kartiranje izražanje in lokacijo receptorjev Ang II je zelo pomembna za raziskovanje potencialno Ang II signalizacije v različnih fizioloških in patoloških nastavitve. V zadnjih letih je bilo RAS izkazalo, da se vključijo v različnih patoloških stanj, kot so vnetja, celjenje ran in karcinogenezo [10, 11]. Epidemiološke študije so pokazale tudi povezavo med povezane RAS gena polimorfizma (ang SNP) in razvoj čira na želodcu in rakom želodca [12, 13]. Vendar pa niso poročali o vezi med tkiva izražanje receptorjev Ang II in Helicobacter pylori
okužbe. Potencial RAS za moduliranje lokalne vnetne reakcije jo naredi zanimivo, da se razišče njegovo povezavo z dobro opredeljeno gastritis s H. pylori
izzvan.
V tej študiji smo preučili izražanje receptorjev Ang II v neokuženih in H. pylori
okuženimi mongolska puščavska podgana. Ta model živali je zanimiv, ker ga je mogoče enostavno okuženi s H. pylori
, daje kronično aktivno vnetje s patološkimi spremembami, ki posnemajo večina poškodb najdemo pri ljudeh, vključno želodčnih razjed, želodca intestinalno metaplazijo in želodčnega raka, kot so slika [14]. Ali je sam H. pylori
okužba povzroči raka želodca v mongolskih peščene še vedno predmet razprave [15].
A prvi cilj raziskave je bil ugotoviti izhodiščno prisotnost in lokacijo AT1R in AT2R v želodcu od mongolska puščavska podgana. Drugi cilj je pojasniti, ali je prisotnost H. pylori
okužbe povezana s spremembami v izražanju teh receptorjev.
Metode
Živali
Poskuse smo odobril Odbor za etiko eksperimentov na živali, Univerza v Göteborgu. So bili uporabljeni trideset prostih specifičnih povzročiteljev bolezni (SPF) moški Mongolski peščene (Charles River, Uppsala, Švedska), sedem tednov starosti. Bili so naključno razdelili v tri skupine enake velikosti, ki je sestavljen iz ene kontrolne skupine in dve skupini, ki so bili okuženi s H. pylori
. Pet Živali so bile v vsaki kletki in prostor je urejen glede na temperaturo (18-22 ° C), vlažnost (okoli 55%) in cikla svetloba /tema (12 /12h). The peščene imeli prost dostop do hrane (2016F, Harlan Tek. Lab, Blackthorn, Anglija) in pitne vode. Jim je bilo dovoljeno, en teden aklimatizacije pred inokulacijo.
Bakterij in cepljenje
sta bili dve različni H. pylori
sevov, ki se uporabljajo za inokulacijo je TN2GF4 sev [16] in Sydney sev 1 (SS1) [ ,,,0],17]. Oba sevi so znani, da povzročajo kronično aktivno vnetje v gerbil želodca antralnih in telesnega sluznice. Bakterije smo gojili na Columbia plošče. Te kulture so se nato uporabijo za inokulacijo 500 ml Brucella juho, ki vsebuje 5% seruma novorojenčka telečjega, 10 ng /ml vankomicin in 5 mg /ml trimetoprim. Bučke inkubiramo 24 ur pod mikro aerobnih pogojih pri 37 ° C. Bakterije so bile pregledane s fazno kontrastnim mikroskopom, preden se daje živalim. The peščene so bili okuženi z 0,5 ml suspenzije bakterij ali Brucella juhe le (kontrol) z iglo hranjenja. Izvedljivih grofje so bile narejene v suspenziji za določitev dejanske infekcijskih odmerkov, ki so bili 7 x 10 7 enot in 4 x 10 7 enot za SS1 in TN2GF4 oz.
Časovni potek in žrtvujejo
po obdobju 24-hr tešče z brezplačnim dostopom do pitne vode, je bilo pet živali iz vsake skupine žrtvovali šest ali 12 mesecev po okužbi. Živali smo anestezirali z intraperitonealno injekcijo medetomodin (0,5 mg /kg) in ketamin (75 mg /kg). Sredinsko laparotomijo smo izvedli in želodcev smo nato odstranili in odpre vzdolž glavne ukrivljenosti. Ena polovica je bila uporabljena za kulturo, in vzorci so bili zbrani od druge polovice za histološke analize in zahodni blot analizo. Živali smo žrtvovali s srčno rez. Histopatoloških ugotovitev in bakteriološko stanje so že poročali [14].
Imunohistokemija
Celotna wall primerki (antruma in corpus) so bili zbrani takoj po odprtju želodcev, določenega v Histofix (izdelki Histolab AB, Göteborg, Švedska ) pri sobni temperaturi (RT) preko noči, nato pa sprali v PBS 24 ur. Osebki so bili nato dehidriran, vgrajeni v parafin, narežemo na 5-u
debele oddelkov in montiran na steklenih ploščicah. Pred immunohistocemical obarvanju so odseki deparaffinized in kuhamo v citronske kisline pufru (0,01 M, pH 6,0, 10 minut). The Immunocruz TM obarvanje sistem (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ZDA) smo uporabili za protokol imunohistokemični. Po inhibicijo endogene aktivnosti peroksidaze, je ne specifične vezave sekundarnih protiteles blokirali z inkubacijo z običajnim kozjim serumom 30 minut pri sobni temperaturi. Dva poliklonska primarna protitelesa so razredčitve in inkubacijski čas nato uporabijo naslednja: kunčjega anti-AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech, 1: 100 v PBS, 2 h pri RT) in kunčjega anti-AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech, 1: 100 v PBS, 2 h pri RT). Po inkubaciji s primarnimi protitelesi, smo sekcije oprana trikrat v PBS in skeniran z biotiniliranega sekundarnih protiteles; kompleksu so odkrili s pomočjo s hrenovo peroksidazo (HRP) -streptavidin in barva je bila razvita s pomočjo 3,3'-diaminobenzidine (DAB).
nepričakovan, močno obarvanje celic s tipičnim izgledom endokrinih celic smo opazili po imunohistokemičnim barvanjem s to metodo, ki temelji peroksidaze. Immunoflourescens označevanje je bilo izvedeno še naprej izključuje možnosti, da je to obarvanje posledica endogene biotina, endogene aktivnosti peroksidaze ali nespecifične vezave sekundarnih protiteles. Uporabili smo naslednji protokol: po vretju pri citronske kisline pufru, je ne specifične vezave sekundarnih protiteles blokirali z inkubacijo z običajnim kozjim serumom (sc-2043, Santa Cruz Biotech) za 30 minut pri sobni temperaturi. Odseki inkubiramo s primarnimi protitelesi, kot je zgoraj. Drsniki smo nato sprali trikrat v PBS in preizkusimo s sekundarnim protitelesa Alexa Moka 488 konjugiranim kozjim anti-kunčjega IgG (A-11.034, Molecular Probes Inc, Eugene, OR, ZDA), razredčenega 1: 400 v PBS 1 uro pri sobni temperaturi. Diapozitivi so poleg trikrat sprali v PBS in so nameščeni na fluorescenčno zaščitnim sredstvom (DakoCytomation, Glostrup, Danska), po katerem so bile slike, posnete s fluorescenčno mikroskopom. Za potrditev lokacije AT1R pri endokrinih celicah, je dvojna imunskim barvanjem izvedemo z uporabo zgoraj opisanega peroksidaze protokol temelji za AT1R in zgoraj opisani protokol immunoflorescens označevanja primarnim protitelesom, usmerjenim proti Chromogranin A (C-20, Santa Cruz Biotech, 1: 100 v PBS, 2 h pri RT). Niso specifično vezavo sekundarnega protitelesa (Alexa Moka 568 konjugiranih osel anti-kozjega IgG, A-11.057, Molecular Probes Inc, 1: 800 v PBS, 1 h pri sobni temperaturi), smo blokirali z inkubacijo z normalno osel serumu (sc-2044 santa Cruz Biotech). Preabsorpion s pribitkom (5 ×) blokado peptida (sc-1173P, Santa Cruz Biotech) je bila izvedena kot kontrola za specifičnost protitelesa AT1R, medtem ko je bila primarna protitelesa izpusti za AT2R.
Gerbil AT1R in AT2R imajo > 90% aminokislinsko homologija sekvenčno identičnost s humanim, podgane in miške Ang II receptorjev [18, 19]. V peščene kot pri podganah in miših, obstajata dve AT1R podtipe (AT1aR in AT1bR), ki so kodirani z različnimi geni, vendar z 95% -no aminokislinsko sekvenčno homologijo. Te podvrste receptorjev znano, da so različno lokaliziran in urejena, vendar imajo podobno afiniteto za angiotenzin II. Zaradi visoke homologijo aminokislinske sekvence med gerbil AT1aR in AT1bR, smo predpostavili enako afiniteto do AT1R podtipih za protitelesa AT1R uporabljene v tej študiji. Poleg tega so protitelesa, ki se uporabljajo za barvanje receptorje Ang II določi proizvajalec v miših, podganah in ljudeh. Zato, da se potrdi specifičnost teh protiteles v peščene, so profili iz parafinskih vgrajenih blokov normalno gerbil in človekovih nadledvične žleze obarvajo kot zgoraj (z izjemo, da obeh primarnih protiteles so bili popravljeni 1:50 v PBS) in vzorcih razširjenosti za angiotenzin II protitelesa receptorjev so preučevali. Nadledvične Študije distribucijska so pokazale, da je anti-AT1R protiteles pretežno obarvane adrenokortikalni celice v zona glomerulozni (obarvanje kapsule, ki obdaja žleze, so opazili tudi vaskularnih gladkih mišic (VSMC) in endotelijske celice) tako gerbil in človeških odsekov. anti-AT2R protiteles obarvajo sredici nadledvičnice celice in celice v zona glomerulozni v gerbil in prehrano nadledvične žleze (barvanjem VSMC in endotelijskih celic Ugotovljeno je bilo tudi z uporabo tega protitelesa). Ti rezultati se ujemajo z že poročali študij [20], in močna podobnost barvanje vzorcev v gerbil in človekovih nadledvične žleze podpirajo splošno uporabnost protiteles v gerbil tkivih.
Western Blot
po odprtju želodcev, polna debelina antralnih stenske vzorci so bili takoj zbrali, zamrznili v tekočem dušiku in shranili pri -70 ° C. Osebki smo homogenizirali na ledu (Polytron, PT-MR 2100, Kinematica, Švica) v pufru A (10% glicerola, 20 mM Tris-HCl pH 7,3, 100 mM NaCl, 2 mM fenilmetilsulfonil fluorid, 2 mM EDTA, 2 nM EGTA , 10 mM natrijevega ortovanadata, 10 ug /ml leupeptina in 10 ug /ml aprotinina) [21] in centrifugiramo pri 30000 g 30 minut pri 4 ° C. Pelete smo ponovno suspendirali v pufru B (1% NP-40 [Sigma-Aldrich, Stockholm, Švedska] v pufru A) in mešali pri 4 ° C 1 uro pred centrifugiranjem pri 30000 g 30 minut pri 4 ° C. Supernatante smo analizirali na vsebnost beljakovin z metodo Bradfordu [21] in shranimo pri -70 ° C, dokler nadaljnjo analizo. Vzorce smo razredčili v SDS pufru in segrevamo pri 70 ° C za 10 minut, preden se naloži na NuPAGE 10% BisTris gelu (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA). Eden od pasu je naložen z prestained standardi molekulske mase (SeeBlue ™, Invitrogen AB, Lidingo, Švedska), in celih lizatov celic iz PC-12 (za AT1R; sc-2250, Santa Cruz Biotech), HEP G2 (za AT2R; sc- 2227, santa Cruz Biotech) in HL60 (za mieloperoksidaze (MPO), so bile 12-354, Upstate Lake Placid, NY, ZDA) kot pozitivne kontrole. Polyvinyldifluoride membrane (Amersham, Buckinghamshire, UK) inkubiramo z poliklonskih zajec protiteles proti AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech), AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech) ali MPO (07-496, podeželju). Alkalno fosfatazo združeni kozji anti-rabbit protitelesa (sc-2007, Santa Cruz Biotech za protitelesa AT1R in AT2R in IgG 12-448, Upstate za protitelesa MPO) in CDP-Star substrat (Tropix, Bedford, MA, ZDA ) smo uporabili za identifikacijo imunološko proteinov s chemiluminescense. Slike so bile posnete z ohlajeno CCD kamero (LAS-1000, Fujifilm, Tokio, Japonska). In pol količinsko je bilo narejeno na podlagi primerjave vzorcev na pozitivne kontrole z uporabo programske opreme Gauge 3.3 (Fujifilm, Tokio, Japonska)
Mikroskopski morphometry
tkiva primerki iz antralnih stene so bile določene v Histofix (Histolab Products AB) in vgrajeni v parafin. Four-u
debele odseki so bili nameščeni na kodiranih steklenih ploščicah in rutinsko obarvali s hematoksilinom /eozinom (H &E). Stopnja sluznice infiltracijo mononuklearnih in polimorfonuklearnih levkocitov je bilo raziskano v svetlobnim mikroskopom. Plast, Propria bo ponavadi povečanje volumna zaradi dotoka vnetnih celic. Zato je bila relativna prostornina lamine proprie oceni morfometrije odraža infiltracijo obeh mononuklearnih in polimorfonuklearnih levkocitov. To je izvedel H.F.H. V svetlobnim mikroskopom, s 10 x 10-kvadratni mreži vstavljen v okular in x 25 objektiv. Metodi točka štetja [22], je gostota prostornina lamele proprie določena in je izražena v odstotkih sluznice (v tem primeru definirana kot območju med površino sluznice in dno žlez). Sluznice prostornina je tukaj opredeljen kot epitelijske plasti + lamine proprie. Infiltracija sluznice za polimorfonuklearnih levkocitov (PMN) je bila ocenjena z P.H. v svetlobnim mikroskopom, z 10 × 10-kvadratni mreži vstavi v okular, ki × 50 olje potopno objektiv (ni podatkov 1.4) in olje potopno vrh objektiv kondenzatorja (ni podatkov 1.4) na. PMN so bili opredeljeni kot grobo okroglih celic v lamine proprie s temno obarvanih multilobulated ali bilobulated jedru. določimo število PMN v kvadratni območju sluznico, kot je skupno število kvadratov nad lamina proprie; število PMN je izražena na 1 mm 2 lamine proprie. Štetje začel na dnu žlez in končala po oceni enega do sedem polnih redi na sluznici, zaradi česar je najmanj 0,077 mm 2lamina Propria analiziramo na oddelku. Sistematično vzorčenje z naključnim začetku je bila uporabljena za izbiro področja, ki bodo študirali v obeh analizah. niso bile vključene območja z limfnih foliklov.
Statistična analiza
Test Kruskal-Wallis in Mann-Whitney U-testne ocenil pomena v razlikah izražanja proteinov med upravljanje, TN2GF4 okuženi in SS1 okuženih skupine. Mann-Whitney U test oceniti pomen v razlikah v sluznice infiltracije vnetnih celic med TN2GF4 okuženih in SS1 okuženih peščene. Linearno razmerje med AT1R beljakovine in PMN in linearno razmerje med AT1R in ln (MPO) v antralnih sluznici, so bili testirani z Pearson korelacije. Vsi testi so bili dva repa in statistična značilnost je bila določena na p < 0,05. Vse statistične analize so bile izvedene s pomočjo SPSS, verzija 15.0 (SPSS Inc. Chicago, Illinois).
Rezultati
Lokalizacija AT1R in AT2R beljakovin
radioinkorporacijo na AT1R in AT2R proteinov smo opazili v vseh gerbil vzorci študiral, in ne pušča madežev je bila opažena v oddelkih za nadzor. Protitelo AT1R običajno povzročajo bolj izrazito madež kot protitelesa AT2R.
Več oddelkov tkiva tako korpusa in antruma, neodvisno od prisotnosti ali odsotnosti H. pylori
okužbe, razstavljena radioinkorporacijo za oba Ang II podtipi receptorjev (glej tabelo 1 za pregled rezultatov in sliki 1 za reprezentativne odseke. glej tudi dodatno datoteka 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 in 15 za slik v visoki ločljivosti). Tako so radioinkorporacijo tako za AT1R in AT2R najdemo v endotelijskih celicah plovil, ki se nahajajo v lamele proprie je submucosa (slika 1B) in muscularis Propria, kot tudi gladke mišične celice muscularis sluznice in muscularis proprie (Slika 1C in 1G) ter v nekaterih mezenhimskih celic, ki se nahajajo v lamele proprie in submucosa. je bilo omenjeno tudi šibka obarvanje obeh receptorjev, predvsem v bazalni del večine epitelnih celic. Razlikuje barvanje Notranji živčnih struktur ni bilo opaziti. Radioinkorporacijo le AT1R opazili v žilnih gladkih mišičnih celicah plovil v submucosa je muscularis proprie in korena tako korpusa in antralnih delih želodec (Slika 1A in 1G). Zanimivo je, da močna imunskim barvanjem za AT1R pojavil v podskupini celic, predvsem v spodnjem delu antralnih žlez. Te celice so pokazale izgled celične tipično endokrinega, to so zelo majhna, s celičnih telesih blizu bazalne membrane; ozek niz citoplazmi opazili v nekaterih primerih (slika 1G, 1H in 1i). Kot AT1R obarvanje ni bilo mogoče najti v endokrinih podobnih celic v oxyntic sluznici. Dvojna imunskim barvanjem za AT1R in za pan-endokrinega označevalec Chromogranin A [23] potrdila lokacijo AT1R v podskupini endokrinih celic v gerbil antralnih sluznici (slika 1 milijon in 1N) .table 1 Lokalizacija AT1R in AT2R beljakovin v želodcu stena mongolske gerbil
Tissue Predel

tip celic
AT1R

AT2R
sluznice
epitela
Najbolj epitelijskih celic
+ predvsem v bazalnih delih
+ predvsem v bazalni deli
mala epitelnih celic v spodnjem delu žlez
+++ v nekaterih endocrine podobne celice v antruma
no
Lamina Propria
žilja
+ v endotelija
+ v endotelija
živčne strukture
no
Ne
mezenhimske celice
++ v nekaterih celicah;
++ v levkocitov v H. pylori
okuženimi
+ v nekaterih celicah;
++ v levkocitov v H. pylori
okuženimi
Muscularis sluznice
gladke mišične celice
++
+
Submucosa
žilja
+ na endotelij,
++ v VSMC
+ v endotelija;
no v VSMC
živčnih struktur
ne
ni
mezenhimskih celic
++ v nekaterih celicah;
++ v levkocitov v H. pylori
okuženimi
+ v nekatere celice;
++ v levkocitov v H. pylori
okuženimi
Muscularis Propria
gladke mišične celice
++
+
žilja
+ v endotelija;
++ v VSMC
+ v endotelija;
ne v VSMC
živčne strukture
n.o.
n.o.
korena
žilje
n.o. V endotelija;
++ v VSMC
ne
no: ne opazi (ali nespecifični) radioinkorporacijo
+: šibka radioinkorporacijo vendar posamezni lokaciji
++: enostavno prepoznati radioinkorporacijo
+ ++: močan radioinkorporacijo
VSMC: žilne gladke mišične celice
Slika 1 dokazovanje imunohistokemičnim lokacijo AT1R in AT2R v želodcu mongolske gerbil. A-F prikazuje dele iz antralnih regiji SS1 okuženih gerbil za, 12 mesecev po okužbi. A) gladke mišične celice (VSMC) v arteriji, ki se nahaja v seroza madež pozitivnega za AT1R proteina (zelena barva). B) endotelne celice (konec) in neidentificirani mezenhimske celice (m), ki se nahajajo v submucosa prikazuje radioinkorporacijo za AT2R proteina. C) gladke mišične celice v mišično plast muscularis Propria madež pozitivnega za AT2R proteina. D) Negativna kontrola (ki sledijo oddelkov A) preabsorbirali z blokirnim peptida za protitelesa AT1R, ki prikazuje rumeno avtofluorescenco iz eritrocitov. E & F) negativne kontrole za protitelesa AT2R, ki sledi oddelkov v B & C oz. G, H kaže dele iz antralnih regiji kontrolne živali 6 mesecev po cepljenju in oddelkov (I), je iz-TN2GF4 okuženih gerbil, 12 mesecev po okužbi. Močan imunskim barvanjem za AT1R bilo ugotovljeno v celicah s tipičnim videzom endokrinih celic (e). Muscularis sluznice (mm), muscularis Propria (mp) in žilne gladke mišične celice (VSMC) tudi obarvamo pozitiven za AT1R. metoda A peroksidazo, ki temelji (rjave barve), je bila uporabljena za barvanje AT1R v G, H in imunofluorescenco (zelena barva) je bil uporabljen za barvanje AT1R v (I). J, K in L) Zaporedne sekcije iz antralnih regijo TN2GF4 okuženih gerbil, 6 mesecev po cepljenju. J) imunskim barvanjem za AT1R (zelena barva) prikazuje agregate levkocitov (levom) izražajo AT1R beljakovin. K) Negativna kontrola na odseku v J, ki prikazuje rumeno avtofluorescenco iz eritrocitov. L) Zaporedni oddelek za oddelkom v K, rutinsko obarvanih s H & E, ki potrjuje, da so agregati levkociti. M in N kaže dvojno imunskim barvanjem za AT1R (rjave barve v M) in za pan-endokrinega marker Chromogranin A (rdeče barve v N) izvedeni antralnih delu kontrolne živali. Bela puščica M in N točk na celico v osnovo za antralnih žleze, ki obarvajo pozitivna tako za AT1R in Chromogranin A. Nekaj ​​pozitivnih celic Chromogranin A niso immunopositive za AT1R. Oddelek O dokazuje nevtrofilcev (PMN) v antralnih sluznici SS1 okuženih gerbil za, 12 mesecev po cepljenju.
Intenzivnost in distribucijo radioinkorporacijo zgoraj opisanega ne zdi, da je drugačen od H. pylori
-negativno in H. pylori
okuženimi živalmi ali med živali žrtvovali na šest ali 12 mesecev po okužbi. Vendar pa je bilo ugotovljeno ena očitna razlika med H. pylori
-negativno in H. pylori
okuženimi živalmi: za razliko od neokuženih peščene podgane, odseki tako antruma in korpusa okuženih živali je pokazala obilo vnetnih celic v lamele proprie z radioinkorporacijo na obe AT1R in AT2R. V enem od TN2GF4 okuženih živalih, ki so žrtvovali v šestih mesecih, so agregati vnetnih celic kaže tudi v muscularis proprie (slika 1J, 1K in 1L). niso opazili očitne razlike v obarvanje vzorce ali intenzivnosti med živali, okuženih z TN2GF4 sev ali sev SS1 ali med živali žrtvovali na šest ali 12 mesecev po cepljenju.
Količinska AT1R in AT2R beljakovin in odnosu do vnetnih celic
Zaradi podobnega imunohistokemičnim videz angiotenzin II receptorjev v korpusa in antruma (z izjemo AT1R izraža subpopulacijo endokrinih celic omenjenih) na obeh šest do 12 mesecev, smo kvantitativne ocene omejen antralnih osebke po 12 mesecih po inokulaciji .
Obe AT1R in AT2R proteini so opredeljena v zahodni blot v vseh vzorcih (slika 2). Po 12 mesecih okužbe, je protein izraz AT1R v SS1 okuženih živali, bistveno višja kot v kontrolni skupini v tem času (slika 3). Ugotovljeno je bilo nobenih pomembnih razlik v AT2R proteinske ekspresije med različnimi skupinami peščene (ni prikazano). Slika 2 zgledno podobo Western-blot analiz. Top plošča: radioinkorporacijo proti AT1R na 41 kDa v PC-12 celic lizat (pozitivna kontrola) in antralnih vzorcih polno sten. Spodnja plošča: radioinkorporacijo proti AT2R kaže šibek pas na 44 kDa v Hep G2 (pozitivna kontrola) in pasovih v antralnih vzorcih polne stene
Slika 3 Boxplot prikazuje AT1R Protein izrazu 12 mesecev po okužbi v peščene okuženih s H. pylori. sevi TN2GF4 in SS1 in nadzora. Protein izraz AT1R je bila bistveno višja SS1 okuženih živalih, ki so v primerjavi s kontrolami (Kruskal-Wallis preskusa in preskusnih Mann-Whitney U). vsebnosti beljakovin so predstavljeni kot optične gostote (OD). Mediane vrednosti so označene s prečno črto v polje, interkvartilni razpon, ki ga je navpična razsežnost prostora in celotnega območja s strani brki.
Glede na to, da je H. pylori
okuženimi živali so pokazali obilo AT1R izražanje vnetne celice v svojem želodčne sluznice in povečano izražanje antralnih AT1R je bila opravljena kvantitativna analiza vnetnih celic v sluznici oceniti ali je navzgor regulacija AT1R proteina v SS1 okuženih peščene nanašajo na mukozno vnetnih celic.
stopnja sluznice infiltracijo obeh mononuklearnih in polimorfonuklearnih levkocitov (odbija od gostote prostornino lamine proprie) ni bilo razlik med SS1 okuženih in TN2GF4 okuženih peščene. Vendar pa je bila sluznice infiltracija polimorfonuklearnih levkocitov (PMN) v SS1 okuženih živalih, ki so bistveno višje kot v TN2GF4 okuženih živali, 12 mesecev po okužbi (tabela 2). The PMN in v H. pylori
okuženimi sluznice sestavljena skoraj izključno iz nevtrofilcev (Slika 1 °); nekaj eozinofilni in ne bazofilična celice je mogoče opredeliti le v kvantitativne analize microscope.Table 2 vnetnih celic v gerbil antralnih sluznici po 12 mesecih z bakterijo Helicobacter pylori
okužbe

nadzor
TN2GF4
SS1
sluznice infiltracijo mononuklearnih in polimorfonuklearnih levkocitov (odraža gostoto prostornine (%) od lamine proprie)
26,7 ± 2,4
47,1 ± 2,2
41,3 ± 2,4
sluznice infiltracija polimorfonuklearnih levkocitov (PMN /mm2 lamina Propria)
198 ± 37
1892 ± 169
4166 ± 275 * *
Vrednosti so srednja vrednost ± standardna napaka povprečja
** p <., 0,01, SS1 primerjavi TN2GF4. Mann-Whitney U test
linearna povezanost (r = 0,75, p < 0,01) opazili med izrazu AT1R beljakovin v antruma in števila polimorfonuklearnih levkocitov v antralnih sluznice po 12 mesecih H. pylori
okužba (slika 4). To razmerje je podprta z logaritemsko korelacije med antralnih izražanja AT1R in izražanja mieloperoksidaze (r = 0,58, p < 0,05) (slika 5). Mieloperoksidaze (MPO) je encim, ki je obilno izražena v nevtrofilcev in v manjši meri v monocitov in nekaterih vrst makrofagov [24]. Zato ravni tkiv MPO služil kot proteinskih označevalcev nevtrofilcev infiltracijo v tej študiji. Če je napačnih vrednosti vrednost označena s trikotnikom v sliki 5 izključeni iz analize (ni prikazano v ločenem sliki) je razmerje med AT1R in MPO postane občutno močnejši (r = 0,86 in p < 0,01). Slika 4 Razmerje med AT1R izražanja v antruma in število polymorphnuclear levkocitov (PMN) v antralnih sluznice po 12 mesecih okužbe s H. pylori.
Slika 5 Razmerje med AT1R izražanja in mieloperoksidaze (MPO) izražanja v antralnih sluznice po 12 mesecev okužbe s H. pylori. Če je napačnih vrednosti vrednost označena s trikotnikom izključeni iz analize (ni prikazan) razmerje med AT1R in MPO postane občutno močnejša (r = 0,86 in p < 0,01).
Razprava
tej študiji raziskovali osnovo prisotnost in lokacijo angiotenzin II receptorjev v antralnih in telesno steno mongolske gerbil in dokazali, da so AT1R in AT2R izražena z različnimi celicami. Ugotovitev posebnega pomena je, da je podskupina endokrinih celic v antralnih sluznice, je pokazala izrazito izraz AT1R. Veljavnost imunohistokemičnim postopku, uporabljenem v tej študiji je bila potrjena na različne načine. Protitelesa receptorske Ang II so bile ugotovljene z uporabo dveh različnih tehnik in specifičnost primarnih protiteles, ki se uporabljajo tako za zahodno s sušenjem in imunohistokemijo smo preverili s primerjavo vzorcev obarvanja gerbil s tistimi, nadledvične žleze ljudi in jih preabsorption z blokado peptid ( AT1R).
Povsod porazdelitev receptorjev Ang II v želodcu tu poročali v soglasju s tem, kar je bilo že prej poročali v debelem črevesu [7]. Avtoradiografija podganjih želodec je prav tako pokazala, da AT1R, in majhno število AT2R, so prisotni v vseh plasteh želodcu [4]. Vendar pa je natančna lokacija AT1R in AT2R v želodcu je še le bilo redko raziskati. Matsuo et al
. Rabljeni imunohistokemija najti AT1R v človeški antruma in je na voljo v žilnih gladkih mišičnih celic (VSMC), mezenhimskih celic in gladkih mišičnih celic v mišične plasti sluznice in muscularis proprie [25]. Poleg tega Bregonzio et al
.

• Okužba s Helicobacter pylori povzroča raka na želodcu; napredek na področju raziskav želodca izvornih celic in preostalih izzivov
• Ocenjevanje in klinični pomen starostne modelu želodca za ocenjevanje staranje želodcu-a multicentrični študiji na Kitajskem