Angiotensine II receptor expressie en relatie met Helicobacter pylori-infectie in de maag van de Mongoolse gerbil

Angiotensine II receptor expressie en relatie tot Helicobacter pylori
-infection in de maag van de Mongoolse gerbil
Abstract achtergrond
De rol van het renine-angiotensine systeem in de maag fysiologie en ziekte is nog spaarzaam geweest onderzocht. Het eerste doel van de studie was de basislijn opsporen en lokaliseren van angiotensine II receptoren (AT1R en AT2R) in de maag van de Mongoolse gerbil onderzoeken. Een tweede doel was om te onderzoeken of de aanwezigheid van H. pylori
infectie wordt geassocieerd met veranderingen in de expressie van deze receptoren.
Methods
H. pylori
-negatieve en H. pylori
besmet (stam SS1 of TN2GF4) mannelijke Mongoolse gerbils werden onderzocht. De magen werden bij zes of 12 maanden na inoculatie onderzocht met behulp van immunohistochemie, Western blot en microscopische morfometrie.
Resultaten
AT1R en AT2R waren in verschillende cellen in de maagwand gerbil, waaronder een subpopulatie van endocriene cellen in de antrale slijmvlies en ontstekingscellen infiltreren H. pylori
geïnfecteerde magen. Gerbils geïnfecteerd met de stam SS1 een significant verhoogde antrale AT1R eiwitexpressie en een groter aantal infiltrerende polymorfonucleaire leukocyten (PMNs) en 12 maanden. De AT1R eiwitexpressie gecorreleerd met het aantal PMN's en de antrale expressie van myeloperoxidase.
Conclusies
angiotensine II-receptoren aanwezig op verschillende cellen in de maagwand van de Mongoolse gerbil. De resultaten geven invloed afhankelijk van de H. pylori
belasting van de maag AT1R expressie en een relatie tussen de maag AT1R expressie en mucosale PMN infiltratie. Achtergrond
de rol van het renine-angiotensinesysteem (RAS) gastrische fysiologie en ziekte nog is spaarzaam onderzocht. Sommige studies hebben werkingen van angiotensine II (Ang II) mucosale doorbloeding, zuursecretie en gladde spiercontractie [1-3] gerapporteerd. Anderen hebben de invloed van RAS in stress-geïnduceerde maag letsel en ischemie /reperfusie beschadiging van het maagslijmvlies betrokken [4, 5]. Ondernemingen De klassieke endocriene karakter van RAS staat bekend om zijn effecten op hemodynamische regelgeving en lichaamsvloeistof homeostase. Minder bekend is over de impact van de regelgeving van het weefsel op basis van lokale RAS, dat is aangetoond in een aantal organen, bijv. hersenen, pancreas, slokdarm en colon [6-8]. Interstitiële productie van Ang II kan optreden na lokale productie van angiotensinogeen (AGT), ACE en renine, of via alternatieve routes waaronder splitsing van circulerende AGT andere plaatselijk uitgedrukt enzymen, zoals cathepsine D en chymase [9]. Ang II werkt voornamelijk via twee receptoren, aangeduid met Ang II type 1 receptor (AT1R) en Ang II type 2 receptor (AT2R). Bijgevolg kaart brengen van de expressie en locatie van Ang II receptoren van groot belang onderzoeken potentiële Ang II signaaltransductie in verschillende fysiologische en pathologische instellingen. De laatste jaren RAS Aangetoond is betrokken bij verscheidene pathologische aandoeningen zoals ontsteking, wondheling en carcinogenese [10, 11]. Epidemiologische onderzoeken hebben associaties aangetoond tussen RAS verwante gen polymorfismen (SNPs) en de ontwikkeling van maagzweren en maagkanker [12, 13]. Echter, associaties tussen weefsel expressie van Ang II receptoren en Helicobacter pylori
infectie zijn niet gemeld. Het potentieel van RAS lokale ontstekingsreacties moduleren is het van belang het verband met de welbepaalde gastritis opgeroepen door H. pylori
onderzoeken.
In het onderhavige onderzoek onderzochten we de expressie van Ang II receptoren in de geïnfecteerde en H. pylori
geïnfecteerde Mongoolse gerbil. Dit diermodel is interessant omdat het gemakkelijk kan worden besmet met H. pylori
, waardoor een chronische ontsteking actieve pathologische veranderingen meeste laesies gevonden bij de mens, waaronder maagzweren, maag- intestinale metaplasie en maag nabootsen kankerachtige foto [14]. Of H. pylori
infectie alleen veroorzaakt maagkanker in Mongoolse woestijnratten blijft onder debat [15].
Een eerste doel van de studie was om de basislijn aanwezigheid en de locatie van de AT1R en AT2R in de maag van de onderzoeken Mongoolse gerbil. Een tweede doel was om te onderzoeken of de aanwezigheid van H. pylori
infectie wordt geassocieerd met veranderingen in de expressie van deze receptoren.
Methods
Dieren
De experimenten van Experimenten werden goedgekeurd door de ethische commissie Dieren, Universiteit van Göteborg. Dertig specifieke pathogeenvrije (SPF) mannelijke Mongoolse gerbils (Charles River, Uppsala, Zweden), zeven weken oud, werden gebruikt. Zij werden willekeurig verdeeld in drie groepen van gelijke grootte, bestaande uit een controle groep en twee groepen die worden besmet met H. pylori
waren. Vijf dieren werden per kooi gehouden en de kamer werd geregeld met betrekking tot de temperatuur (18-22 ° C), vochtigheid (ongeveer 55%) en licht /donkercyclus (12 /12h). De gerbils hadden vrije toegang tot voedsel (2016F, Harlan Tek. Lab, Sleedoorn, Engeland) en drinkwater. Ze waren een week van acclimatisatie toegestaan ​​voor de inenting.
Bacteriële stammen en inenting
Twee verschillende H. pylori
stammen werden gebruikt voor de inenting, de TN2GF4 stam [16] en de Sydney stam 1 (SS1) [ ,,,0],17]. Beide stammen is bekend dat een chronische actieve ontsteking in het maag gerbil antrale en lichamelijke mucosa veroorzaken. De bacteriën werden gegroeid op Columbia platen. Deze kweken werden daarna gebruikt voor het enten van 500 ml Brucella bouillon met 5% pasgeboren kalfsserum, 10 ug /ml vancomycine en 5 ug /ml trimethoprim. De kolven werden gedurende 24 uur onder micro- aërobe omstandigheden bij 37 ° C. De bacteriën werden onderzocht door fasecontrast microscopie voordat zij aan de dieren toegediend. De gerbils werden geïnfecteerd met 0,5 ml van de bacteriële schorsing of Brucella bouillon alleen (controles) met behulp van een voeding naald. Levensvatbare tellingen werden gemaakt in de suspensie om de werkelijke besmettelijke doses, die waren te bepalen 7 × 10 7 eenheden en 4 × 10 7 eenheden voor de SS1 en TN2GF4, respectievelijk.
Tijdsverloop en offeren
na een 24-uurs periode van vasten met vrije toegang tot drinkwater, werden vijf dieren uit elke groep zes of 12 maanden na de inenting opgeofferd. De dieren werden verdoofd door intraperitoneale injectie van medetomodin (0,5 mg /kg) en ketamine (75 mg /kg). Een middellijn laparotomie werd uitgevoerd en de magen werden vervolgens verwijderd en geopend langs de grote kromming. Eén helft werd gebruikt voor de kweek, en monsters werden verzameld uit de andere helft voor histologische analyse en Western blotanalyse. De dieren werden gedood door cardiale incisie. Histopathologische bevindingen en bacteriologische toestand werden eerder gerapporteerd [14].
Immunohistochemie
De volledige muur monsters (antrum en corpus) werden onmiddellijk opgevangen na de opening van de magen in Histofix (Histolab producten AB, Göteborg, Zweden vast ) bij kamertemperatuur (KT) gedurende de nacht en daarna gespoeld in PBS gedurende 24 uur. Monsters werden vervolgens gedehydrateerd, ingebed in paraffine, gesneden in 5-μ
dikke secties en gemonteerd op glasplaatjes. Voordat immunohistocemical kleuring werden secties van paraffine ontdaan en gekookt in citroenzuur buffer (0,01 M, pH 6,0, 10 min). De Immunocruz TM Staining System (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) werd gebruikt voor de immunohistochemie protocol. Na remming van endogene peroxidase activiteit werd niet-specifieke binding van secundaire antilichamen geblokkeerd door incubatie met normaal geitenserum gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De volgende twee polyklonale primaire antilichamen, verdunningen en incubatietijden werden vervolgens gebruikt: konijn anti-AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech, 1: 100 in PBS, 2 uur bij KT) en konijn anti-AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech, 1: 100 in PBS, 2 uur bij KT). Na incubatie met primaire antilichamen, secties driemaal in PBS werden gewassen en gesondeerd met een gebiotinyleerd secundair antilichaam; het complex werd gedetecteerd onder gebruikmaking mierikswortel peroxidase (HRP) -streptavidin en de kleur werd ontwikkeld met 3,3'-diaminobenzidine (DAB).
een onverwacht sterke kleuring van cellen met een typische uiterlijk van endocrine cellen werd waargenomen na immunohistochemische kleuring deze peroxidase gebaseerde methode. Immunoflourescens labeling werd gedaan om verder uit te sluiten dat deze kleuring was een gevolg van endogeen biotine, van endogene peroxidase activiteit of van onspecifieke binding van het tweede antilichaam. Het volgende protocol werd gebruikt: na koken in citroenzuur buffer, werd niet-specifieke binding van secundaire antilichamen geblokkeerd door incubatie met normaal geitenserum (sc-2043, Santa Cruz Biotech) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Secties werden geïncubeerd met primaire antilichamen zoals hierboven. De objectglaasjes werden vervolgens drie keer gewassen in PBS en afgetast met een secundair antilichaam Alexa Flour 488 geconjugeerd geit anti-konijn IgG (A-11034, Molecular Probes Inc, Eugene, OR, USA), verdund 1: 400 in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De objectglaasjes werden vervolgens drie keer gewassen in PBS en gemonteerd fluorescentie montage medium (DakoCytomation, Glostrup, Denemarken), waarna beelden werden opgenomen met een fluorescentiemicroscoop. Om de locatie van AT1R in endocriene cellen te bevestigen, werd een dubbele immunokleuring uitgevoerd volgens de hierboven beschreven peroxidase gebaseerd protocol voor AT1R en de hierboven beschreven immunoflorescens labeling protocol voor een primair antilichaam tegen Chromogranine A (C-20, Santa Cruz Biotech, 1: 100 in PBS, 2 uur bij KT). Niet specifieke binding van het secundaire antilichaam (Alexa Flour 568-geconjugeerd ezel anti-geit IgG, A-11057, Molecular Probes Inc., 1: 800 in PBS, 1 uur bij kamertemperatuur) werd geblokkeerd door incubatie met normale ezel serum (sc-2044 , Santa Cruz Biotech). Preabsorpion met een overmaat (5 x) het blokkeren van peptide (sc-1173P, Santa Cruz Biotech) werd uitgevoerd als een controle voor de specificiteit van de AT1R antilichaam, terwijl het primaire antilichaam was weggelaten voor de AT2R. Ondernemingen De gerbil AT1R en AT2R hebben > 90% aminozuur homologie-identiteit met humane, rat en muis Ang II receptoren [18, 19]. In gerbils, ratten en muizen, zijn er twee subtypen AT1R (AT1aR en AT1bR) die worden gecodeerd door verschillende genen maar met 95% aminozuursequentiehomologie. Deze receptorsubtypen bekend dat differentieel gelokaliseerd en geregeld maar een vergelijkbare affiniteit voor Ang II. Vanwege de hoge aminozuursequentie homologie tussen de gerbil AT1aR en AT1bR, veronderstelden dat we gelijk bindingsaffiniteit voor de AT1R subtypen van de AT1R antilichaam dat bij deze studie. Bovendien, de voor kleuring Ang II receptoren antilichamen die door de fabrikant bij muizen, ratten en mensen. Daarom, om de specificiteit van deze antilichamen in woestijnratten bevestigen, werden coupes van in paraffine ingebedde blokken van normale woestijnrat en de mens bijnieren gekleurd zoals hierboven (behalve dat de primaire antilichamen werden verdund 1:50 in PBS) en verspreidingspatroon voor Ang II receptor antilichamen werden onderzocht. De adrenale Onderzoeken toonden aan dat de anti-AT1R antilichaamdiversiteit hoofdzakelijk lood adrenale corticale cellen in de zona glomerulosa (kleuring van de capsule rond de klier, vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) en endotheelcellen werd ook opgemerkt) zowel woestijnrat en de mens secties. De anti-AT2R antilichaam gekleurde bijniermerg en cellen in de zona glomerulosa in woestijnrat en humane bijnier (kleuring van VSMC's en endotheliale cellen werd ook opgemerkt met deze antilichamen). Deze resultaten komen overeen met de eerder gerapporteerde studies [20], en de sterke gelijkenis van de kleurpatronen in de gerbil en de menselijke bijnier te ondersteunen een algemene nut van de antilichamen in woestijnrat weefsels.
Western Blot
Na het openen van de magen, volledige dikte antrale wand monsters werden onmiddellijk opgevangen, bevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -70 ° C. De monsters werden gehomogeniseerd op ijs (Polytron PT-MR 2100, Kinematica, Zwitserland) in buffer A (10% glycerol, 20 mM Tris-HCl pH 7,3, 100 mM NaCl, 2 mM fenylmethylsulfonylfluoride, 2 mM EDTA, 2 nM EGTA , 10 mM natriumorthovanadaat, 10 ug /ml leupeptine en 10 ug /ml aprotinine) [21] en gecentrifugeerd bij 30.000 g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. De pellets werden geresuspendeerd in buffer B (1% NP-40 [Sigma-Aldrich, Stockholm, Zweden] in buffer A) en 1 uur vóór centrifugatie geroerd bij 4 ° C bij 30.000 g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. De supernatanten werden eiwitgehalte geanalyseerd met de werkwijze van Bradford [21] en opgeslagen bij -70 ° C tot verdere analyse. Monsters werden verdund in SDS buffer en verwarmd op 70 ° C gedurende 10 minuten voordat een 10% NuPage BisTris gel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) geladen. Een rijstrook was geladen met voorgekleurde gewicht normen moleculaire (SeeBlue ™, Invitrogen AB, Lidingo, Zweden), en gehele cellysaten van PC-12 (voor AT1R; sc-2250, Santa Cruz Biotech), HEP G2 (voor AT2R; SC 2227, Santa Cruz Biotech) en HL60 (voor myeloperoxidase (MPO), 12-354, Upstate Lake Placid, NY, USA) werden gebruikt als positieve controles. Polyvinyldifluoride membranen (Amersham, Buckinghamshire, UK) werden met polyklonale konijnen antilichamen gericht tegen AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech), AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech) of MPO (07-496, Upstate). Een alkalische fosfatase geconjugeerd geit anti-konijn antilichaam (sc-2007, Santa Cruz Biotech voor de AT1R en AT2R antilichamen en IgG 12-448, Upstate, voor de MPO antilichaam) en CDP-Star substraat (Tropix, Bedford, MA, Verenigde Staten ) gebruikt om immunoreactieve proteïnen te identificeren door chemiluminescense. Beelden werden vastgelegd met een gekoelde CCD camera (LAS-1000, Fujifilm, Tokyo, Japan). Semi kwantificatie werd uitgevoerd door vergelijking van monsters positieve controles met de chronometer 3,3 software (Fujifilm, Tokyo, Japan)
Microscopische morfometrie
weefselmonsters uit de antrale muur zijn vastgesteld in Histofix (Histolab Products AB) en ingebed in paraffine. Vier
μ dikke secties werden aangebracht op glazen objectglaasjes gecodeerd en routinematig gekleurd met hematoxyline /eosine (H &E). De mate van mucosale infiltratie van mononucleaire en polymorfonucleaire leukocyten werd onderzocht in het licht microscoop. De lamina propria de neiging om in volume toenemen als gevolg van de instroom van inflammatoire cellen. Daarom is het relatieve volume van de lamina propria werd bepaald door morfometrie de infiltratie van zowel mononucleaire en polymorfonucleaire leukocyten weerspiegelen. Dit werd uitgevoerd door H.F.H. uitgevoerd in een lichtmicroscoop met een 10 x 10-vierkant rooster ingebracht in het oculair en een 25 x objectief. Met de puntentelling methode [22], de volumedichtheid van de lamina propria werd bepaald en uitgedrukt in procenten van de mucosa (hier gedefinieerd als het gebied tussen het mucosale oppervlak en de bodem van de klieren). Mucosale volume wordt hier gedefinieerd als epitheellaag + lamina propria. De mucosale infiltratie van polymorfonucleaire leukocyten (PMN's) werd bepaald door P.H. in een lichtmicroscoop, met een 10 x 10-vierkant rooster ingebracht in het oculair, een x 50 olie-immersie objectief (N.A. 1.4) en een olie-immersie top lens van de condensor (N.A. 1.4). PMN's werden geïdentificeerd als ruwweg round cellen in lamina propria met een donkergekleurde multilobulated of bilobulated kern. Het aantal PMN in een vierkant gebied van de mucosa werd bepaald als het totale aantal velden in de lamina propria was; het aantal PMN's wordt uitgedrukt per 1 mm 2 lamina propria. Het tellen gestart vanaf de bodem van de klieren en eindigde na beoordeling van 06:59 vol banen van het slijmvlies, waardoor ten minste 0,077 mm 2lamina propria onderzocht per groep. Systematische bemonstering met een willekeurige start werd gebruikt voor de selectie van de gebieden die moeten worden onderzocht in beide analyses. Gebieden met lymfoïde follikels werden niet opgenomen.
Statistische analyse
De Kruskal-Wallis test en de Mann-Whitney U-proef geëvalueerd betekenis in de verschillen in eiwitexpressie tussen de controle, de TN2GF4-geïnfecteerde en de SS1-geïnfecteerde groepen. De Mann-Whitney U test geëvalueerd significantie in de verschillen in mucosale infiltratie van ontstekingscellen tussen de TN2GF4-geïnfecteerde en geïnfecteerde SS1 gerbils. Een lineair verband tussen AT1R-eiwit en PMN's, en een lineair verband tussen AT1R en ln (MPO) in de antrale mucosa werden getest met Pearson correlatie. Alle tests werden tweezijdige, en statistische significantie werd vastgesteld op p < 0,05. Alle statistische analyses werden
met behulp van SPSS, versie 15.0 (SPSS Inc. Chicago, Illinois) worden uitgevoerd. Resultaten
lokalisatie van AT1R en AT2R eiwit
Immunoreactiviteit de AT1R en de AT2R eiwitten werd waargenomen in alle woestijnrat specimens bestudeerd en geen kleuring werd waargenomen in controlesecties. De AT1R antilichaam induceerde algemeen een duidelijker kleuring dan de AT2R antilichaam.
Verschillende weefselcompartimenten zowel het corpus en antrum, onafhankelijk van de aanwezigheid of afwezigheid van H. pylori
infectie vertoonden immunoreactiviteit voor beide Ang II receptorsubtypen (zie tabel 1 voor een overzicht van de resultaten en Figuur 1 voor representatieve secties. Zie ook aanvullende bestand 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 en 15 voor hoge resolutie beelden). Aldus immunoreactiviteit voor zowel de AT1R de AT2R gevonden in endotheelcellen van de vaten in de lamina propria, de submucosa (Figuur 1B) en de muscularis propria, en in gladde spiercellen van de muscularis mucosae en muscularis propria (fig 1C en 1G) en in sommige mesenchymale cellen in de lamina propria en submucosa. Zwakke kleuring van beide receptoren werd ook opgemerkt, vooral in het basale deel van de meeste epitheelcellen. Duidelijke kleuring van intramurale neurale structuren werd niet waargenomen. Immunoreactiviteit alleen AT1R werd waargenomen in de vasculaire gladde spiercellen van vaten in de submucosa, muscularis propria de serosa en zowel het corpus en antrale delen van de maag (figuur 1A en 1G). Interessant is dat een sterke immunokleuring voor AT1R verscheen in een subset van cellen voornamelijk in de basis van de antrale klieren. Deze cellen vertoonden een typisch endocrine cel uiterlijk, dat wil zeggen, ze waren heel klein, met de cel lichamen in de buurt van het basaal membraan; een smalle reeks cytoplasma werd waargenomen in sommige gevallen (figuur 1G, 1H en 1I). Dergelijke AT1R kleuring kon niet worden gevonden in endocriene-achtige cellen in de oxyntic slijmvlies. Dubbele immunokleuring voor AT1R en voor de pan-endocriene marker Chromogranin A [23] bevestigde de locatie van AT1R in een subpopulatie van endocriene cellen in de gerbil antrale slijmvlies (figuur 1 M en 1N) .table 1 lokalisatie van AT1R en AT2R eiwit in de maag wand van de Mongoolse gerbil
Tissue compartiment

celtype
AT1R

AT2R
slijmvlies
Epithelium
meeste epitheelcellen
+ voornamelijk in basale onderdelen

• Helicobacter pylori-infectie geïnduceerde maagkanker; vooruitgang in de maag stamcelonderzoek en de resterende challenges
• Evaluatie en klinische betekenis van de maag leeftijd model voor het evalueren van de vergrijzing van de maag-een multicenter studie in China